Name: Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae /em (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-10-12T23:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 41 s
Description: Erfahren Sie quantitative Phosphoproteomik bei Saccharomyces cerevisiae durch Kryolyse, HILIC-Fraktionierung und IMAC-Anreicherung. Diese Methode ermöglicht präzise Analysen zellulärer Signalwege mittels Massenspektrometrie.

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Wir möchten Dr. Rich Rogers für die technische Unterstützung danken, mit der Massenspektrometrie analysiert und hilfreiche Diskussionen und Drs. Rob Moritz, Jeff Ranish und Hamid Mirzai für hilfreiche Diskussionen. Diese Arbeit wurde durch die NIH Centers of Excellence finanziert.

Das Wachstum der Zellen und Medien <ol><li> Eine einzelne Kolonie von BY4742Δarg4Δlys1 Zellen über Nacht in 100 mL Rich Media zu einer OD 600 von 1,0 dann Samen in zwei 1-Liter-Kulturen eine minimale Hefemedium (0,17% Yeast Nitrogen Base ohne Ammoniumsulfat oder Aminosäuren, 0,5% Ammoniumsulfat) mit einem volle Ergänzung von Aminosäuren, mit 20 mg / L von isotopisch normalen oder schweren Arginin ergänzt (13 C 6 15 N 4; Isotec) und Lysin (13 C 6 15 N 2; Isotec). </li><li> Die Zellen wurden für 18 Stunden gewachsen, auf eine OD 600 von 1,8. Es ist wichtig, dass die Zellen durch mindestens 9 Generationen gehen auf volle Einbindung der markierten Isotope zu erreichen. Das Licht Probe wurde pelletiert, gewaschen mit sterilem Wasser, reseeded in ein Oleat Medium (isotopisch normalen Arginin und Lysin, 0,2% Oleate (Sigma Chemicals) und 0,5% Tween 40 (Sigma Chemicals)) und stimuliert für weitere 85 Minuten. Daraus ergibt sich eine isotopisch leichte, im Hinblick auf Arginin und Lysin, Probe und einem isotopisch schwere Glukose-grown Referenzprobe Oleat-stimulierte. </li></ol> Cell Lysis, Isolierung und Fraktionierung von Peptiden <ol start="3"><li> Wiegen Zentrifugenflasche. Ernte Proben durch Zentrifugation für 3 Minuten. Entfernen Sie das Medium und saugen überschüssige Flüssigkeit. Wiegen Sie Pellet und Flasche (in der Regel zwischen 1-2 Gramm Ausbeute) blinken dann in flüssigem Stickstoff einfrieren. Fügen Sie ein Volumen entspricht der Pellet-Gewicht von &quot;Schleifen&quot; Puffer, um die gefrorenen Pellets in flüssigem Stickstoff (Phosphate Buffered Saline (PBS, Gibco), 10% Glycerin, Protease-Inhibitoren (SigmaFAST Protease Inhibitor Tabletten, Sigma) und HALT Phosphatase-Inhibitoren (Thermo Scientific )). </li><li> Einfrieren der Mahlbehälter in flüssigem Stickstoff. Warten Sie, bis der flüssige Stickstoff nicht mehr kochen. Übertragen Sie die Pellets zum Schleifen Schiff mit gefrorenem Kugellager. </li><li> Grind bei 600 Umdrehungen pro Minute mit einer 1 min 20 sec-Zyklus mit einer Richtungsumkehr für 3 Minuten. Wieder einfrieren der Mahlbehälter in flüssigem Stickstoff. Wiederholen Sie die 4 mal 15 Minuten insgesamt Mahldauer. </li><li> Sammeln Sie die gefrorenen grindate in ein 50ml Falcon-Röhrchen statt Trockeneis. Bei -80 ° C bis zur Verwendung. </li><li> Machen Sie eine 10ml Lösung von 8 M Harnstoff, 0,1 M Ammoniumhydrogencarbonat, 0,1 M Tris pH 8,6. Add 3 Bände der Harnstoff-Puffer auf 1 Volumen des eingefrorenen grindate (zum Beispiel 3mls der Harnstoff-Puffer hinzugefügt, um einen 1 Gramm Pellet mit 1 ml PBS-Puffer). Unmittelbar beschallen die Mischung mit einer Sondenspitze Sonicator (2 bis 10 Sekunden-Takt). Halten Sie die Spitze in der Nähe der Boden des Röhrchens zu verhindern Schaumbildung. Die grindate sollte sofort in Lösung gehen. </li><li> Deaktivieren Sie das Lysat durch Zentrifugation für 5 Minuten bei 4 ° C. </li><li> Überstand in frische Röhrchen. </li><li> Machen Sie ein frisches Aliquot von 0,5 M Tris [2-carboxy] phosphin (TCEP). In den Probe bei 1:100 für einen 5mm Endkonzentration. Bei 37 ° C für 1 h. </li><li> Alkylierung von reduzierten Cysteinen. Lassen Sie sich auf Raumtemperatur abkühlen. Machen Sie eine frische Aliquot 1M iodoacetamide. Halten Sie in der Dunkelheit (wir wickeln das Rohr in Folie). Hinzufügen, um eine Endkonzentration von 20 mM. Inkubieren im Dunkeln für 1 h bei Raumtemperatur. </li><li> Quench der iodoacetamide mit 20 mM DTT aus einer 1M Lager bei Raumtemperatur für 1 h. </li><li> Quantifizierung des Proteins mit einem Standard-Bradford oder BCA-Assay (nicht beschrieben). Nehmen Sie eine Probe für die Analyse durch SDS-PAGE unten. </li><li> Zur Validierung Einbeziehung der schweren Isotope, verwenden Sie 100 ul des reduzierten und alkylierten Lysat. Verdünnen 1:4 mit dH 2 O, beschallen und fügen Trypsin bei 50:1 Protein Trypsin. Digest für ein Minimum von 4 Stunden, trockenen Probe in einem Speed ​​Vac und dann entsalzt mit einem C18 Ultramicrospin Spalten (The Nest Group). <ol><li> Hydrate Spalte mit 100 ul Acetonitril </li><li> Äquilibrieren mit 200 ul 0,1% TFA. </li><li> Resuspendieren trockenen Probe in 200 ul 0,1% TFA. Legen Sie auf Spalte. Zentrifuge bei ~ 200 xg oder die minimale Geschwindigkeit für den Durchfluss durch die Säule benötigt. </li><li> Zweimal waschen mit 200 ul 0,1% TFA. </li><li> Elution mit zweimal mit 50 ul 60% Acetonitril, 0,1% TFA. </li><li> Dry Probe in einem Speed ​​Vac. </li><li> Resuspendieren Probe in 20 ul 0,1% Ameisensäure. Run 2 ul auf einem Massenspektrometer. Überprüfen Einbeziehung von isotopisch schwere Arginin und Lysin durch eine 10 und 8 Dalton Verschiebung der jeweiligen m / z-Spektren. 98% - Die Aufnahme für jede Aminosäure sollte zwischen 96 sein. </li></ol></li><li> Mix äquivalenten Mengen (mg Protein) des isotopisch schweren und leichten Proben. </li><li> Verdünnte Probe 1:4 mit 20% Methanol. </li><li> Add Trypsin bei 1:200. Inkubieren über Nacht bei 37 ° C. </li><li> Prüfen Sie, ob die Verdauung hat bis zur Fertigstellung durch SDS-PAGE gegangen. Run 2 und 4 ul der Vorverdauung Probe und 8 eind 16 ul der post Trypsin zu verdauen. Visualisieren Sie durch Coomassie-Färbung, die die Verdauung abgeschlossen ist. Wenn es nicht abgeschlossen ist, beschallen die Probe mit einer Sondenspitze Sonicator kurz und zu verdauen wieder mit Trypsin. </li><li> Trocknen Sie die Probe in einem Speed ​​Vac. Nach dem Trocknen mit 200 ul der gefilterten dH 2 O und Wirbel bis das Pellet in Lösung geht. Dry Probe in einem Speed ​​Vac. Resuspendieren wieder mit dH 2 O. Dry Probe wieder. </li><li> Pellet in 0,1% Trifluoressigsäure (TFA; Sigma). Prüfen Sie, ob der pH-Wert um 3 ist mit pH-Streifen. Wenn säuern mit 10% TFA benötigt. </li><li> Pellet aus jedem Niederschlag. </li><li> Desalt die Proben auf einem Waters Sep-Pak Vac 500 mg C18-Säule. Überlasten Sie nicht diese Spalten. Die maximale Menge beträgt 5 mg, aber es ist besser, Last ein bisschen weniger. Teilen Sie die Probe zwischen mehreren Spalten, wenn nötig. <ol><li> Hydrate die Säule mit 5 ml 