Name: A Lectin HPLC-Methode zur selektiven glykosylierte Peptide aus komplexen biologischen Proben Enrich (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-10-01T21:00:00.000+00:00
Duration: 20 min 23 s
Description: Lernen Sie eine Lectin-HPLC-Methode zur Anreicherung glykosylierter Peptide aus menschlichem Plasma. Diese Technik nutzt Lectin-POROS-Beads und ermöglicht Biomarker-Entdeckung in der Proteomik.

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Diese Arbeit wurde von der Clinical Proteomics Technologies for Cancer Initiative 5U24CA126477-04 unterstützt.

1) Bereiten Lektin-konjugierten POROS Spalten <ol><li> Setzen Sie auf eine Maske, um gegen das Einatmen von Poros-AL Perlen im Schritt 1.1 schützen - 1,2. Wiegen Sie die gewünschte Menge POROS Perlen (100 mg beads/300 ul Endvolumen) und Transfer in ein sauberes Eppendorf-Röhrchen. </li><li> Wash-Kügelchen mit Zugabe von 1 ml Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS). Pellet Beads durch Zentrifugation in einer Mikrozentrifuge bei maximaler Geschwindigkeit für 3 Minuten. Überstand entfernen und wiederholen Sie die Wäsche. </li><li> Wiegen Sie die gewünschte Menge an konjugierten Lektin (1 bis 4 mg / 200 ul Perlen) und in ein sauberes Eppendorf-Röhrchen. Add PBS zu einem 5 - 20 mg / ml Lösung. Reserve von 25 ul dieser Lösung. </li><li> Übertragen Sie die verbleibenden Lektin-Lösung, die POROS Perlen. Add Natriumcyanoborhydrid zu einer Endkonzentration von 50 mM. Das Röhrchen wird auf einer Wippe und reagieren bei Raumtemperatur über Nacht. (Hinweis:. Natriumcyanoborhydrid ist giftig und muss in einem Abzug gehandhabt werden kontaminierte Abfälle müssen entsprechend entsorgt werden.) </li><li> Pellet der POROS Perlen wie in Schritt 1.2. Überstand entfernen und speichern wie die post-Konjugation Lösung. </li><li> Wash Beads mit 1 ml Quenching Buffer (1 M Tris-Cl, pH 7,4). Pellet Perlen wie in Schritt 1,2 und sicher Überstand verwerfen. </li><li> Blockieren Sie die verbleibenden reaktiven Stellen auf der POROS Beads mit 1 ml Quenching Buffer. Add Natriumcyanoborhydrid zu einer Endkonzentration von 50 mM. Das Röhrchen wird auf einer Wippe und Inkubieren bei Raumtemperatur für 30 min. </li><li> Pellet Perlen wie in Schritt 1,2 und Überstand verwerfen. </li><li> Wash Perlen mit 1 mL 1 M NaCl. Pellet Perlen und Überstand verwerfen. Wiederholen Sie die vier Mal für insgesamt fünf Wäschen. Die Perlen sind nun bereit zu packen. </li><li> Zur Bestimmung der Menge an Protein, konjugiert mit dem POROS Perlen wurde, führen Sie eine Proteinkonzentration Assay auf der Pre-und Post-konjugierten konjugierte Lektin-Lösungen. Der Unterschied in der Konzentration ist die Menge an Protein, konjugiert mit den Perlen wurde. Die Menge an Protein konjugiert pro Perle Volumen entspricht der Konzentration von Lektin auf der Perlenschnur. Ziel Lektin-Konzentrationen liegen zwischen 2 -20 mg / mL. </li></ol> 2) Verpackung das Lektin-konjugierten POROS Perlen in einen PEEK Spalte <ol><li> Montieren Sie die Verpackung (Beschreibung folgt) und unterstützen sie auf einem Metallring stand. Die Verpackung besteht aus, von unten nach oben, Druck Drossel, Endspalte Koppler 1, Fritte, Spalte (2 x 50 mm), Endspalte Koppler 2, Spalte Stecker, Endspalte Koppler 3, Spalte (4,5 x 50 mm), Endspalte Koppler 4 und Endstück. Die obere Spalte dient als Reservoir für das Verpackungsmaterial. </li><li> Resuspendieren POROS Perlen in der gewünschten Volumen von Puffer A (10 mM Tris-Puffer, pH 7,4, 150 mM Natriumchlorid, 10 mM Calciumchlorid, 10 mM Magnesiumchlorid). Wenn Verpackung eine Spalte (~ 200 ul Bettvolumen), in 400 ul Puffer A resuspendiert </li><li> Transfer-konjugierten POROS Perlen in der oberen Spalte (Stausee). Add Buffer A in das Reservoir, bis der Puffer erreicht die Spitze der Säule. Sanft statt der Endarmatur auf den Kopf der Kolonne und versuchten, um Luftblasen in der Säule zu vermeiden. Schließen Sie das Endstück der oberen Spalte, um die HPLC-System. </li><li> Packen Sie die Spalte durch fließende Puffer A durch das System. Beginnen Sie mit einer Flussrate von 0,5 mL / min. Erhöhen Sie die Durchflussmenge von 0,5 ml / min pro Minute, bis entweder 4 mL / min oder der maximale Druck (3000 psi) erreicht ist. Weiter mit der maximal möglichen Durchsatz, bis mindestens 35 ml Puffer A durch die Säule passiert haben. </li><li> Schalten Sie die Pumpen und damit den Druck auf die Spalte auf &lt;20 psi fallen. </li><li> Sanft, zerlegen die Verpackungsanlage, von oben beginnend. Wenn das Ende Spalte Koppler 2 erreicht