Name: Freisetzung von Dopamin an den einzelnen präsynaptischen visualisiert FFNs (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-08-31T11:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 37 s
Description: Erfahren Sie die Visualisierung von Dopaminfreisetzung an präsynaptischen Endigungen mit FFN 511 in akuten Hirnschnitten. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung neurotransmitter Dynamik in Echtzeit.

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D. Sames dank der G. Harold &amp; Leila Y. Mathers Charitable Foundation und der Columbia University Initiativen in Science and Engineering. D. Sames und D. Sulzer danken der McKnight Foundation for The McKnight Technologische Innovationen in Neuroscience-Preis D. Sulzer dank NIDA, NIMH, und die Picower und Morbus Parkinson Foundations. H. Zhang dank NARSAD. RH Edwards dank der Michael J. Fox Foundation, der National Parkinson Foundation, NIDA und NIMH. Wir danken Robert Burke für 6-OHDA-Injektionen und Beratung, Mark Sonders für nützliche Diskussion, Merek Siu für Bildanalyse-Programmierung, und Jan Schmoranzer für technische Unterstützung bei der TIRF-Mikroskopie-Setup.

Diese Methode wurde in der Forschung in gemeldet verwendet <a href="http://www.sciencemag.org/cgi/content/full/324/5933/1441">Gubernator et al., Science 324 (5933). 1441-1444 (2009)</a> . 1. Vorbereitung akuten striatalen Scheiben <ol><li> Vor der Zubereitung akute striatalen Scheiben, muss man mit Sauerstoff die künstliche Liquor (ASCF) und Chill es mit Eis für mindestens 15 Minuten vor dem Gehirn Extraktion. Halten Sie das ACSF eiskalt und Sauerstoff während der Präparation. ACSF (in mM): NaCl 125, KCl 2,5, NaHCO 3 26, CaCl 2 2,4, MgSO4 1,3, KH 2 PO 4 0,3, Glucose 10, HEPES 5, pH 7,3-7,4, 290-295 mOsm. </li><li> Enthaupten männliche Maus ohne Narkose. </li><li> Entpacken Sie das ganze Gehirn der Maus, und montieren Sie ihn auf der Vibratom Tablett auf dem Vibratom mit Krazy ® Kleber platziert. Brain-Extraktion und Montage müssen innerhalb von 2 Minuten durchgeführt werden. Während dieser Zeit müssen Sie die ACSF Eis kalt zu halten und mit Sauerstoff zu halten das Gewebe gesund. </li><li> Cut koronalen striatalen Hirnschnitten bei 250μm Dicke zwischen Bregma 1,54 bis 0,62 1. Drei ganze Scheiben wird erhalten, die dann in 6 halbe Scheiben mit einer Nadel geschnitten werden. </li><li> Inkubieren Sie die Hirnschnitten in Sauerstoff ACSF bei Raumtemperatur für mindestens 1 Stunde vor Sonde loading. Slices zeigen gute FFN511 Laden und bleiben für die Bildgebung bis zu 4 Stunden nach der Scheibe Vorbereitung aktiv. </li></ol> 2. Loading FFN511 <ol><li> Bereiten FFN511 loading-Lösung (10 um FFN511 in ACSF); bereiten auch 100 &amp;mgr; ADVASEP-7 in ACSF. Alle Lösungen sollten frisch zubereitet werden und mit Sauerstoff versorgt, mindestens 15 Minuten vor dem Laden in die Scheiben. </li><li> Individuell inkubieren Scheibe mit FFN511 loading Lösung für 30 Minuten bei Raumtemperatur. </li><li> Dann entfernen Sie den Farbstoff gebunden an extrazelluläre Gewebe durch Inkubation der beladenen Scheibe in Sauerstoff 100 &amp;mgr; ADVASEP-7 ACSF für 30 Minuten bei Raumtemperatur 2. Slices sind nun bereit für die Bildgebung. </li></ol> 3. Imaging FFN511 in den Hirnschnitten Imaging von FFN511 in den Scheiben wird mit Multiphotonen-Laser-Scanning-Mikroskop. Wir sind mit einem Prairie Ultima Multiphotonen Laser Scanning Mikroskop (Wir waren mit einem Zeiss LSM 510 NLO Multiphotonen Laser Scanning Mikroskop zuvor und einige Ergebnisse wurden mit dem Zeiss-Mikroskop erhalten). <ol><li> Legen Sie die FFN511 belasteten Scheibe in der Aufnahme Kammer (RC-27L, Warner) und superfuse mit sauerstoffreichem ACSF bei einer Flussrate von 1-2 ml pro Minute. Dann legen Sie eine Platin Harfe mit Nylon-Saiten auf der Scheibe, um die Bewegung während des Experiments zu minimieren. Zur weiteren Minimierung Bewegung, damit die Scheibe für mindestens 10 Minuten in der Kammer vor der Aufnahme zu stabilisieren. </li><li> Visualisieren und suchen Sie das dorsale Striatum mit Hellfeld Lumineszenz unter einem 10x Wasser Immersionsobjektiv. </li><li> Ort und Lage der bipolaren twisted Wolframelektroden in dieser Region, wenn die Durchführung einer Stimulation zu experimentieren. Die ideale Imaging-Bereich ist in 300 um zwischen den beiden Spitzen der anregenden bipolaren Elektrode befindet. Platzieren Sie diesen Bereich in der Mitte des Gesichtsfeldes. </li><li> Bild FFN511-markierten striatalen Klemmen