Freisetzung von Dopamin an den einzelnen präsynaptischen visualisiert FFNs

Der fluoreszierende falsche Neurotransmitter. FFN 511 ist der fluoreszierende Monoamin, der als Substrat für den synaptischen physikalischen Monoamin-Transporter wirken kann, wenn er auf Gehirnschnitte aufgebracht wird. FN 511 wird über den Monoamin-Transporter von dopaminergen synaptischen Vesikeln aufgenommen und kann verwendet werden, um die Transmitterfreisetzung direkt aus präsynaptischen Endigungen von monoaminergen Neuronen – wie jenen im Striatum – sichtbar zu machen. Die Transmitterfreisetzung aus den Endigungen ist im Schnitt als Abnahme punktförmiger fluoreszierender Signale sichtbar.

In diesem Video werden 250 Mikrometer dicke koronare Slicen mit einem Vibratom präpariert, mit FFN 511 gefärbt und mittels eines Multiphotonen-Laser-Mikroskops abgebildet. Es werden Experimente zur Detonierung gezeigt, die eine frequenzabhängige Heterogenität der iCal-Freisetzung offenbaren. Hallo, ich bin HU aus dem Labor von David in der Abteilung für Neurologie an der Columbia University.

Hallo, ich bin Minerva, ebenfalls vom Soldier-Labor. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Markierung von Dopamin-Axonenendigungen in Gehirnschnitten mit fluoreszierenden falschen Neurotransmittern. In unserem Labor verwenden wir dieses Verfahren, um die Freisetzung von Dopamin zu untersuchen.

Beginnen wir also. Vor der Herstellung akuter Schneiden des Saliens muss die künstliche zerebrospinale Flüssigkeit (A CSF) mit Sauerstoff angereichert und mindestens 15 Minuten vor der Entnahme des Gehirns mit Eis gekühlt werden. Die A CSF muss eiskalt und mit Sauerstoff angereichert bleiben. Während der Dissektion wird das gesamte Gehirn aus der Maus entnommen und auf dem Vibrom-Schneidetisch befestigt, wobei als Klebstoff „Crazy Glue“ verwendet wird. Die Entnahme und Montage des Gehirns müssen innerhalb von zwei Minuten erfolgen.

Füllen Sie die Schale mit gekühltem, mit Sauerstoff angereichertem ACSF und schneiden Sie koronare Hirnschnitte mit einer Dicke von 250 Mikrometern zwischen +1,54 und +0,623 mm. Es werden Lochschnitte erhalten, die mit einer Nadel in sechs halbe Schnitte zerteilt werden können. Inkubieren Sie die Hirnschnitte in mit Sauerstoff angereichertem ACSF bei Raumtemperatur für mindestens eine Stunde, während die Hirnschnitte inkubiert werden.

In oxygenierter A-CSF bereiten Sie die 10-Mikromolar-FFN-511-Ladelösung zu, indem Sie die 10-Millimolar-FFN-511-Stammlösung zur A-CSF hinzufügen. Danach bereiten Sie eine Lösung von hundert Mikromolar A-D-V-A-S-E-P sieben in A-CSF vor und oxygenieren beide Lösungen mindestens 15 Minuten lang, bevor sie einzeln in die Schnitte gegeben werden. Inkubieren Sie jeden Gehirnschnitt 30 Minuten lang bei Raumtemperatur mit der FFN-511-Ladelösung.

Als Nächstes entfernen Sie das an das extrazelluläre Gewebe gebundene Di, indem Sie die beladene Schnittprobe 30 Minuten lang bei Raumtemperatur in mit Sauerstoff angereicherter 100 Mikromolar Advers, sieben A CSF inkubieren. Die Schnitte sind nun bereit für die Bildgebung. Die FFN 511-Färbung wird in den Schnitten mithilfe eines Prairie Ultima Multiphotonen-Laserscanningmikroskops untersucht. Platzieren Sie den mit FFN 511 beladenen Schnitt in der Aufzeichnungskammer und überführen Sie ihn mit mit Sauerstoff angereichertem A CSF bei einer Flussrate von ein bis zwei Milliliter pro Minute. Bringen Sie anschließend eine Platinharfe mit Nylonfäden auf dem Schnitt an, um Bewegungen zu minimieren.

Um die Bewegung während des Experiments weiter zu minimieren, lassen Sie die Schnitte vor der Bildaufnahme mindestens 10 Minuten im Kammerpuffer stabilisieren. Visualisieren und lokalisieren Sie den dorsalen Striatum AUM mittels Helligkeitsbeleuchtung unter einem 10x-Wasserimmersionsobjektiv, und platzieren Sie die bipolar verdrehten Wolframelektroden in diesem Bereich, um ein Stimulationsexperiment durchzuführen. Der inaktive Bildaufnahmebereich liegt innerhalb von 300 Mikrometern.