ist, sorgfältig zu entfernen. Einige verpackt Material sollte von der Spitze der Säule werden Extrudieren. Mit einer Rasierklinge oder ähnlichem scharfe Kante, wischen weg das Extrudieren Perlen, so dass ein Wulst Oberfläche, die sogar mit dem oberen Ende der Säule. Üben Sie keinen Druck auf die Perlen, während dies zu tun. </li><li> Lösen Sie die gepackte Säule aus dem Ring zu stehen. Legen Sie eine neue Fritte in ein neues Ende Koppler und drehen Sie die gepackte Säule über, dies mit der Fritte / Ende Koppler auf dem offenen (ehemals top) Spalte Ende zu verbinden. </li><li> Beschriften Sie die Spalte entsprechend. Es ist jetzt einsatzbereit. Bei Nichtgebrauch kann die Säule in PBS mit 0,02% Natriumazid bei 4 ° C gelagert werden für bis zu 6 Monaten. </li></ol> 3) Programm der HPLC-Methode <ol><li> Die Details der Programmierung Ihrer HPLC wird nach den Besonderheiten der Software des Herstellers variieren. Wir verwenden eine Michrom Paradigm MG4 HPLC. Auf dieser Maschine werden Methoden gebaut und erreicht unter der Registerkarte &quot;Setup&quot; an der Spitze des Bildschirms. Programmieren Sie die folgende Methode: <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> Zeit </td><td> Durchfluss (ul / min) </td><td> % A </td><td> % B </td></tr><tr><td> 00.00 </td><td> 50 </td><td> 100 </td><td> 0 </td></tr><tr><td> 09.00 </td><td> 50 </td><td> 100 </td><td> 0 </td></tr><tr><td> 09.01 </td><td> 500 </td><td> 0 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> 13.50 </td><td> 500 </td><td> 0 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> 13.51 </td><td> 3000 </td><td> 100 </td><td> 0 </td></tr><tr><td> 19.50 </td><td> 3000 </td><td> 100 </td><td> 0 </td></tr></tbody></table> Puffer A: 10 mM Tris-Puffer, pH 7,4, 150 mM Natriumchlorid, 10 mM Calciumchlorid, 10 mM Magnesiumchlorid Puffer B: 0,5 M Essigsäure Der UV-Detektor sollte so programmiert, dass bei 280 nm von 0.00 bis 19.50 Uhr gelesen werden. Die y-Achse sollte so eingestellt werden low-Absorption Ebenen, z. B. 0 erkannt werden -. 50 AU. </li><li> Wenn ein Autosampler zur Verfügung steht, Programm die folgenden Zeitplan für Fraktionssammlung. Ansonsten sammelt die Fraktionen von Hand wie bei der Durchführung von Chromatographie. <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> Bruchteil </td><td> Verzögerung, die Sammlung aus Probenaufgabe </td><td> Dauer der Erhebung (min) </td></tr><tr><td> Durchfluss- </td><td> 2,8 </td><td> 4,1 </td></tr><tr><td> Gebunden </td><td> 9 </td><td> 2,6 </td></tr></tbody></table></li></ol> 4) Bereiten Sie Proben für HPLC <ol><li> Vor diesem Protokoll verwenden, sollte Humanplasma der 14-reiche Proteine ​​mit einem MARS Spalte (; Santa Clara, CA Agilent) aufgebraucht sein werden. Abgereichertes Plasma, Lactoferrin und Hefeinvertase sollte individuell sein trypsinverdauten und entsalzt wie zuvor 1 beschrieben. </li><li> Zur Vorbereitung des Lektin-spezifischen Lactoferrin Standard, führen Chromatographie an 50 ug trypsinverdauten Lactoferrin entweder über die AAL oder die SNA Spalte mit der Methode in Teil 3. Die gebundene Fraktion enthält Lektin-spezifischen Lactoferrin Glykopeptide. Neutralisieren Sie die Proben wie in Teil 4.4 und entsalzen als in Teil 6. Resuspendieren der Probe in 1 ml Puffer A. Die resultierende Probe ist einsatzbereit. </li><li> Drei experimentelle Wiederholungen durchgeführt. Zur Vorbereitung Probe für drei Wiederholungen, addiere 3 pmol trypsinverdauten Invertase und 1 ul Lektin-spezifischen Lactoferrin (entweder AAL-LAK oder SNA-LAC) auf 30 ul MARS-abgereicherten, trypsinverdauten, Plasma-Äquivalente (PE). Ein PE ist als das Volumen der non-processed/intact/original Plasma, aus dem eine bestimmte Menge an verarbeiteten Plasmas (MARS-abgereicherte und Trypsin) abgeleitet wurde, definiert. Add Buffer A auf die Probe auf ein Endvolumen von 330 ul zu erreichen. </li><li> Add Neutralisationspuffer (1 M Tris pH 8,0), um die Probengefäße, dass Eluat sammeln. Die Anzahl und das Volumen der Vials mit denen Sie arbeiten werden, auf die Zwänge der Autosampler ab. Für die Paradigm MG4, sammelt ein Fläschchen der Flow-Through-und zwei sammeln das Eluat. Es erfordert etwa 1,5 mL Tris-Puffer auf 1 ml des Eluats zu neutralisieren. Ziel neutralisiert pH-Wert 7,0-8,0; test test endgültige pH-Wert mit pH-Indikatorpapier. </li></ol> 5) Führen Sie Chromatographie <ol><li> Alle Leerwert und Probe läuft, die folgen wird die Methode in Teil 1 beschrieben. Die Säule und Puffer sind bei Raumtemperatur während der Benutzung. Die Spalten werden bei 