unter einem 63x (0,9 NA) Eintauchen in Wasser UV-Ziel. FFN511 wird bei 760 nm mit einem Mai Tai Laser von Spectral Physik und optimale Fluoreszenz der striatalen Klemmen gespannt wird durch ein Bandpassfilter (480-520 nm) zu sehen. Die Bilder werden in 12-Bit-Format mit 75 x 75 um regions of interest in 512 x 512 Pixel Auflösung erfasst. Für stimuliert Entfärben Experimente ist es, für z-Achse verschieben, ein z-Serie von 5-7 Bildern, von 1 um in der z-Ebene getrennt, Ausgleich für jeden Zeitraum erhalten. </li></ol> 4. FFN511 Entfärbung Die FFN511 Etikett kann entweder durch eine hohe Konzentration von KCl (wir verwenden 70 mM KCl), (+)-Amphetamin Sulfat (AMPH, 20 uM) oder elektrische Stimulation entfärbt werden. In der KCl Entfärben Experiment, wenn eine hohe Kalium-ACSF Lösung der Hirnschnitt angewendet wird, die FFN511 Label destains innerhalb von 2 Minuten. Rekord xyz-t Bilder FFN511 Entfärbung im Laufe der Zeit zu verfolgen. Im Folgenden werden elektrische Stimulation abhängig Dopamin-Terminal Entfärben: <ol><li> So verfolgen FFN511 Entfärbung im Laufe der Zeit sind xyz-t Bilder aufgezeichnet. Um sicherzustellen, minimale Bewegung der Scheibe (weniger als 4 um in z-Achse) und kein Ausbleichen durch den Laser-, Steuer-Zeitreihen Bilder der z-Stapel sollte für mindestens 5 Minuten vor der Stimulation erreicht werden. Andernfalls ist die Laserleistung. </li><li> Im Anschluss an diese Kontrolle Bilder, weiterhin die xyz-t Bildgebung während Start der Stimulation bei Frequenzen von 1, 4 oder 20 Hz. Stimuli bei 1, 4 oder 20 Hz (300 us x 1 mA) sind das Striatum vor Ort durch eine Iso-Flex Stimulus Isolator durch einen Master-8 Impulsgeber (AMPI, Jerusalem, Israel) unter Verwendung von bipolaren Elektroden ausgelöst angewendet. Zur Minimierung derdie Variation in der Depolarisation der Freigabe Seiten haben wir eine Stimulation verwendete Protokoll Anwendung 150% der maximalen Intensität der Stimulation durch Cyclovoltammetrie bestimmt. </li><li> Verwenden Sie geeignete Software für die Bildanalyse. In unserem Labor verwenden wir Image J (Wayne Rosband, National Institutes of Health, Rockville, MD) und speziell geschriebenen Software IDL (Research Systems, Boulder, CO), um die puncta Fluoreszenz und die Änderungen mit Time3 quantifizieren. </li></ol> Represenative Ergebnisse Abbildung 1 zeigt FFN511 Laden in striatalen Scheibe ist nun abgeschlossen. Repräsentative Bilder mit 10x und 60x objektiv sind in Abb. 1 dargestellt. Die selektive Markierung von Dopamin-Terminals kann durch 20 uM Amphetamin entfärbt werden. Abbildung 2 zeigt Entfärbung FFN511 Kennzeichnung durch hohe KCl. Abbildung 3 zeigt Entfärbung FFN511 Kennzeichnung durch lokale elektrische Stimulation. <img src="/files/ftp_upload/1562/1562fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1 FFN511 Etiketten Dopamin-Terminals in Live-kortikalen-striatalen akuten Scheiben (A) Markierung von FFN511 in akuten leben kortikalen-striatalen Scheibe:.. Reichlich Kennzeichnung im Striatum (STR), spärlicher Kennzeichnung in Cortex (CTX) und kein Label in Corpus Callosum (CC). Maßstab:. 100 &amp;mgr; m (B) der Entfärbung FFN511 aus dem Striatum von Amphetamin. Left-Panels: vor Amphetamin, rechts-Panels: nach 20 Minuten von 20 uM Amphetamin. Maßstab: 10 pm. <img src="/files/ftp_upload/1562/1562fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. Entfärbung von FFN511 Kennzeichnung durch hohe KCl. FFN511 Kennzeichnung ist innerhalb von 2 min Anwendung von 70 mM KCl in ACSF entfärbt. Maßstab: 10 um. <img src="/files/ftp_upload/1562/1562fig3.jpg" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 3. Frequenzabhängige Entfärbung FFN511 Kennzeichnung im Striatum. (A) Lokale Stimulation bei 4 Hz ergab Entfärbung von den Terminals entfernt. Stimulation begann bei t = 0 ist. Maßstabsbalken: 5 m (B) Entfärbung von FFN511 bei 4 Hz ist Ca 2 + - und frequenzabhängig.. Kontrollen erhielten keine Stimulation (153 puncta von 3 Scheiben). Entfärbung mit Cadmiumchlorid (200 uM) war identisch mit unstimulierten Kontrollen (475 puncta von 5 Scheiben). Die Entfärbung Kurven für jede Stimulationsfrequenz wurden von einem einzigen exponentiellen Funktion und die Halbwertszeit (t 1 / 2) fit Werte berechnet τ x 0,693 (1 Hz: 765 puncta von 9 Scheiben, 4 Hz: 410 puncta von 7 Scheiben, 20 Hz: 416 puncta von 6 Scheiben). Bitte beachten Sie die Video-Aufnahme von 2-Photonen-Mikroskopie von FFN511 Entfärbung während Exozytose in einem striatalen Hirnschnitten Vorbereitung.

