Quantifizierung und Analyse der Bildung von HO-Endonuklease Stimulated chromosomalen Translokationen von Single-Strand Annealing in Saccharomyces cerevisiae

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die genetische Kontrolle der Translokationsbildung durch einzelsträngiges Knien in diploiden knospenden Hefezellen zu bestimmen. Dies wird erreicht, indem Kulturen zunächst mit einzelnen Völkern eines bestimmten Genotyps geimpft und über Nacht gezüchtet werden. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, die gleichzeitige Bildung eines Doppelstrangbruchs durch Ho-Endonuklease auf zwei Chromosomen durch Zugabe von Galaktose zu den Kulturen zu induzieren.

Anschließend werden diese Kulturen verdünnt und auf selektive und nicht-selektive Medien plattiert. Der letzte Schritt besteht darin, die Translokationshäufigkeit zu bestimmen, indem Kolonien gezählt werden, die auf selektiven und nicht-selektiven Medien entstehen. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die eine genetische Kontrolle der Translokationsbildung durch Einzelstränge zeigen, d.h. ein Knien durch Veränderungen in der Häufigkeit der Ho-stimulierten Translokationsbildung in Stämmen verschiedener Genotypen.

Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf die Folgen der therapeutischen Strahlenexposition von Krebspatienten, da DNA-Doppelstrangbrüche und Translokationsbildung die primären Folgen dieser Behandlung sind. Um das Verfahren zur Bestimmung der Ho-stimulierten Translokationsfrequenzen zu beginnen, inokulieren Sie 10 bis 20 unabhängige Ein-Milliliter-Kulturen mit Y-Peak-Glycerinlactat-Medium mit Einzelkolonien des gewünschten Genotyps und inkubieren die Kulturen über Nacht bei 30 Grad Celsius auf einem Rotator. Wenn die Kulturen die gewünschte Zelldichte erreicht haben, fügen Sie den Kulturen 20 % Galaktose bis zu einer Endkonzentration von 2 % hinzu. Die Galaktose induziert die Expression der Ho-Endonuklease, die Doppelstrangbrüche an der Anamnese delta fünf prim Allel auf Chromosom drei leitet und drei delta drei prim Allel auf Chromosom 15 hat, die vier Stunden lang bei 30 Grad Celsius auf einem Rotator inkubieren.

Der nächste Schritt ist entscheidend für den Erfolg des Verfahrens. Eine sorgfältige Verdünnung und Beschichtung der Kulturen ist zwingend erforderlich. Wenn Sie Translokationsfrequenzen erhalten, die ausreichend reproduzierbar sind, um statistisch signifikante Vergleiche zwischen Stämmen verschiedener Genotypen zu ermöglichen: Nach vierstündiger plattengerechter Verdünnung der Kulturen auf ein Medium, an dem Histidin fehlt, sowie auf YPD td, inkubieren etwa 100 bis 200 Kolonien pro Platte die Platten bei 30 Grad Celsius für zwei bis drei Tage.

Wenn Kolonien entstehen, kann die Translokationshäufigkeit bestimmt werden. Die Platingierungseffizienz vor und nach der Induktion der Ho-Endonuklease-Expression zeigt an, ob das Vorhandensein oder Fehlen eines der Translokationschromosomen die Fähigkeit beeinflusst, die DSB-Bildung zu überleben. Dabei wird eine Kopie von Chromosom drei und Chromosom 15 fragmentiert, um die Effizienz der Beschichtung vor der Induktion zu bestimmen.

Entfernen Sie zunächst ein Aliquot von Zellen aus jeder Übernachtkultur und bestimmen Sie die Zellzahl durch Zählung mit einem Hämozytometer. Verwenden Sie dann eine geeignete Verdünnung, um etwa 100 bis 200 Zellen auf YPD zu plattieren, und inkubieren Sie sie zwei bis drei Tage lang bei 30 Grad Celsius, bis Kolonien entstehen. Geben Sie 20 % Galaktose zu den verbleibenden Kulturen bis zu einer Endkonzentration von 2 % und inkubieren Sie vier Stunden lang bei 30 Grad Celsius, um die Effizienz der Beschichtung nach der Induktion zu bestimmen.

Nach vier Stunden Induktion wird aus jeder Kultur ein Aliquot der Zellen entnommen und die Zellzahl mit dem Hämozytometer bestimmt. Zählplatte von etwa 100 bis 200 Zellen mit einer geeigneten Verdünnung auf YPD, zwei bis drei Tage bei 30 Grad Celsius inkubieren, bis Kolonien entstehen. Sobald Kolonien auf den Platten entstehen, kann die Beschichtungseffizienz bestimmt werden. Mutmaßliche translokationstragende Klone können mittels Southern Blot untersucht werden.

Bei diesem Verfahren wird genomische DNA verwendet, die aus einer einzigen Hiss plus rekombinanter Kolonie aus jedem unabhängigen Versuch hergestellt wurde, etwa vier Mikrogramm jeder DNA-Probe mit BAM H, einer Restriktionsendonuklease, separater BAM H, einer verdauten Fragmente auf einem 0,7%aros she und dann auf eine positiv geladene Nylonmembran übertragen, die mit einer P32-markierten Sonde hybridisiert wurde, die durch zufälliges Priming mit einem 1,8 KILOBASE BMH, einem BMH, einem genomischen Klon, der das HIS enthält, erhalten wurde drei Gene. Visualisieren Sie DNA-Fragmente durch Autoradiographie oder Phospho-Bildgebung. Eine andere Möglichkeit, mutmaßliche translokationstragende Klone zu untersuchen, ist die Analyse von Chromosomendiagrammen.