4 ° C gelagert, während Puffer bei Raumtemperatur gelagert werden. </li><li> Bringen Sie entweder die AAL oder die SNA Lektinsäule der HPLC-System und führen Sie zwei leere Methoden (Injektion nur Buffer A). Stellen Sie sicher, dass das Lektin Säule an das Lektin-spezifischen Lactoferrin (Teil 2) entspricht. </li><li> Chromatograph den drei Plasma-Proben, Einspritzen einer leeren zwischen den einzelnen injizierten Probe, für insgesamt 7 HPLC-Läufen. Fraktionen aus blank läuft brauchen nicht erhoben. </li></ol> 6) Desalt Fraktionen gesammelt Für jede Fraktion verwenden Sie eine 1 mL Waters Oasis HLB SPE-Kartusche wie folgt: <ol><li> Bringen Sie die Anzahl der benötigten Kassetten Vakuumkammer. </li><li> Wet jede Patrone mit 1 mL 80% ACN in 1% Ameisensäure (Vakuum-Messgerät auf vielfältige sollte 5 gelesen - 20 lnHg). </li><li> Äquilibrieren Patronen mit 1,5 ml 0,1% Ameisensäure (Vakuum-Messgerät auf vielfältige sollte 5 gelesen - 20 lnHg) </li><li> Laden gesamte Volumen einer Probe auf eine Patrone (Vakuum-Messgerät auf vielfältige sollte 2 gelesen -. 2,5 lnHg und Durchfluss sollte nicht mehr als 1 ml / min) </li><li> Wash-Kartuschen mit 3 x 1 mL 0,1% Ameisensäure (Vakuum-Messgerät auf vielfältige sollte 5 gelesen - 20 lnHg) </li><li> Eluieren Peptide / Glykopeptide in beschriftete Eppendorf-Röhrchen mit 1 x 1 mL 80% Acetonitril in 0,1% iger Ameisensäure. (Vakuum-Messgerät auf vielfältige lesen sollten 2 bis 2,5 lnHg und Durchfluss sollte nicht mehr als 1 ml / min.) Ein einzelnes Sammelröhrchen für jede Patrone verwendet werden sollte. </li><li> Neutralisieren Eluat durch Zugabe von 60 ul 0,5 M Ammoniumhydrogencarbonat jedem Sammelrohr. Ziel neutr.funktionalisierten pH-Wert ist 7,0-8,0; Test End-pH mit pH-Indikatorpapier. </li><li> Konzentrieren Sie sich eluierten Peptide / Glykopeptide auf ~ 50 ul, indem Sie sie auf einer Vakuum-Zentrifuge (z. B. eine Thermo Savant SpeedVac) für ca. 2 Stunden bei 35 ° C. </li></ol> 7) PNGase F-Verdauung <ol><li> Prüfling pH zu gewährleisten ist zwischen 7,0 bis 8,0. Wenn nötig, fügen Sie 50 mM Ammoniumhydrogencarbonat pH zu erhöhen. Wenn die endgültige Probenvolumen&gt; 100 ul, Speedvac Probe, bis es zwischen 50-100 ul ist. </li><li> Add 0,5 ul (250 U) Glycerin-free PNGase F zu jeder Probe Rohr und bei 37 ° C über Nacht. </li></ol> 8) Zip Tip Proben <ol><li> Beginnend mit PNGase F-verdauten Proben, ZipTip jeweils wie folgt. </li><li> Wet ZipTip mit 10 ul 100% Acetonitril, gefolgt von 10 ul 80% Acetonitril, 0,1% Ameisensäure. </li><li> Äquilibrieren ZipTip mit 20 ul 0,1% Ameisensäure. </li><li> Legen Sie die Probe auf die ZipTip durch Pipettieren es rauf und runter durch die ZipTip Matrix 10-mal. </li><li> Waschen Sie die ZipTip durch Pipettieren 10 pl 0,1% Ameisensäure, 5-mal. </li><li> Eluieren der Probe in ein sauberes Eppendorf-Röhrchen mit 10 ul 80% Acetonitril, 0,1% Ameisensäure. </li><li> Wiederholen Sie die Elution und fügen Sie den zweiten 10 ul in das gleiche Rohr. </li><li> Speedvac die Proben auf ein Volumen von &lt;2 pl. </li><li> Resuspendieren Proben in 20 ul 0,1% Ameisensäure. Die Proben sind nun bereit für die Analyse durch LC-MS/MS. </li></ol> 9) repräsentative Ergebnisse: Die POROS Konjugation typischerweise Erträge On-Bead-Lektin-Konzentrationen im Bereich von 2 bis 20 mg / mL. Dies ist optimal für die Affinitätschromatographie. Lektinchromatographie von trypsinverdauten MARS-abgereicherten Humanplasma in der Regel eine Bereicherung Glykopeptide in der gebundenen Fraktion. Wie sind die Glykopeptide PNGase F-behandelten vor LC-MS/MS, werden sie als Peptide mit der N-linked Konsensussequenz identifiziert, NXS / T (X steht für alle Rückstände, aber Prolin), in denen die Asparagin zu umgewandelt wurde einer Asparaginsäure durch die Einwirkung von PNGase F. Peptide mit diesen Eigenschaften werden als deglykosylierter Peptide (oder &quot;deglycopeptides&quot;) werden. Im Durchschnitt der Flow-Through-(FT)-Fraktion aus AAL oder SNA-Chromatographie enthält 2-4% deglycopeptides, während 30-50% der Peptide in der gebundenen Fraktion gewonnen deglycopeptides sind. In der Regel mit einem QStar Elite, wird 1000-1300 Peptide in der FT-Fraktion identifiziert werden, und 200-400 Peptide werden in der gebundenen Fraktion identifiziert werden. Zwei oder mehr verschiedene Invertase deglycopeptides sollte in der FT-Fraktion und zwei oder mehr unterschiedliche Lactoferrin deglycopeptides in der gebundenen Fraktion (Tabelle 1) eingehalten werden. <img src="/files/ftp_upload/1398/1398table.jpg" alt="Tabelle 1" /> Tabelle 1.

