Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Die Phosphorylierung ist ein wichtiger zellulärer Signalmechanismus, der Prozesse von der Proteinlokalisierung bis zur DNA-Transkription steuert, und die Untersuchung des Phospho allein durch Massenspektrometrie ist ein aufregender neuer Fortschritt in der Erforschung sowohl der Signalübertragung als auch der Proteomik. Differentiell markierte Zellen werden durch Lyse in einer Kugelmühle aufgebahrt, anschließend reduziert, alkyliert, gemischt und verdaut. Die verdauten Peptide werden durch hydrophile Interaktionschromatographie fraktioniert und Phosphopeptide durch iMac-Anreicherung aus Fraktionen angereichert.

Die mit Phosphopeptiden angereicherten Fraktionen werden dann durch msm identifiziert. Hallo, ich bin Ramsey Celine aus der E-Gruppe am Institut für Persistenzbiologie. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Extraktion von metabolisch markierten Phosphopeptiden.

Dieses Verfahren nutzen wir in unserem Labor, um das Fossa-Proteom quantitativ zu untersuchen. Also lasst uns loslegen. Dieses Verfahren beginnt mit der Züchtung von isotopenleichten und schweren Hefezellen.

Beimpfen Sie zunächst 100 Milliliter Rich Media mit einer einzigen Kolonie von Hefezellen. Vergrößern Sie diese Kultur über Nacht auf einen OD 600 von 1,0. Verwenden Sie es dann, um zwei Ein-Liter-Kulturen mit minimalem Medium zu säen, die eine vollständige Ergänzung der Aminosäuren enthalten und mit 20 Milligramm pro Liter Isotope ergänzt werden.

Normales oder isotopenreiches Arginin und Lysin züchten beide Ein-Liter-Kulturen für 18 Stunden auf einen OD 600 von 1,8. Es ist entscheidend, dass die Zellen mindestens neun Generationen durchlaufen, um einen vollständigen Einbau der markierten Isotope zu erreichen. Wenn die Zellen die markierten Isotope vollständig eingebaut haben, zentrifugieren die Zellen, die in den Medien mit isotopenförmigem, normalem Arginin und Lysin gezüchtet wurden.

Um ein Zellpellet zu erhalten, waschen Sie das Pellet mit sterilem Wasser in ein oleathaltiges Medium mit isotopischem, normalem Arginin und Lysin und stimulieren Sie es 85 Minuten lang. Dies ergibt eine isotopenleichte, mit Oleat stimulierte Probe. Die andere Kultur, die in Medien mit isotopenreichem Arginin und Lysin gezüchtet wird, wird nicht mit Oleat stimuliert und dient als isotopenschwere Glukose-gezüchtete Referenzprobe.

Um einen Liter zu gewinnen, wird die Kultur auf vier 250-Milliliter-Zentrifugenflaschen verteilt. Nach der Zentrifugation werden die Zellen in einem Röhrchen gesammelt, indem 100 Milliliter des Mediums entnommen werden, die Zellen suspendiert und in das nächste Röhrchen überführt werden. Am Ende wird ein großes Pellet drei Minuten lang bei 4.000 U/min in einer Einrohrzentrifuge gesammelt.

Nach der Entnahme des Mediums wird das Gewicht der Zentrifugenflasche und des Pellets mit einer leeren Zentrifugenflasche verglichen. Nach der Zentrifugation wird das Medium entfernt und überschüssige Flüssigkeit aus den Flaschen abgesaugt, die Pellets gewogen und eine typische Ausbeute liegt zwischen einem und zwei Gramm. Als nächstes schockfrosten Die Pellets in flüssigem Stickstoff fügen den Pellets einen Mahlpuffer hinzu, der Protease- und Phosphatase-Inhibitoren enthält.

Das Volumen des zugesetzten Mahlpuffers sollte dem Gewicht des Pellets entsprechen. Frieren Sie das Mahlgefäß in flüssigem Stickstoff ein. Wenn der flüssige Stickstoff aufgehört hat zu sieden.

Verwenden Sie ein Schulterblatt, um das Pellet abzuhacken und es in das Mahlgefäß zu übertragen, das gefrorene Kugellager enthält. Mahlen Sie die Pellets bei 600 U/min mit einem einminütigen 22. Zyklus mit einer Richtungsumkehr für drei Minuten. Frieren Sie das Mahlgefäß wieder in flüssigem Stickstoff ein.