<ol><li>Franklin, K. B. J., Paxinos, G. The mouse brain in stereotaxi coordinators. , Academic Press. San Diego. (1997).</li>
<li>Kay, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+synaptic+activity+in+intact+brain+and+slices+with+FM1-43+in+C.+elegans%2C+lamprey%2C+and+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging synaptic activity in intact brain and slices with FM1-43 in C. elegans, lamprey, and rat.</a> Neuron. 24, 8098-8117 (1999).</li>
<li>Bamford, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterosynaptic+dopamine+neurotransmission+selects+sets+of+corticostriatal+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Heterosynaptic dopamine neurotransmission selects sets of corticostriatal terminals.</a> Neuron. 42, 653-653 (2004).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

In diesem Video zeigen wir eine Methode, um Neurotransmission optisch sichtbar unter Verwendung von fluoreszierenden Dopamin-Analoga. FFN511 ist die erste Generation der FFNs wir entwickelt haben. Es war zwar indem sie auf die neuronale vesikulären Monoamin-Transporter (VMAT2), die Monoamin-Neurotransmittern führt aus dem Zytoplasma in synaptische Vesikel, insbesondere Etiketten Dopamin im Striatum und vermutet, Katecholamin-und / oder Serotonin-Terminals in der Hirnrinde (wie in der Wissenschaft gezeigt ausgelegt Papier), wird eine entsprechende Belastungsdauer entscheidend für die Spezifität, da FFN511 ist relativ hydrophob. Wir fanden, dass die Inkubation länger als 40 Minuten wird in umfangreichen spezifische Färbung in striatalen Scheiben führen. Die Spezifität kann unkompliziert durch Entfärbung mit einer hohen Konzentration von KCl, die die Freisetzung von FFN innerhalb funktionaler synaptischen Vesikeln sollte Ursache ermittelt werden. Die Exposition der Scheibe zu FFN511 für weniger als 15 Minuten wird in schwachen Fluoreszenzsignal aufgrund unzureichender Belastung der Farbstoff in den Terminals führen. In diesem Protokoll, verwenden wir 100 &amp;mgr; ADVASEP-7, um den Farbstoff gebunden an extrazelluläre Gewebe zu entfernen. Dieser Schritt ist nicht notwendig, aber wenn es weggelassen wird, muss die Auswaschzeit in ACSF verlängert werden. Zusammenfassend, abhängig von der Vorbereitung Sie gewählt haben, werden Sie brauchen, um die Konzentration und Belastungsdauer zu modifizieren, um eine optimale Kennzeichnung zu bestimmen.