<ol><li>Keshishian, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((multiplexed+assays+for+low+abundance+proteins+in+plasma+by+targeted+mass+spectrometry+and+stable+isotope+dilution%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">multiplexed assays for low abundance proteins in plasma by targeted mass spectrometry and stable isotope dilution.</a> Mol Cell Proteomics. 6, 2212-2229 (2007).</li>
</ol>

Dieses Protokoll bietet eine schnelle Methode zur Isolierung und Identifizierung von Glycopeptiden in ein Glykan-spezifische Art und Weise. Als Glykosylierung variiert weitgehend innerhalb eines Organismus, insbesondere bei der Entwicklung und Pathogenese, kann diese Technik anzuwenden, um eine Vielzahl von Fragen zu beantworten. Insbesondere sind wir mit der Methode zur selektiven Anreicherung Glykopeptide, die mit Krebs-assoziierte Epitope wurden als erster Schritt in Richtung Entdeckung neuer Biomarker geändert.

<table><tbody><tr><td>Menschliches Plasma</td><td></td><td></td><td>Wird im Haus hergestellt</td></tr><tr><td>Menschliches Lactoferrin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L0520</td><td>Vor der Verwendung mit Trypsin verdauen</td></tr><tr><td>Hefe-Invertase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I0408</td><td>Vor der Verwendung mit Trypsin verdauen</td></tr><tr><td>Oass-HLB-SPE-Kartuschen</td><td>Waters</td><td>WAT094225</td><td>1-cc-Volumen</td></tr><tr><td>ZipTip-Pipettenspitzen</td><td>Fisher Scientific</td><td>ZTC1 8M0 96</td><td>Millipore, C18 für 10-ml-Pipette</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP154-1</td><td>99 %</td></tr><tr><td>Ammoniumbicarbonat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6141</td><td>99 %</td></tr><tr><td>Calciumchlorid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4901</td><td>96 %</td></tr><tr><td>Magnesiumchlorid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td>98 %</td></tr><tr><td>Essigsäure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>242853</td><td>99,7 %</td></tr><tr><td>pH-Indikatorpapier</td><td>Fisher Scientific</td><td>M95903</td><td>Bereich 0–14</td></tr><tr><td>Acetonitril</td><td>Fisher Scientific</td><td>A998</td><td>99,9 %</td></tr><tr><td>Blausäure</td><td>Pierce, Thermo Scientific</td><td>28905</td><td>99 %</td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung</td><td>Invitrogen</td><td>14190-136</td><td>Ohne Calcium und Magnesium</td></tr><tr><td>Natriumazid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71289</td><td>99,5 %</td></tr><tr><td>PNGase F</td><td>New England Biolabs</td><td>P0705L</td><td>Glycerinfrei</td></tr><tr><td>Vakuum-Filtrierkolben</td><td>Fisher Scientific</td><td>SCGVU05RE</td><td>0,2-mm-Poren</td></tr><tr><td>POROS-AL-Perlen</td><td>Applied Biosystems</td><td>1-6028-02</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Aleuria aurantia&lt;/em&gt;-Lektin</td><td>Vector Laboratories</td><td>L-1390</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Sambucus nigra&lt;/em&gt;-Agglutinin</td><td>Vector Laboratories</td><td>L-1300</td><td></td></tr><tr><td>Natriumcyanoborhydrid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>296945</td><td>5,0-M-Lösung</td></tr></tbody></table>

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A Lectin HPLC Method to Enrich Selectively-glycosylated Peptides from Complex Biological Samples

Glykane sind eine wichtige Klasse von post-translationale Modifikationen. In der Regel auf sezerniert und extrazelluläre Moleküle gefunden, Signal Glykanstrukturen den internen Status der Zelle. Glykane auf Tumorzellen neigen dazu, reichlich Sialinsäure und Fucose-Einheiten haben. Wir schlagen vor, dass diese Krebs-assoziierte glycan Varianten für Biomarker-Entwicklung bei der Diagnose einer Erkrankung im Frühstadium sollen ausgeschöpft werden. Dementsprechend haben wir ein Massenspektrometrie-basierter Workflow, der Chromatographie an Affinitätsmatrizes von Lektinen, Proteine, die spezifisch Glykanstrukturen binden gebildet beinhaltet. Die Lektine Sambucus nigra (SNA) und Aleuria aurantia (AAL), die Sialinsäure und Fucose binden, wurden jeweils kovalent an POROS Perlen (Applied Biosystems) gekoppelt und verpackt in PEEK Säulen für Hochdruck-Flüssigchromatographie (HPLC). Kurz gesagt, wurde Plasma von den vierzehn am häufigsten vorkommenden Proteine ​​mit Hilfe eines Multiple-Affinität-Entfernungs-System (; Agilent MARS-14) erschöpft. Abgereichertes Plasma wurde Trypsin-verdaut und in Flow-Through-und gebundenen Fraktionen von SNA oder AAL HPLC. Die Fraktionen wurden mit PNGaseF behandelt werden, um N-Glycane zu entfernen, und mit Hilfe der LC-MS/MS auf einem QStar Elite. Die Daten wurden mittels Mascot-Software. Das experimentelle Design inklusive positiven Kontrollen fucosylierte und sialylierte humanes Lactoferrin Glykopeptide-und Negativ-Kontrollen-high Mannose Glycopeptide aus Saccharomyces cerevisiae-, die verwendet wurden, um die Spezifität der Lectin erfassen zu überwachen. Key Features dieser Workflow sind die Reproduzierbarkeit von HPLC-Format, die positive Identifikation der erfassten und PNGaseF behandelten Glykopeptide aus ihren deamidierten Asn-Xxx-Ser/Thr Motive und Qualitätsbewertung mit Glykoprotein-Normen abgeleitet. Protokoll-Optimierung ebenfalls enthalten, um die geeignete Verhältnis von Ausgangsmaterial zur Spalte Kapazität, Ermittlung der effizienten Erfassung und Elutionspuffer, und die Überwachung der PNGaseF-Behandlung in voller Deglykosylierung zu gewährleisten. Zukünftige Richtungen gehören die Verwendung dieser Workflow-Massenspektrometrie-basierte Entdeckung Experimente an Plasma von Patientinnen mit Brustkrebs und Kontrollpersonen durchgeführt.