100% Acetonitril. Zentrifuge bei ~ 200 xg oder die minimale Geschwindigkeit für den Durchfluss durch die Säule benötigt. </li><li> Äquilibrieren Säule mit 5 ml 0,1% TFA. Laden Probe. Sammeln Sie Vor-und Last wieder. </li><li> Waschen mit 5 ml 0,1% TFA. Wiederholen. </li><li> Elution mit 2 ml 60% Acetonitril, 0,1% TFA. </li><li> Dry Probe in einem Speed ​​Vac. </li></ol></li></ol> Peptide Fraktionierung und Isolierung von Phosphopeptide <ol><li> Peptide sind fraktionierte auf HILIC. Wir verwenden eine TOSOH TSK-Gel Amide-80 4,6 mm x 25 cm analytischen Säule mit einer Vorsäule. Nehmen Sie sich Zeit mit diesem Schritt führen Sie die Spalte für 2 Stunden bei 90% A führen Sie dann zwei leere Steigungen vor dem Laden Ihrer Probe. Die maximale Belastung auf einer Säule dieser Größe gedacht, um XX ist, wir in der Regel nicht geladen mehr als 5 mg pro Lauf. </li><li> Solvent A - 98% ACN/0.1% TFA Solvent B - 2% ACN/0.1% TFA Legen Sie in 90% A über 20 &#39;, 90% A bis 85% A über 5&#39;, 85% A bis 60% A über 40 &#39;, 60% A auf 0% A über 5&#39;, 0% A bis 90% A über 5 &#39;. </li><li> Der Durchfluss wird 1ml/min und Fraktionen wurden in 2 Minuten Abständen gesammelt beginnend mit dem 85% A bis 60% A-Gradienten. </li><li> Kombinieren Fraktionen, die Zahl der Fraktionen auf 10 zu reduzieren. Erhöhte Fraktionen wird wahrscheinlich ergeben eine größere Abdeckung des Phosphoproteom. </li></ol> Anreicherung von Phosphopeptide <ol><li> Phosphopeptide angereichert mit PHOS-Select Eisen Affinity Gel. Wir aliquoten unsere IMAC Harz zu vermeiden, wiederholte Einfrieren und Auftauen. Machen Sie 50 ml eines 250 mM Essigsäure, 30% ACN Last Lösung. Bringen Sie den pH-Wert auf 2,7 mit HCl. Resuspendieren Pellets in 500 ul der Last Lösung. Überprüfen pH, passen mit HCl oder NaOH als notwendig. </li><li> Vorwäsche 200 ul IMAC Perlen in einer entsprechenden Spalte. Wir verwenden Molbiotec Spin-Säulen. Add 15 ul einer 50%-Aufschlämmung (Gel zur Lösung Last) zu jeder Fraktion, und inkubieren Sie die Proben für 30 &#39;mit Ende über Ende Rotation. Halten Sie den Fluss für die Analyse. </li><li> Wash Proben 3 mal mit Last-Lösung und einmal mit 500 ul gefiltert dH 2 O. </li><li> Eluieren Peptide mit 2 bis 3 min mit 400 ul 50 mM Na 2 HPO 4 (pH 8,4) Puffer. Transfer in ein Glasgefäß. </li><li> Angesäuert auf pH 3 mit 5 ul 100% ige Ameisensäure, Flash-Freeze in flüssigem Stickstoff und getrocknete Probe in einem Speed ​​Vac. </li><li> Resuspendieren Phosphopeptide in 200 ul 0,1% TFA und C18 sauber wie oben beschrieben. Dry unten eluierten Proben in einem Speed ​​Vac. </li><li> Resuspendieren Peptide in 20 ul 0,1% iger Ameisensäure. Verwenden Sie 2 ul pro Massenspektrometer-Analyse oder nach Bedarf. </li></ol> Hinweise Für viel von diesem Protokoll Sie arbeiten werden &quot;blind&quot;. Die Zell-Lyse kann durch Western-Blot und Bradford oder BCA-Assays und die Trypsinverdauung kann auch leicht beurteilt werden überwacht werden. Die HILIC wird gab eine Spur ähnlich wie diese, oder wie von anderen [1, 2] in Abhängigkeit von der Flüssigchromatographie Maschine, wird gesehen. Die Proben werden mittels Massenspektrometrie überwacht; testen Sie Ihre Proben auf kostengünstigen Maschinen wie LCQs oder Maldis, bevor er zu den hohen Kosten-Analysen auf einem hohen Masse Genauigkeit, hohe Auflösung Maschine. Schließlich, wenn Sie eine Trocknung bis eine Probe mit Säure in ihm, aus Glas verwenden.