Die Chromosomen werden zunächst aus ausgewählten Hiss plus Rekombinanten in Aros Plugs getrennten Chromosomen auf einem 1%Aros-Gel in einem Kontur eingespannten homogenen elektrischen Feld oder Chef bei 14 Grad Celsius präpariert. Als Parameter werden folgende Parameter verwendet: erster Block 14 Grad Celsius, 72. Schaltzeit und 15 Stunden bei sechs Volt Zentimeter, zweiter Block 14 Grad Celsius, 122. Schaltzeit und 11 Stunden bei sechs Volt pro Zentimeter. Nach Abschluss der Elektrophorese visualisieren Sie die Chromosomen, indem Sie das Gel 30 Minuten lang mit AUM-Bromid färben, gefolgt von einer Bestrahlung mit UV und einem Zurückhalten und destilliertem Wasser übertragen die Chromosomen durch Kapillarwirkung auf eine positiv geladene Membran.

Denaturierende Bedingungen hybridisieren mit P 32-markierter Sonde, die durch zufälliges Priming mit einem 1,8 Kilobase bam H, einem bam H, einem genomischen Klon mit dem Hiss erhalten wurde. Drei Gene visualisieren Chromosomen durch Autoradiographie oder Phospho-Bildgebung. Die Häufigkeit chromosomaler Translokationen kann berechnet werden, indem die Anzahl der phototrophen Histaminkolonien durch die Gesamtzahl der lebensfähigen Zellen dividiert wird, die durch Plattierung auf YPD bestimmt wird.

In diesem Beispiel beträgt die berechnete Rekombinationshäufigkeit etwa 3%Der Assay für ho-stimulierte Translokationsfrequenzen kann unter Verwendung von Stämmen verschiedener Genotypen durchgeführt werden, um Unterschiede in der Fähigkeit zur Reparatur von Doppelstrangbrüchen durch Einzelstrang zu vergleichen. Ein Knien, wie in dieser repräsentativen Grafik dargestellt. Die Translokationshäufigkeiten, die sowohl selektiv als auch nicht-selektiv mit dem RAD 51 delta null homozygot erhalten wurden, unterschieden sich statistisch von denen, die unter den entsprechenden Bedingungen mit dem Wildtyp-Stamm sowohl vor als auch nach der Induktionsplattierung erhalten wurden.

Die Effizienz wird bestimmt, indem die Gesamtzahl der lebensfähigen koloniebildenden Zellen durch die Gesamtzahl der Zellkörper in der Kultur dividiert wird, die durch die Anzahl der Hämozytometer bestimmt wird, wie in dieser Tabelle vor und nach der Induktionsplatinierung gezeigt. Die Effizienz unterschied sich bei Wildtyp-Zellen nicht signifikant, was darauf hindeutet, dass das Vorhandensein oder Fehlen eines der Translokationschromosomen die Überlebensfähigkeit nicht beeinflusst. DSB-Formation.

Mutmaßliche translokationstragende Klone können durch genomische Southern-Blot-Analyse untersucht werden. Eine grafische Darstellung der relevanten Chromosomen vor und nach der Translokationsbildung ist hier dargestellt. Größen von Restriktionsfragmenten, die relevante Sequenzen enthalten, die durch den Verdau genomischer DNA von Eltern- und rekombinanten Stämmen erzeugt und auf Blots durch Hybridisierung mit einem 1,8 Kilobase BAM H nachgewiesen wurden.

Seine drei genomischen Klone sind in Kilobasenpaaren für die Southern-Blot-Analyse aufgeführt. Genomische DNA wird mit BMH-1-Endonuklease verdaut und mit einer P 32-markierten 1,8-Kilobase hybridisiert. HIS drei Sonden zur Visualisierung dieser diagnostischen Fragmente.

0,8 Kilobasen, HIS, drei Delta, 201,7 Kilobasen, Zischen, drei Delta, drei Primzahlen, vier Kilobasen, T, 3, 15, 5 Kilobasen, T 15, drei und acht Kilobasen, Zischen, drei Delta, fünf Primzahlfragmente. Bahn A ist das übergeordnete Diploid. Bahn B ist eine rekombinante Hiss plus nicht-reziproke Translokation und Spur C ist eine his plus reziproke Translokation.

Die rekombinante chromosomale BLO-Analyse kann auch zur Untersuchung von translokationstragenden Klonen eingesetzt werden. Intakte Chromosomen, die in Aros-Plugs hergestellt werden, werden durch Kochelektrophorese getrennt und das Gel mit einem Iridiumbromid gefärbt und unter UV-Licht sichtbar gemacht. Die getrennten Chromosomen werden dann zu Nylon gelottet und mit der P 32-markierten 1,8-Kilobase hybridisiert.

Seine drei Sonden zur Visualisierung des 1,1 Megabasen, des intakten Chromosoms 15,8 Megabasen, T 15, des Chromosoms mit drei Translokationen, des Chromosoms mit 0,6 Megabasen T drei, des 15-Translokationschromosoms und des intakten Chromosoms mit 0,3 Megabasen, des intakten Chromosoms drei. Lane A ist das bereitgestellte übergeordnete Element. Spur B ist A seine plus nicht-reziproke Translokationsrekombinante, und Spur C ist eine seine plus reziproke Translokationsrekombinante.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Häufigkeit der Translokationsbildung nach mehrfachen Ho-stimulierten Doppelstrangbrüchen bestimmen können.