Lectin-konjugierten POROS Perlen wurden für die HPLC eingesetzt. Glycopeptid-Normen diente als positive und negative Kontrollen. MARS-14 aufgebraucht wurde trypsinverdauten Humanplasma chromatographiert und Flow-Through-(FT) und gebundenen Fraktionen für ESI-LC-MS/MS Analysen gesammelt. Glykopeptide wurden in der gebundenen Fraktion angereichert, um FT verglichen.

A Lectin HPLC-Methode zur selektiven glykosylierte Peptide aus komplexen biologischen Proben Enrich

Glykane stellen eine wichtige Klasse posttranslationaler Modifikationen dar. Glykanstrukturen, die typischerweise an sekretierten und extrazellulären Molekülen vorkommen, signalisieren das ...

Dieses Verfahren dient der gezielten Isolierung glykosylierter Glycopeptide aus menschlichem Plasma. Das Plasma wird mit Trypsin verdaut, um ein Gemisch aus Peptiden und Glycopeptiden sowie Glycopeptidstandards zu erhalten. Positive und negative Kontrollen für die Lektinchromatographie werden dem Plasma zugesetzt.Die Probe wird einer Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie mittels Lektin-Affinitätschromatographie unterzogen. Die verwendeten Lektine binden jeweils diffus verteiltes Fucose und Sialinsäure; Peptide und irrelevante Glycopeptide eluieren dabei mit der Durchlauf-Fraktion aus der Säule. Die gebundene Fraktion wird mithilfe von Essigsäure aus der Säule eluiert.Dies ist angereichert für spezifisch modifizierte Glycopeptide. Hallo, ich bin Penny Drake aus dem Labor von Susan Fisher aus der Abteilung für Geburtsmedizin, Gynäkologie und reproduktive Wissenschaften sowie der San Lamore-Massenspektrometrie-Kernanlage an der University of California San Francisco. Und ich bin Eric Johansen, ebenfalls von der Sandler Moore-Massenspektrometrie-Kernanlage und dem Fisher-Labor. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Durchführung der Lectinchromatographie, um Glycopeptide aus menschlichem Plasma und anderen komplexen Gemischen anzureichern. Wir verwenden dieses Verfahren in unserem Labor als allgemeines Werkzeug mit zahlreichen Anwendungen. Beispielsweise spielt es eine wichtige Rolle in unserem Workflow zur Entdeckung von Biomarkern für Brustkrebs.Beginnen wir also. Tragen Sie zu Beginn des Verfahrens eine Maske, um sich vor der Inhalation der Kügelchen zu schützen. Wiegen Sie anschließend 100 Milligramm Porro-Kügelchen ab und geben Sie sie in ein sauberes Einohr-Gefäß.Es werden etwa 300 Mikroliter Kügelchen benötigt, um eine Säule zu packen. Außerdem das unkonjugierte Lektin abwiegen und in ein sauberes Eppendorf-Gefäß umsetzen. Die Lektine SNA und AAL werden verwendet.Fahren Sie fort, PBS zum Lektin hinzuzufügen, um eine Lösung mit fünf bis 20 Milligramm pro Milliliter herzustellen. Heben Sie 25 Mikroliter dieser vorher konjugierten Lösung auf. Waschen Sie anschließend die Porro-Schnelltests, indem Sie ein Milliliter PBS hinzufügen und in einer Mikrozentrifuge mit maximaler Geschwindigkeit zentrifugieren.Entfernen Sie drei Minuten lang den Überstand und wiederholen Sie die Waschung. Arbeiten Sie nun im Abzug und überführen Sie die verbleibende Lektinlösung in die gewaschenen Porro-Schnellkugeln. Fügen Sie anschließend Natriumsanoborhydrid hinzu, um eine Endkonzentration von 50 Millimolar zu erreichen.Beachten Sie, dass Natriumsanoborhydrid toxisch ist und der Abfall entsprechend entsorgt werden muss. Verschließen Sie das geschlossene Reaktionsgefäß mit Parafilm und geben Sie es auf einen Schüttler, um über Nacht bei Raumtemperatur reagieren zu lassen. Nach der über Nacht erfolgten Bindung des Lektins an die Porro-Sphären pelletieren Sie die Porro-Sphären erneut. Entfernen Sie den Überstand und bewahren Sie ihn als Post-Konjugationslösung auf, um die verbleibenden reaktiven Stellen auf den Sphären zu blockieren.Waschen Sie die Kügelchen zunächst durch Zentrifugation mit einem Milliliter Puffer zur Reaktionsunterdrückung, bestehend aus einer molaren CL-Lösung bei pH 7,4. Geben Sie dann ein Milliliter Puffer zur Reaktionsunterdrückung und Natriumsulfonylhydrid hinzu, um eine Endkonzentration von 50 Millimolar zu erreichen. Stellen Sie das Röhrchen auf einen Schüttelapparat und inkubieren Sie es 30 Minuten bei Raumtemperatur.Die Abriegelung ist nun abgeschlossen. Zentrifugieren Sie die Kügelchen, wie zuvor.Entfernen Sie den Überstand und