<ol><li>Albuquerque, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multidimensional+chromatography+technology+for+in-depth+phosphoproteome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">A multidimensional chromatography technology for in-depth phosphoproteome analysis.</a> Mol Cell Proteomics. 7 (7), 1389-1396 (2008).</li>
<li>McNulty, D. E., Annan, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrophilic+interaction+chromatography+reduces+the+complexity+of+the+phosphoproteome+and+improves+global+phosphopeptide+isolation+and+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Hydrophilic interaction chromatography reduces the complexity of the phosphoproteome and improves global phosphopeptide isolation and detection.</a> Mol Cell Proteomics. 7 (5), 971-980 (2008).</li>
<li>Gygi, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+complex+protein+mixtures+using+isotope-coded+affinity+tags%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of complex protein mixtures using isotope-coded affinity tags.</a> Nat Biotechnol. 17 (10), 994-999 (1999).</li>
<li>Ross, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+protein+quantitation+in+Saccharomyces+cerevisiae+using+amine-reactive+isobaric+tagging+reagents%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents.</a> Mol Cell Proteomics. 3 (12), 1154-1169 (2004).</li>
<li>Gruhler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+phosphoproteomics+applied+to+the+yeast+pheromone+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Quantitative phosphoproteomics applied to the yeast pheromone signaling pathway.</a> Mol Cell Proteomics. 4 (3), 310-327 (2005).</li>
<li>Wilson-Grady, J. T., Villen, J., Gygi, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphoproteome+analysis+of+fission+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Phosphoproteome analysis of fission yeast.</a> J Proteome Res. 7 (3), 1088-1097 (2008).</li>
<li>Villen, J., Gygi, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+SCX%2FIMAC+enrichment+approach+for+global+phosphorylation+analysis+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">The SCX/IMAC enrichment approach for global phosphorylation analysis by mass spectrometry.</a> Nat Protoc. 3 (10), 1630-1638 (2008).</li>
<li>Jensen, S. S., Larsen, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+impact+of+some+experimental+procedures+on+different+phosphopeptide+enrichment+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Commun+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the impact of some experimental procedures on different phosphopeptide enrichment techniques.</a> Rapid Commun Mass Spectrom. 21 (22), 3635-3645 (2007).</li>
<li>Larsen, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+selective+enrichment+of+phosphorylated+peptides+from+peptide+mixtures+using+titanium+dioxide+microcolumns%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Highly selective enrichment of phosphorylated peptides from peptide mixtures using titanium dioxide microcolumns.</a> Mol Cell Proteomics. 4 (7), 873-886 (2005).</li>
<li>Pinkse, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+isolation+at+the+femtomole+level+of+phosphopeptides+from+proteolytic+digests+using+2D-NanoLC-ESI-MS%2FMS+and+titanium+oxide+precolumns%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Selective isolation at the femtomole level of phosphopeptides from proteolytic digests using 2D-NanoLC-ESI-MS/MS and titanium oxide precolumns.</a> Anal Chem. 76 (14), 3935-3943 (2004).</li>
<li>Tao, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+phosphoproteome+analysis+using+a+dendrimer+conjugation+chemistry+and+tandem+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantitative phosphoproteome analysis using a dendrimer conjugation chemistry and tandem mass spectrometry.</a> Nat Methods. 2 (8), 591-598 (2005).</li>
<li>Zhou, H., Watts, J. D., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+approach+to+the+analysis+of+protein+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A systematic approach to the analysis of protein phosphorylation.</a> Nat Biotechnol. 19 (4), 375-378 (2001).</li>
<li>Bodenmiller, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reproducible+isolation+of+distinct%2C+overlapping+segments+of+the+phosphoproteome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Reproducible isolation of distinct, overlapping segments of the phosphoproteome.</a> Nat Methods. 4 (3), 231-237 (2007).</li>
</ol>

Diese Methode wird zu einer Bereicherung der Phosphopeptide quantitativ analysiert werden kann. Eine Reihe von Parametern können in diesem Protokoll verändert werden, aber der wichtigste Aspekt zu erinnern ist, Ihre Phosphorylierung zu bewahren. Vorbereitung der Zellen für die Quantifizierung kann in einer Reihe von verschiedenen Wegen erreicht werden, zum Beispiel, wenn Sie nicht Etikett Ihre Zellen in vivo, tags wie ICAT [3] oder iTRAC [4] kann nach der Extraktion verwendet werden, um differentiell Label zwei...