<table><tbody><tr><td>FFN511 (8-(2-Amino-ethyl)-2,3,5,6-tetrahydro-1H,4H-11-oxa-3a-aza-benzo[de]anthracen-10-one)</td><td>Columbia University - Dalibor Sames Labor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ADVASEP-7 </td><td>CyDex</td><td>AR-OA7-005</td><td></td></tr><tr><td>RC-27L Aufzeichnungskammer</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0375</td><td></td></tr><tr><td>PELCO PrepEze 6-Loch-Halter</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>36157-1</td><td>Für Schnittpräparat-Inkubation</td></tr><tr><td>Master-8 Impulsstimulator und Iso-Flex Stimulationsisolator</td><td>AMPI</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

freisetzung von dopamin an den einzelnen präsynaptischen visualisiert ffns

Dopamine Release at Individual Presynaptic Terminals Visualized with FFNs

Das Nervensystem überträgt Signale zwischen den Neuronen über die Freisetzung von Neurotransmittern im synaptischen Vesikel Fusion. Zur Beobachtung Neurotransmitter Aufnahme und Abgabe von einzelnen präsynaptischen direkt, haben wir fluoreszierende falsche Neurotransmitter als Substrate für die synaptische Vesikel Monoamin-Transporter. Mit diesen Sonden Bild Freisetzung von Dopamin im Striatum, machten wir einige Beobachtungen relevant für synaptische Plastizität. Wir fanden, dass der Anteil von synaptischen Vesikeln Freisetzung von Neurotransmittern pro Stimulus abhängig von der Reizfrequenz war. Ein kinetisch unterschiedliche &quot;Reserve&quot; synaptischer Vesikel Bevölkerung war nicht unter diesen experimentellen Bedingungen beobachtet. Eine Frequenz-abhängige Heterogenität der präsynaptischen zeigte sich, dass abhängig war zum Teil auf D2 Dopamin-Rezeptoren, was auf einen Mechanismus für die frequenzabhängige Codierung der präsynaptischen Auswahl. Hui Zhang und Niko G. Gubernator trugen gleichermaßen zu dieser Arbeit.

Ein neues Mittel, um Neurotransmission optisch messen unter Verwendung von fluoreszierenden Dopamin-Analoga.

Freisetzung von Dopamin an den einzelnen präsynaptischen visualisiert FFNs

Das Nervensystem überträgt Signale zwischen Neuronen über die Freisetzung von Neurotransmittern während der Fusion synaptischer Vesikel. Um die Aufnahme von Neurotransmittern und ...