waschen Sie die Kügelchen anschließend fünfmal mit jeweils einem Milliliter einmolarer Natriumchloridlösung; verwerfen Sie danach jeweils den Überstand. Führen Sie eine Protein-Konzentrationsbestimmung an den vor und nach der Konjugation vorliegenden Lösungen der Lektine durch und nutzen Sie die Differenz, um die Menge an Protein zu ermitteln, die an die Porro-Beads gebunden wurde. Die Ziel-Lektin-Konzentrationen liegen zwischen zwei und 20 Milligramm pro Milliliter, berechnet als Menge des konjugierten Proteins pro Beadvolumen.Die konjugierten Porro-Perlen sind nun bereit, in eine Säule gepackt zu werden. Um die Perlen in eine Säule zu füllen, bauen Sie das Packsystem auf, das aus zwei Säulen besteht, die auf einem metallenen Stativring befestigt sind. Die obere Säule dient als Reservoir für das Packmaterial.Das Verpackungssystem besteht von unten nach oben aus dem Druckbegrenzer, dem Endspulenverbinder eins für die Zielspule, dem Endspulenverbinder, dem Doppel-Spulenverbinder, dem Endspulenverbinder drei, der Reservoirspule, dem Endspulenverbinder vier und dem Endstück. Als Nächstes resuspendieren Sie 300 Mikroliter Porro-Geschwindigkeiten in 600.Mikroliter Puffer A. Um eine Säule zu packen, überführen Sie die Kügelchen in das obere Reservoir der Säule. Fügen Sie Puffer A hinzu, bis er den oberen Rand der Säule erreicht. Setzen Sie das Endstück vorsichtig auf das obere Ende der Säule.Darauf achten, Luftblasen in der Säule zu vermeiden. Das Endstück der oberen Säule an das HPLC-System anschließen. Die Säule durchströmen lassen, indem Puffer A oder PBS durch das System geleitet wird. Beginnen Sie mit einer Flussrate von 0,5 Millilitern pro Minute. Erhöhen Sie die Flussrate jede Minute um jeweils 0,5 Milliliter pro Minute, bis entweder vier Milliliter pro Minute oder der maximale Druck erreicht ist. Setzen Sie die Durchführung mit der maximal möglichen Flussrate fort, bis mindestens 35 Milliliter Puffer die Säule durchlaufen haben.Wenn der Vorgang abgeschlossen ist, schalten Sie die Pumpen aus und lassen Sie den Druck in der Säule unter 20 PSI absinken. Da die Säule nun gepackt ist, bauen Sie das Packsystem vorsichtig beginnend von oben ab. Wenn Sie den Endkupplungsverbinder zwei erreichen, nehmen Sie ihn vorsichtig ab.Entfernen Sie mit einem Rasiermesser vorsichtig das aus der Säule austretende gepackte Material. Üben Sie dabei keinen Druck auf die Kügelchen aus. Lösen Sie die gepackte Säule vom Stativring.Setzen Sie eine neue Sinterplatte in einen neuen Endkuppler ein und drehen Sie die gepackte Säule um, um diese mit dem FR-Plus-Endkuppler am offenen Säulenende zu verbinden. Die Säule ist nun bereit für den HPLC-Lauf. Wenn sie nicht verwendet wird, kann die Säule bis zu sechs Monate in PBS mit 0,5 % Natriumazid bei vier Grad Celsius gelagert werden.Die Details zur Programmierung Ihres HPLCs variieren je nach Ihrer Apparatur und den Besonderheiten der Software des Herstellers. Hier verwenden wir einen Microme Paradigm MG4 HPLC auf dieser Maschine. Methoden werden unter dem Reiter „Setup“ oben im Bildschirmprogramm erstellt und aufgerufen.Die gezeigte Methode, die auch ausführlich im beigefügten schriftlichen Protokoll beschrieben ist. Falls ein Autosampler-Programm verwendet wird, ebenfalls dem schriftlichen Protokoll folgen. Verwenden Sie Puffer A wie zuvor und Puffer B für die HPLC-Durchführung, und halten Sie die Puffer sowie die Säulen bei Raumtemperatur.Programmieren Sie den UV-Detektor so, dass er von null bis 19 Minuten und 50 Sekunden bei zwei und 80 Nanometern misst. Stellen Sie die Y-Achse so ein, dass niedrige Extinktionswerte im Bereich von null bis 50 Extinktionseinheiten erfasst werden. Bereiten Sie anschließend die Proben vor.Die Testproben stammen aus humanem Plasma, das mittels einer MARS-Säule von den 14 häufigsten Proteinen befreit wurde. Die angereicherten Plasma-Proben und zwei Standards – humanes Lactoferrin und Hefe-Invertase – wurden jeweils einzeln mit Trypsin verdaut und entsalzt, wie zuvor beschrieben.Um die Proben zu neutralisieren, sollte Neutralisierungspuffer in den Probenfläschchen bereitstehen, die das EIT für das Paradigma MG vier sammeln; ein Fläschchen sammelt den Durchfluss und drei sammeln das Eluat. Es werden etwa 1,5 Milliliter Puffer benötigt, um ein Milliliter EIT zu