<table><tbody><tr><td>Isotec&amp;#8482; L-Arginin-&lt;sup&gt;13&lt;/sup&gt;C&lt;sub&gt;6&lt;/sub&gt;,&lt;sup&gt;15&lt;/sup&gt;N&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>608033</td><td></td></tr><tr><td>Isotec&amp;#8482; L-Lysin-&lt;sup&gt;15&lt;/sup&gt;N&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>609021</td><td></td></tr><tr><td>GIBCO&amp;#8482; Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) 7,4 (10X), flüssig</td><td>Invitrogen</td><td>70011044</td><td></td></tr><tr><td>SigmaFAST Protease-Inhibitor-Tabletten</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8820</td><td></td></tr><tr><td>Pierce Halt Phosphatase-Inhibitor-Cocktail</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>78420</td><td></td></tr><tr><td>Retsch PM100 Kugelmühle</td><td>Retsch</td><td>20.540.0001</td><td></td></tr><tr><td>Retsch 125 ml Mahlbecher aus Edelstahl</td><td>Retsch</td><td>01.462.0148</td><td></td></tr><tr><td>Ultramicrospin C18-Säule</td><td>The Nest Group</td><td>SUM SS10</td><td></td></tr><tr><td>Sep-Pak Vac 500 mg C18</td><td>Waters</td><td>WAT043395</td><td></td></tr><tr><td>TSK-Gel Amide-80 4,6 mm x 25 cm Analysensäule</td><td>Tosoh Corp.</td><td>13071</td><td>Dies ist die HILIC-Chromatographiesäule.</td></tr><tr><td>Schutzsäule 4,6 mm Innendurchmesser x 1 cm</td><td>Tosoh Corp.</td><td>19021</td><td>Wir empfehlen diese Schutzsäule, um die Lebensdauer Ihrer HILIC-Säule zu verlängern.</td></tr><tr><td>PHOS-Select&amp;#8482; Eisen-Affinitäts-Gel</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9740</td><td>Dies ist das IMAC-Harz. Portionieren und lagern.</td></tr></tbody></table>

quantitative phosphoproteomics in fatty acid stimulated saccharomyces cerevisiae</em

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Dieses Protokoll beschreibt das Wachstum und die Anregung, mit der Fettsäure Oleat, der isotopisch schweren und leichten S. cerevisiae-Zellen. Die Zellen werden unter Verwendung einer cryolysis Verfahren in einer Kugelmühle Mühle und die daraus resultierenden grindate in Lösung von Harnstoff Solubilisierung gebracht. Dieses Verfahren ermöglicht die Lyse der Zellen in eine metabolisch inaktiven Zustand, Erhaltung Phosphorylierung und verhindert Neuausrichtung der Phosphoproteom während der Zelllyse. Nach der Reduktion, Alkylierung, Trypsinverdauung der Proteine ​​werden die Proben auf C18-Säulen und die Probe Komplexität durch Fraktionierung unter Verwendung von hydrophilen Interaktionschromatographie (HILIC) reduziert entsalzt. HILIC Säulen bevorzugt behalten hydrophile Moleküle, die gut für phosphoproteomics geeignet ist. Phosphorylierte Peptide neigen dazu, später eluieren in der chromatographische Profil als die nicht phosphorylierte Pendants. Nach der Fraktionierung sind Phosphopeptide angereichert mit immobilisierten Metall-Chromatographie, die gegen Gebühr-basierte Affinitäten für Phosphopeptid Bereicherung beruht. Am Ende dieses Verfahrens werden die Proben bereit, quantitativ durch Massenspektrometrie analysiert werden.

Beschreibung eines quantitativen Phosphorylierung Verfahren mit cryolysis, Harnstoff solubilziation, HILIC Fraktionierung und IMAC Anreicherung von phosphorylierten Peptiden.

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae</em

Dieses Protokoll beschreibt die Kultivierung und Stimulation von isotopisch schweren und leichten S. cerevisiae-Zellen mit der Fettsäure Oleat. Die Zellen werden zerrieben ...