Zwischen den beiden Spitzen der stimulierenden bipolarer Elektrode wird dieser Bereich in der Mitte des Sichtfeldes platziert. Das Bild der mit FFN 511 markierten SAL-Terminale wird unter einem 63×-Wasser-Immersion-Ultraviolett-Objektiv aufgenommen. FFN 511 wird mit einem Mai-Tai-Laser von Spectral Physics bei 760 Nanometern angeregt. Die optimale Fluoreszenz der SAL-Terminale wird mithilfe eines Bandpassfilters erfasst. Die Bilder werden im 12-Bit-Format mit interessierenden Bereichen von 75 × 75 Mikrometer und einer Auflösung von 512 × 512 Pixeln aufgenommen. Ein Beispielbild mit SAL-Dopamin-Terminalen, die mit FFN 511 markiert sind, ist hier dargestellt.

Die FFN 511-Markierung kann entweder durch hohe Konzentrationen von Kaliumchlorid-Amphetsulfat oder durch elektrische Stimulation im Kaliumchlorid-Retentionsversuch entfernt werden, wenn eine Kaliumchlorid-haltige ACSF-Lösung auf das Gehirnschnittpräparat aufgebracht wird; die FFN 511-Markierung verschwindet innerhalb von vier Minuten. Nehmen Sie XYZT-Bilder auf, um die FFN 511-Retention über die Zeit bei FFN 511-Färbung durch elektrische Stimulation zu verfolgen. Erstellen Sie eine Kontroll-Zeitreihe des Zack vor der Stimulation über mindestens fünf Minuten, um eine minimale Bewegung des Schnitts und kein Photobleichen durch den Laser sicherzustellen; dies erfolgt nach der Aufnahme der Kontrollbilder.

Setzen Sie die XYZT-Bildgebung fort, während die Stimulation mit Frequenzen von einem, vier oder 20 Hertz beginnt; Reize werden lokal auf das Striatum mittels eines Isof-Lex-Stimulusisolators angewendet, der von einem Master-Eight-Impulsgenerator über bipolare Elektroden ausgelöst wird. Dieses Video zeigt die Freisetzung von FFN 511 während der Exozytose in einem SAL-Hirnschnittpräparat. Nach Abschluss der Beladung von FFN 511 in das SAL werden eine starke Markierung im Striatum, eine schwache Markierung in der Großhirnrinde und keine Markierung im Corpus callosum beobachtet.

Die selektive Markierung von Dopamin-Axonalendigungen kann durch hohes Kaliumchlorid hervorgerufen werden, wie in diesen repräsentativen Bildern vor Kaliumchlorid und zwei Minuten nach der Applikation von 70 Millimolar Kaliumchlorid gezeigt. Eine CSF-Ausscheidung der FFN 511-Markierung kann ebenfalls durch Amphetamin erreicht werden. Dieses Bild zeigt die FFN 511-Markierung im Striatum vor der Gabe von Amphetamin.

Während dieses Bild den Striatum 20 Minuten nach der Freisetzung mit 20 Mikromolar Amphetamin zeigt, veranschaulichen diese Aufnahmen die Freisetzung von FFN 511 nach lokaler elektrischer Stimulation, wobei die FFN-511-Markierung im Striatum vor der Stimulation sowie 217 Sekunden und 514 Sekunden nach Beginn der Stimulation bei vier Hertz dargestellt ist. Diese Grafik der normalisierten Fluoreszenzintensität über die Zeit zeigt, dass die Freisetzung von FFN 511 abhängig von Calcium und der Stimulationsfrequenz ist. Kontrollen, dargestellt durch nicht ausgefüllte Dreiecke, erhielten keine Stimulation. Die Freisetzung mit Cadmiumchlorid, dargestellt durch nicht ausgefüllte Kreise, war identisch mit den unbehandelten Kontrollen.

Die Abnahmekurven für jede Stimulationsfrequenz, dargestellt durch die farbigen Kreise, wurden mit einer einfachen exponentiellen Abklingfunktion angepasst, und die Halbwertszeiten wurden als Tau durch Naut 0,693 berechnet. Wir haben Ihnen soeben gezeigt, wie man einen fluoreszierenden Kraft-Neurotransmitter FFN fünf 11 in Dopamin-Terminale im akuten al-Schnitt lädt und wie man ihn durch hohes Kalium freisetzt und die Stimulation auslöst. Dies ist die erste Methode, die entwickelt wurde, um die Freisetzung von Neurotransmittern optisch auf der Ebene einzelner synaptischer Terminale zu untersuchen.

Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, die Schnitte sehr gesund zu halten, und auf die Beladezeit, Hintergrundausbleichung und Bewegungsartefakte zu achten; die Schnitte zeigen eine gute FFN fünf 11-Anfärbung und können bis zu vier Stunden nach der Schnittpräparation abgebildet werden. Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.