neutralisieren. Der angestrebte neutralisierte pH-Wert liegt zwischen 7,0 und 8,0.Stellen Sie sicher, dass der endgültige pH-Wert mit pH-Indikatorpapier überprüft wird. Entsalzen Sie die Proben, wie später in diesem Protokoll beschrieben. Und resuspendieren Sie die Probe zur optimalen Wirkung in einem Milliliter Puffer A.Führen Sie drei experimentelle Replikate durch, sodass die Daten verglichen und kombiniert werden können. Um Proben für drei Replikate vorzubereiten, geben Sie drei Pikamol Trypsin, verdauten Invertase und ein Mikroliter HPLC-gereinigten, spezifischen Lactoferrin-Lektin zu 30 Mikrolitern Mars-depletiertem Trypsin, verdauten Plasmaprobenäquivalenten oder pe hinzu. Dies entspricht etwa 50 Mikrogramm Plasmaprotein, die für jedes Replikat verwendet werden. Geben Sie Puffer A zur Probe hinzu, um ein Endvolumen von 330 Mikrolitern oder 110 Mikrolitern pro experimentellem Replikat zu erreichen. Verwenden Sie entweder die AaL- oder die SNA-Lektinsäule. Führen Sie zunächst zwei Leerläufe durch, bei denen ausschließlich Puffer A injiziert wird. Stellen Sie sicher, dass die Lektinsäule dem als Standard verwendeten und zuvor chromatographisch gereinigten, spezifischen Lactoferrin-Lektin entspricht.Die drei Plasma­proben werden mit einer Leerprobe zwischen jeder injizierten Probe insgesamt siebenmal mittels HPLC durchgeführt. Fraktionen aus den Leerproben müssen nicht gesammelt werden. Achten Sie erneut darauf, die Proben zu neutralisieren, indem Puffer zur Neutralisation in den Proben­gefäßen vorhanden ist, die das Eluat nach der Entsalzung und der P-N-G-A-F-Verdauung auffangen; danach sind die Proben zur massenspektrometrischen Analyse bereit.Verwenden Sie je ein 1 ml Waters Oasis H-L-B-S-P-E-Kartusche für jede HBLC-Fraktion aus dem Lactoferrin-Standard und den experimentellen Proben zur Entsalzung. Befestigen Sie zunächst die erforderliche Anzahl an Kartuschen an einem Vakuummanifold. Benetzen Sie jede Kartusche mit einem Milliliter 80 %iger Acetonitril in 1 % Ameisensäure. Das Vakuummanometer am Verteiler sollte fünf bis 20 Zoll anzeigen. Puffern Sie die Kartuschen mit 1,5 Milliliter 0,1 %iger Ameisensäure aus. Auch diesmal sollte das Vakuummanometer am Verteiler fünf bis 20 Zoll anzeigen.Quecksilber: Laden Sie das gesamte Volumen einer Probe auf eine Kartusche auf. Nun sollte das Vakuummanometer am Manifold zwei bis 2,5 Zoll anzeigen. Das Quecksilber und die Fließgeschwindigkeit sollten eine Milliliter pro Minute nicht überschreiten.Waschen Sie die Kartuschen dreimal mit je einem Milliliter 0,1 %iger Ameisensäure unter Verwendung eines einzelnen beschrifteten Sammelgefäßes für jede Kartusche. Eluieren Sie die Glycopeptide mit einem Milliliter 80 %igem Acetonitril in 0,1 %iger Ameisensäure. Neutralisieren Sie das EIT, indem Sie jedem Sammelgefäß 60 Mikroliter 0,5 molarer Ammoniumbicarbonatlösung hinzufügen. Der angestrebte neutralisierte pH-Wert liegt zwischen 7,0 und 8,0.Überprüfen Sie den End-pH-Wert mit pH-Indikatorpapier. Konzentrieren Sie die eluierten Peptide mithilfe einer Vakuumzentrifuge, beispielsweise einer Thermo Savant Speed Vac, auf etwa 50 Mikroliter, indem Sie etwa zwei Stunden bei 35 Grad Celsius zentrifugieren. Prüfen Sie den pH-Wert der Probe erneut nach der Konzentrierung, um sicherzustellen, dass er zwischen 7,0 und 8,0 liegt. Falls erforderlich, geben Sie 50 Millimolar Ammoniumbicarbonat hinzu, um den pH-Wert zu erhöhen.Wenn das endgültige Probenvolumen größer als 100 Mikroliter ist, konzentrieren Sie die Probe durch Vakuumzentrifugation, bis sie zwischen 50 und 100 Mikroliter beträgt. Entfernen Sie abschließend N-gebundene Kohlenhydrate von den Peptiden, indem Sie 250 Einheiten glycerinfreies Peptid-N-glykosidase F oder P-N-G-A-F zu jedem Probengefäß hinzufügen und über Nacht bei 37 Grad Celsius inkubieren. Nach der Übernacht-Inkubation mit P-N-G-S-F verwenden Sie Zip-Tip-Pipettenspitzen, die eine Reverse-Phase-C-18-Matrix enthalten, um die Proben vor Beginn der Desalzierung durchzuführen.Erstellen Sie zwei Tropfen, einen aus 0,1 % Ameisensäure und einen aus 80 % Acetonitril plus 0,1 % Ameisensäure auf einem Stück Paraform zur Waschung und Elution. Tropfen werden verwendet, um eine Kreuzkontamination von Peptiden zwischen Proben zu verhindern, und für jede abgesaugte Probe werden neue Tropfen