Die Phosphorylierung ist ein zentraler zellulärer Signalmechanismus, der Prozesse von der Proteinlokalisation bis zur DNA-Transkription steuert, und die Untersuchung des Phosphoproteoms allein mittels Massenspektrometrie stellt einen spannenden neuen Fortschritt in der Erforschung von Signalwegen und der Proteomik dar. Unterschiedlich markierte Zellen werden durch Lyse in einer Kugelmühle aufgeschlossen, anschließend reduziert, alkyliert, vermischt und verdaut. Die verdauten Peptide werden mittels hydrophiler Wechselwirkungschromatographie fraktioniert, und phospho-Peptide werden aus den Fraktionen durch iMac-Anreicherung angereichert.Die angereicherten phospho-Peptid-Fraktionen werden anschließend durch Msm identifiziert. Ms. Hi, ich bin Ramsey Celine von der E-Gruppe am Institut für Persistenzbiologie. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Extraktion metabolisch markierter phospho-Peptide.Wir verwenden dieses Verfahren in unserem Labor, um das Fossa-Proteom quantitativ zu untersuchen. Beginnen wir also. Dieses Verfahren beginnt mit dem Anzüchten isotopisch leichter und schwerer Hefe-Zellen.Inokulieren Sie zunächst 100 Milliliter reichhaltiges Medium mit einer einzelnen Kolonie von Hefe-Zellen. Kultivieren Sie diese Übernacht, bis eine OD 600 von 1,0 erreicht ist. Verwenden Sie diese Kultur anschließend, um zwei Ein-Liter-Kulturen aus Minimalmedium zu beimpfen, das einen vollständigen Satz an Aminosäuren enthält und mit 20 Milligramm pro Liter isotopisch markierten Substanzen ergänzt wurde.Züchten Sie normales oder isotope-schweres Arginin und Lysin jeweils in einem Liter Kultur über 18 Stunden bis zu einem OD 600 von 1,8. Es ist entscheidend, dass die Zellen mindestens neun Generationen durchlaufen, um eine vollständige Einbindung der markierten Isotope zu gewährleisten. Wenn die Zellen die markierten Isotope vollständig eingebaut haben, zentrifugieren Sie die Zellen, die in dem Medium mit isotope-normalen Arginin und Lysin gezüchtet wurden.Um ein Zellpellet zu erhalten, wird das Pellet mit steriler Wasser sediert und in ein Medium mit Oleat, das isotopisch normales Arginin und Lysin enthält, überführt und 85 Minuten lang stimuliert. Dies ergibt eine isotopisch leichte, mit Oleat stimulierte Probe. Die andere Kultur, die in einem Medium mit isotopisch schwerem Arginin und Lysin gezüchtet wurde, wird nicht mit Oleat stimuliert und dient als isotopisch schwere, mit Glukose gezüchtete Referenzprobe.Um einen Liter zu sammeln, wird die Kultur auf vier Zentrifugenröhrchen mit je 250 Milliliter verteilt. Nach der Zentrifugation werden die Zellen in ein einziges Röhrchen gesammelt, indem jeweils 100 Milliliter des Kulturmediums entfernt werden und die resuspendierten Zellen in das nächste Röhrchen überführt werden. Am Ende wird ein großer Zellpellet in einem einzigen Zentrifugenröhrchen bei 4.000 U/min drei Minuten lang zentrifugiert.Nach dem Entfernen des Mediums wird das Gewicht der Zentrifugenflasche und des Pellets mit dem einer leeren Zentrifugenflasche verglichen. Nach der Zentrifugation entfernen Sie das Medium und aspirations das überschüssige Flüssigkeitsvolumen aus den Flaschen, wiegen die Pellets ab, wobei eine typische Ausbeute zwischen ein und zwei Gramm liegt. Danach gefrieren Sie die Pellets kurz in flüssigem Stickstoff ein, geben Puffer zum Mahlen hinzu, der Protease- und Phosphataseinhibitoren enthält, zu den Pellets.Das Volumen des hinzugefügten Mahlpuffers sollte dem Gewicht des Pellets entsprechen. Gefrieren Sie das Mahlgefäß in flüssigem Stickstoff ein. Wenn das flüssige Stickstoff nicht mehr siedet.Verwenden Sie eine Spatel, um das Pellet zu zerkleinern, und überführen Sie es in das Mahlgefäß, das gefrorene Kugellager enthält. Mahlen Sie die Pellets bei 600 U/min mit