Wiederholen Sie den Mahlvorgang noch viermal für insgesamt 15 Minuten. Schleifzeit, wenn die Vermahlung für beide Proben abgeschlossen ist. Sammeln Sie das gefrorene Mahldatum in 50-Milliliter-Falcon-Röhrchen und bewahren Sie es entweder in flüssigem Stickstoff oder in Trockeneis ein.

Lagern Sie das Mahldatum bis zur Verwendung bei minus 80 Grad Celsius. Die Isolierung und Fraktionierung der Peptide beginnt mit ihrer Alkylierung. Der erste Schritt besteht darin, Ihre Probe in der Harnstofflösung zu lösen.

Bringen Sie jede Mahldattel in Lösung, indem Sie drei Volumen Harnstoffpuffer zu einem Volumen gefrorener Mahldattel hinzufügen. Zum Beispiel werden drei Milliliter RIA-Puffer zu einem Ein-Gramm-Pellet hinzugefügt. Mit einem Milliliter PBS-Puffer.

Beschallen Sie das Gemisch sofort mit der Sonde. Tipp sonicate. Halten Sie die Spitze in der Nähe des Bodens des Röhrchens, um ein Schäumen der Lösung zu vermeiden.

Das Mahldatum sollte sofort in Lösung gehen. Reinigen Sie die Lysate durch Zentrifugation bei 6.000 U/min für fünf Minuten. Bei vier Grad Celsius das SUPINATE in frische Tuben umfüllen.

Um die Reduktionsreaktion zu starten, geben Sie frisch zubereitete 0,5 molare Tris, zwei Carboxyl-LITAL-PHOSPHIN oder TCEP in einer Verdünnung von 1 bis 100 zu jeder Probe. Um eine TCEP-Endkonzentration von fünf Millimolar zu erreichen, werden die Proben eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius inkubiert. Lassen Sie die Proben nach der 37 Grad Celsius Inkubation auf Raumtemperatur abkühlen.

Geben Sie dann frisch zubereitetes 1-molares io-Acetamid in eine Endkonzentration von 20 Millimolar und inkubieren Sie es eine Stunde lang dunkel bei Raumtemperatur. Nach der einstündigen Inkubation wird das IOTA-Acetamid mit 20 millimolaren DTT abgeschreckt. Lassen Sie es eine Stunde lang bei Raumtemperatur.

Die reduzierten und alkylierten Lysate sind nun bereit für den tripsin-Aufschluss. Zu diesem Zeitpunkt können Proben der Lysate für die Proteinquantifizierung, die SDS-Seitenanalyse zur Verifizierung der Zelllyse und die Massenspektrometrie zur Validierung des Einbaus der schweren Isotope verwendet werden. Um mit dem Tripsaufschluss zu beginnen, mischen Sie äquivalente Mengen der isotopenschweren und leichten Proben.

Verdünnen Sie die Probe eins zu vier mit 20 % Methanol und fügen Sie Trypsin in einer Verdünnung von eins zu 200 hinzu. Inkubieren Sie die Probe am folgenden Tag über Nacht bei 37 Grad Celsius. Nachdem Sie den vollständigen Aufschluss durch SDS-Seite und Kumasi-Färbung überprüft haben, trocknen Sie die Probe in einem Schnellvakuum, wenn die Probe trocken ist.

Bei 200 Mikrolitern gefiltertem destilliertem Wasser und Vortex, bis das Pellet in Lösung geht. Trocknen Sie die Probe in einem Schnellvakuum und resuspendieren Sie sie erneut mit destilliertem Wasser. Nach dem Trocknen der Probe resuspendieren Sie das Pellet erneut in 0,1 %iger Trifluoressigsäure oder TFA. Überprüfen Sie bei Bedarf mit pH-Streifen, ob der pH-Wert bei etwa drei liegt. Mit 10% TFA-Pellet ansäuern, eventuellen Niederschlag ausfällen.

Die Tryin-aufgeschlossene Probe wird nun mit einer Wassersatzpackung VAC 500 Milligramm C 18 Säule entsalzt. Hydratisieren Sie die Säule zunächst mit einer Zentrifuge aus fünf Millilitern und 100 % Acetonitril bei etwa 200 μg oder der minimalen Geschwindigkeit, die für den Durchfluss durch die Säule erforderlich ist. Als nächstes äquilibrieren Sie die Säule mit fünf Millilitern, 0,1 % TFA laden die Probe.