hergestellt. Befeuchten Sie zunächst einen Zip-Tipp mit Acetonitril-Lösung. Äquilibrieren Sie den Zip-Tipp, indem Sie dreimal 10 µL 0,1 % Ameisensäure auf- und abpipettieren.Geben Sie die Probe durch zehnmaliges Auf- und Abpipettieren auf. Waschen Sie anschließend die Spitze fünfmal mit 10 Mikrolitern 0,1%iger Ameisensäure. Schließlich eluieren Sie die Probe zweimal mit 80%iger Acetonitril-Lösung in 1%iger Ameisensäure und sammeln die eluierten Peptide in einem Eppendorf-Röhrchen.Reduzieren Sie das Probenvolumen durch Eindampfen im Vakuumzentrifugalkoncentrator auf weniger als zwei Mikroliter und lösen Sie die Proben abschließend in 20 Mikrolitern 0,1%iger Ameisensäure wieder auf. Die Proben sind nun zur Analyse mittels L-C-M-S-M-S bereit. Die Porro-Konjugation ergibt typischerweise Bead-gebundene Lektinkonzentrationen im Bereich von zwei bis 20 Milligramm pro Milliliter, was für die Affinitätschromatographie optimal ist.Die Lectin-Chromatographie von mit Trypsin verdautem, marschdepletiertem humanem Plasma bereichert typischerweise Glycopeptide in der gebundenen Fraktion. Unser Workflow identifiziert N-gebundene Glycopeptide, die die unverknüpfte Konsensussequenz NXS oder NXT enthalten, wobei X jedes beliebige Rest außer Prolin ist. Die Behandlung mit PNGF entfernt die unverknüpften Glykane und deaminiert den Asparaginrest, an den die Glykane gebunden waren.Dation führt zu einer Massenverschiebung von einem Dalton des deglykosylierten Peptids oder des Deglycopeptids gegenüber dem unmodifizierten Peptid. Somit werden DEG-Glycopeptide als Peptide identifiziert, die die N-gebundene Konsensussequenz enthalten, wobei die Asparagin-Reststelle innerhalb der Konsensussequenz deamidiert ist und als eine Massendifferenz von plus eins im Vergleich zu einer unmodifizierten Asparagin-Reststelle beobachtet wird. Hier veranschaulichen zwei Beispielspektren dieses Konzept.Das obere Spektrum zeigt die Fragmentierung eines unmodifizierten Peptids, das die EnLink-Konsensussequenz enthält. Das untere Spektrum zeigt die Fragmentierung desselben Peptids mit dem deaminierten Asparaginrest innerhalb der EnLink-Konsensussequenz. Die markierten molekularen Ionen der Y7-, Y8- und B3-Fragmente des deamidierten Peptids weisen eine um ein Dalton erhöhte Masse auf, verglichen mit ihren Gegenstücken im unmodifizierten Peptid. Diese Massenverschiebung zeigt an, dass das Peptid im unteren Spektrum ein deamidiertes Asparagin-Rest enthält. Typischerweise werden mit einem QStar elite 1000 bis 1300 gesamte Peptide in der Durchlauf-Fraktion und 200 bis 400 Peptide in der gebundenen Fraktion identifiziert. Im Durchschnitt enthält die Durchlauf-Fraktion aus einer a l- oder SNA-Chromatographie zwei bis 4 % deglykosylierter Peptide, während 30 bis 50 % der in der gebundenen Fraktion gewonnenen Peptide deglykosylierte Peptide sind.Wir verwenden den Begriff deg-Glycopeptide statt Glycopeptide, da während der massenspektrometrischen Analyse die deglykosylierten, deamidierten Moleküle detektiert werden. Wir schlagen jedoch vor, dass die Mehrheit der DEG-Glycopeptide in unseren Proben ursprünglich ungebundene Glycopeptide waren, die durch die Behandlung mit PNGF deglykosyliert und deamidiert wurden. Die Anreicherung von deglykosylierten Glycopeptiden in unserer gebundenen Probe stützt diese Hypothese und ermöglicht es uns, den Nachweis von D-Glycopeptiden als Stellvertreter für die von unserem Protokoll zur Lektin-Affinitätschromatographie erfassten Glycopeptide zu verwenden.Im Durchlauf-Fraktion sollten zwei oder mehr unterschiedliche Invertase-d-Glycopeptide und in der gebundenen Fraktion zwei oder mehr unterschiedliche Lactoferrin-de-Glycopeptide nachweisbar sein. Wir haben Ihnen soeben gezeigt, wie man Lectin-Säulen herstellt und eine Lectin-Affinitätschromatographie im HPLC-Format durchführt. Bei dieser Methode ist es wichtig, mit hochwertigen Glycopeptid-Proben zu beginnen, den pH-Wert der Proben während des gesamten Experiments zu überwachen und die Qualität der Chromatographie mithilfe von Glycopeptid-Standards zu bestätigen.Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.

a-lectin-hplc-method-to-enrich-selectively-glycosylated-peptides-from

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

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