einem 22-Sekunden-Zyklus und Richtungsumkehr für drei Minuten. Gefrieren Sie das Mahlgefäß erneut in flüssigem Stickstoff ein.Wiederholen Sie das Mahlen vier weitere Male, insgesamt 15 Minuten lang. Mahlzeit, wenn das Mahlen für beide Proben abgeschlossen ist. Sammeln Sie das gefrorene Mahlgut in 50-Milliliter-Falcon-Röhrchen und lagern Sie es eingefroren entweder in flüssigem Stickstoff oder in Trockeneis.Bewahren Sie das Mahldatum bei minus 80 Grad Celsius auf, bis die Probe verwendet wird. Die Isolierung und Fraktionierung der Peptide beginnt mit deren Alkylierung. Der erste Schritt besteht darin, Ihre Probe in der Harnstofflösung zu lösen.Lösen Sie jedes Mahldatum auf, indem Sie drei Volumina Harnstoffpuffer zu einem Volumen des gefrorenen Mahldatums hinzufügen. Zum Beispiel werden drei Milliliter RIA-Puffer zu einem ein Gramm schweren Pellet gegeben. Mit einem Milliliter PBS-Puffer.Sofort die Mischung mit der Sonde beschallen. Spitze beschallen. Halten Sie die Spitze nahe am Boden des Röhrchens, um Schaumbildung der Lösung zu vermeiden.Das Mahldatum sollte unmittelbar in Lösung überführt werden. Klären Sie die Lysate durch Zentrifugation bei 6.000 U/min für fünf Minuten. Überführen Sie das SUPINATE bei vier Grad Celsius in frische Röhrchen.Um die Reduktionsreaktion zu starten, geben Sie frisch zubereitete 0,5 molare Tris, zwei Carboxyl LITAL PHOSPHINE oder TCEP zu jeder Probe im Verdünnungsverhältnis 1:100 hinzu. Um eine Endkonzentration von fünf Millimolar TCEP zu erreichen, inkubieren Sie die Proben eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius. Nach der Inkubation bei 37 Grad Celsius lassen Sie die Proben auf Raumtemperatur abkühlen.Dann frisch zubereitetes einmolares Iodacetamid unter Zugabe einer Endkonzentration von 20 Millimolar hinzufügen und eine Stunde lang im Dunkeln bei Raumtemperatur inkubieren. Nach der einstündigen Inkubation das Iodacetamid mit 20 Millimolar DTT abspalten. Eine Stunde lang bei Raumtemperatur belassen.Die reduzierten und alkylierten Lysate sind nun bereit für die Trypsinverdauung. An diesem Punkt können Proben der Lysate zur Proteinquantifizierung, SDS-Gelelektrophorese-Analyse zur Überprüfung der Zelllyse sowie zur Massenspektrometrie-Analyse zur Validierung der Einbindung schwerer Isotope verwendet werden. Um die Trypsinverdauung zu beginnen, mischen Sie äquivalente Mengen der isotopisch schweren und leichten Proben.Verdünnen Sie die Probe eins zu vier mit 20 % Methanol und geben Sie Trypsin in einer Verdünnung von eins zu 200 hinzu. Inkubieren Sie die Probe am folgenden Tag über Nacht bei 37 Grad Celsius. Nach Überprüfung des vollständigen Verdauens mittels SDS-Page und Kumasi-Färbung trocknen Sie die Probe in einem Speedvac ein, sobald die Probe trocken ist.Mit 200 Mikrolitern filtriertem destilliertem Wasser auffüllen und vortexen, bis der Pellet in Lösung geht. Die Probe im Speed-Vac trocknen und erneut mit destilliertem Wasser resuspendieren. Nach dem Trocknen die Probe erneut in 0,1 % Trifluoressigsäure (TFA) resuspendieren und gegebenenfalls mit pH-Streifen überprüfen, ob der pH-Wert bei etwa drei liegt. Mit 10 % TFA ansäuern und eventuell entstandene Präzipitate erneut pelletieren.Die tryptisch verdaute Probe wird nun mithilfe einer Wasser-Set-Pack-VAC-500-Milligramm-C18-Säule entzogen. Zunächst wird die Säule mit fünf Milliliter 100 % Acetonitril hydratisiert und bei etwa 200 × g oder der minimalen Geschwindigkeit, die erforderlich ist, um einen Durchfluss durch die Säule zu gewährleisten, zentrifugiert. Anschließend wird die Säule mit fünf Milliliter 0,1 % TFA equilibriert und die Probe aufgetragen.Vermeiden Sie es, die Säule zu überladen, und verteilen Sie die Probe gegebenenfalls auf mehrere Säulen. Sammeln Sie den Durchlauf in einem Abfallbehälter