Achten Sie darauf, die Säule nicht zu überladen, und teilen Sie die Stichprobe bei Bedarf auf mehrere Spalten auf. Den Durchfluss in einen Abfallbehälter füllen und die Säule bei Bedarf erneut befüllen, mit fünf Millilitern, 0,1 % TFA waschen. Wiederholen Sie diese Wascheluierung mit zwei Millilitern 60 % Acetonitril 0,1 % TFA EEU muss durch Zentrifugation aufgefangen werden.

Trocknen Sie die Probe in einem Schnellvakuum und resuspendieren Sie die getrocknete Probe in 200 Mikrolitern Lösungsmittel B. Die resuspendierte Probe ist nun bereit für die Peptidfraktionierung. Fraktionieren Sie die Peptide auf einer analytischen Säule des TSK-Gels AMIDE 80 mit einer Vorsäule. Nehmen Sie sich Zeit mit einem Schritt.

Lassen Sie die Säule zwei Stunden lang bei 90 % Lösungsmittel A laufen und führen Sie dann zwei Blindgradienten durch, bevor Sie Ihre Probe laden. Wir laden in der Regel nicht mehr als fünf Milligramm pro Lauf auf eine Säule dieser Größe, moderne und sogar nicht so moderne Flüssigkeitschromatographie. Die Maschinen ermöglichen eine automatisierte Entnahme von Probeninjektionsfraktionen, eine Ratensteuerung und Gradientenmischungen.

Diese werden wie beschrieben zu Beginn des Laufs gesetzt. Laden Sie 90 % A über 20 Minuten, 90 % A bis 85 % A über fünf Minuten, 85 % A auf 60 % A über 40 Minuten, 60 % A auf 0 % über fünf Minuten und 0 % A auf 90 % über fünf Minuten. Stellen Sie die Durchflussmenge auf einen Milliliter pro Minute ein und sammeln Sie die Fraktionen im Zwei-Minuten-Takt

Beginnend mit dem Gradienten von 85 %A bis 60 %A kombinieren Sie Fraktionen, um die Anzahl der Fraktionen auf 10 zu reduzieren, und erhöht die Fraktionen, um wahrscheinlich eine größere Abdeckung des Phosphoproteoms zu erreichen. Phosphopeptide werden durch immobilisierte Metallchromatographie angereichert. Als iMac-Harz verwenden wir das Phos Select Eisen-Affinitätsgel.

First Resus suspendiert Pellets in 500 Mikrolitern Ladelösung. Als nächstes fügen Sie jeder Fraktion 15 Mikroliter einer 50%igen Aufschlämmung hinzu und inkubieren Sie die Proben 30 Minuten lang mit einer End-over-End-Rotation. Behalten Sie den Fluss für die Analyse bei.

Waschen Sie die Probe dreimal mit Ladelösung und einmal mit 500 Mikrolitern gefiltertem destilliertem Wasser nach den Waschvorgängen, eluieren Sie die Peptide zwei bis drei Minuten lang mit 400 Mikrolitern 50 Millimolar Natriumphosphatpuffer. Übertragen Sie die eluierten Peptide in ein Glasfläschchen. Geben Sie fünf Mikroliter, 100%ige Ameisensäure zu den Peptiden, um sie auf pH anzusäuern, drei resuspendieren Sie Phosphopeptide in 200 Mikrolitern mit 0,1%TFA und entsalzen Sie erneut mit einer C 18-Säule wie zuvor beschrieben, trocknen Sie die angedeuteten Proben in einem Schnellvakuum ab.

Zum Schluss resuspendieren Sie die Phosphopeptide in 20 Mikrolitern 0,1%iger Ameisensäure. Die Proben sind nun bereit, um mittels Massenspektrometrie quantitativ analysiert zu werden. Eine chromatische grafische Spur aus der Fraktionierung von gesamtzellulären Peptiden mittels H-I-L-I-C-Chromatographie ist hier dargestellt.

In dieser Spur kann beobachtet werden, dass Phosphopeptide zwar im gesamten elucianischen Profil zu finden sind, der Großteil der phosphorylierten Reste jedoch bis zum Ende des elucianischen Profils zurückgehalten wird. Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie Sie Zellen mahlen, Proteine verdauen, A-Peptide fraktionieren und mit Hilfe der immobilisierten Metallaffinitätschromatographie für Phosphopeptide anreichern. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, die Phosphorylierung zu erhalten und den pH-Wert der Bierlösungen zu überprüfen.

Das war's also. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.