und beladen Sie die Säule gegebenenfalls erneut; waschen Sie mit fünf Millilitern 0,1 % TFA. Wiederholen Sie diesen Waschschritt und eluieren Sie mit zwei Millilitern 60 % Acetonitril 0,1 % TFA. EEU muss durch Zentrifugation gesammelt werden.Trocknen Sie die Probe in einem Speed-Vac und resuspendieren Sie die getrocknete Probe in 200 Mikrolitern Lösungsmittel B. Die resuspendierte Probe ist nun bereit für die Peptid-Fraktionierung. Fraktionieren Sie die Peptide an einer TSK-Gel-AMIDE-80-Analytik-Säule mit Vorsäule. Nehmen Sie sich Zeit für diesen Schritt.Laufen Sie die Säule zwei Stunden lang mit 90 % Lösungsmittel A, dann führen Sie zwei leere Gradienten durch, bevor Sie Ihre Probe auftragen. Üblicherweise tragen wir nicht mehr als fünf Milligramm pro Durchlauf auf einer Säule dieser Größe auf, bei moderner und sogar nicht mehr ganz moderner Flüssigkeitschromatographie. Die Geräte ermöglichen eine automatisierte Probeninjektion, Fraktionssammlung, Durchflussratensteuerung und Gradientenmischungen.Diese werden zu Beginn des Laufs wie beschrieben eingestellt. Laden mit 90 % A über 20 Minuten, von 90 % A auf 85 % A über fünf Minuten, von 85 % A auf 60 % A über 40 Minuten, von 60 % A auf 0 % A über fünf Minuten und von 0 % A auf 90 % A über fünf Minuten. Stellen Sie die Flussrate auf einen Milliliter pro Minute ein und sammeln Sie die Fraktionen im Abstand von zwei Minuten.Beginnend mit dem Gradienten von 85 %A auf 60 %A werden Fraktionen kombiniert, um die Anzahl der Fraktionen auf 10 zu reduzieren. Erhöhte Fraktionen werden voraussichtlich eine größere Abdeckung des Phosphoproteoms liefern. Phosphopeptide werden durch immobilisierte Metallaffinitätschromatographie angereichert. Wir verwenden das Phos-Select-Eisen-Affinitäts-Gel als iMac-Harz.Zunächst suspendieren Sie die Pellets in 500 Mikrolitern Ladelösung. Fügen Sie danach 15 Mikroliter einer 50%igen Suspension zu jeder Fraktion hinzu und inkubieren Sie die Proben 30 Minuten lang mit Rotation von Ende zu Ende. Halten Sie den Durchfluss für die Analyse aufrecht.Waschen Sie die Probe dreimal mit L&ouml;sungsmittel und anschlie&szlig;end einmal mit 500 Mikroliter gefiltertem destilliertem Wasser. Eluieren Sie die Peptide danach zwei bis drei Minuten lang mit 400 Mikroliter 50 Millimolar Natriumphosphatpuffer. &Uuml;berf&uuml;hren Sie die eluierten Peptide in ein Glasvial. Geben Sie f&uuml;nf Mikroliter 100 %ige Ameisens&auml;ure zu den Peptiden, um diese auf pH 3 anzus&auml;uern. Resuspendieren Sie die Phosphopeptide in 200 Mikroliter 0,1 %iger TFA und desalzieren Sie erneut mithilfe einer C18-S&auml;ule, wie zuvor beschrieben. Trocknen Sie die eluierten Proben im Speedvac ein.Schließlich die Phosphopeptide in 20 Mikroliter 0,1 %iger Ameisensäure resuspendieren. Die Proben können nun quantitativ mittels Massenspektrometrie analysiert werden. Hier ist eine chromatographische Grafikdarstellung der Fraktionierung gesamter zellulärer Peptide mittels H-I-L-I-C-Chromatographie dargestellt.Es ist an dieser Spur zu erkennen, dass sich phospho-Peptide über das gesamte Elutionsprofil verteilen, der Großteil der phosphorylierten Reste jedoch erst nahe dem Ende des Elutionsprofils eluiert wird. Wir haben Ihnen soeben gezeigt, wie man Zellen zerkleinert, Proteine verdaut, Peptide fraktioniert und mittels Immobilized-Metal-Affinitätschromatographie nach phospho-Peptiden anreichert. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, die Phosphorylierung zu erhalten und den pH-Wert der Beer-Lösungen zu überprüfen.Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

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Identifizierung von Protein-Komplexen mit der quantitativen Proteomik in S. cerevisiae

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