Der fluoreszierende falsche Neurotransmitter. FFN 511 ist der fluoreszierende Monoamin, der als Substrat für den synaptischen physikalischen Monoamin-Transporter wirken kann, wenn er auf Gehirnschnitte aufgebracht wird. FN 511 wird über den Monoamin-Transporter von dopaminergen synaptischen Vesikeln aufgenommen und kann verwendet werden, um die Transmitterfreisetzung direkt aus präsynaptischen Endigungen von monoaminergen Neuronen, wie jenen im Stratum S, zu visualisieren. Die Transmitterfreisetzung aus den Endigungen ist im Schnitt als Abnahme der punktförmigen fluoreszierenden Signale sichtbar.In diesem Video werden 250 Mikrometer dicke koronare Schnitte mit einem Vibratom präpariert, mit FFN 511 gefärbt und mittels Multiphotonen-Laser-Mikroskop aufgenommen. Dargestellt werden Experimente zur Detention, die eine frequenzabhängige Heterogenität der iCal-Freisetzung offenbaren. Hallo, ich bin HU aus dem Labor von David in der Abteilung für Neurologie an der Columbia University.Hallo, ich bin Minerva, ebenfalls vom Soldier-Labor. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Markierung von Dopamin-Axonenendigungen in Gehirnschnitten mit fluoreszierenden falschen Neurotransmittern. In unserem Labor verwenden wir dieses Verfahren, um die Freisetzung von Dopamin zu untersuchen.Beginnen wir also. Vor der Herstellung akuter Schnitte des Salläppchens muss man die künstliche zerebrospinale Flüssigkeit (A CSF) mit Sauerstoff anreichern und sie mindestens 15 Minuten vor der Entnahme des Gehirns mit Eis kalt stellen. Während der gesamten Zeit muss die A CSF eiskalt und mit Sauerstoff angereichert bleiben. Während der Sektion wird das gesamte Gehirn aus der Maus entnommen und mit Sekundenkleber auf dem Vibram-Tablett befestigt, das auf dem Vibromesser platziert ist. Die Gehirnentnahme und -montage müssen innerhalb von zwei Minuten erfolgen.Füllen Sie die Schale mit gekühltem, mit Sauerstoff angereichertem ACSF und schneiden Sie koronare gerade Hirnschnitte mit einer Dicke von 250 Mikrometern zwischen +1,54 und +0,623 mm. Es werden Lochschnitte erhalten, die mit einer Nadel in sechs halbe Schnitte zerteilt werden können. Inkubieren Sie die Hirnschnitte in mit Sauerstoff angereichertem ACSF bei Raumtemperatur für mindestens eine Stunde, während die Hirnschnitte inkubiert werden.In oxygenierter A-CSF bereiten Sie die 10-Mikromolar-FFN-511-Ladelösung zu, indem Sie die 10-Millimolar-FFN-511-Stammlösung zur A-CSF hinzufügen. Danach bereiten Sie eine Lösung von hundert Mikromolar A-D-V-A-S-E-P sieben in A-CSF vor und oxygenieren beide Lösungen mindestens 15 Minuten lang, bevor sie einzeln in die Schnitte gegeben werden. Inkubieren Sie jeden Gehirnschnitt 30 Minuten bei Raumtemperatur mit der FFN-511-Ladelösung.Als Nächstes entfernen Sie das an das extrazelluläre Gewebe gebundene Di, indem Sie die beladene Schnittprobe 30 Minuten lang bei Raumtemperatur in mit Sauerstoff angereicherter 100 µM Advers, sieben A CSF inkubieren. Die Schnitte sind nun bereit zur Bildgebung. Die FFN 511-Färbung wird in den Schnitten mithilfe eines Prairie Ultima Multiphotonen-Laserscanningmikroskops untersucht. Platzieren Sie den mit FFN 511 beladenen Schnitt in der Aufzeichnungskammer und überströmen Sie ihn mit mit Sauerstoff angereichertem A CSF mit einer Flussrate von ein bis zwei Millilitern pro Minute. Anschließend platzieren Sie eine Platinharfe mit Nylonfäden auf dem Schnitt, um Bewegungen zu minimieren.Während des Experiments die Bewegung weiter minimieren, indem die Schnitte vor der Bildaufnahme mindestens 10 Minuten im Kammerpuffer stabilisieren. Den dorsalen Striatum AUM mit Hellfeldbeleuchtung unter einem 10x-Wasserimmersionsobjektiv sichtbar machen und lokalisieren, anschließend die bipolar verdrehten Wolframelektroden in diesem Bereich positionieren, um ein Stimulationsexperiment durchzuführen. Der ruhende Bildaufnahmebereich liegt innerhalb von 300 Mikrometern.Zwischen den beiden Spitzen der stimulierenden bipolarer Elektrode platzieren Sie diesen Bereich in der Mitte des Sichtfeldes. Das Bild der mit FFN 511 markierten Sal-Terminale wird unter Verwendung eines 63×-Wasser-Immersion-Ultraviolett-Objektivs aufgenommen. FFN 511 wird mit einem Mai-Tai-Laser von Spectral Physics bei 760 Nanometern angeregt. Die optimale Fluoreszenz der SAL-Terminale wird mithilfe eines Bandpassfilters erfasst. Nehmen Sie die Bilder im 12-Bit-Format mit interessierenden Bereichen von 75 × 75 Mikrometer bei einer Auflösung von 512 × 512 Pixeln auf. Ein Beispielbild mit SAL-Dopamin-Terminalen, die mit FFN 511 markiert sind, ist hier dargestellt.Die FFN 511-Markierung kann entweder durch hohe Konzentrationen von Kaliumchlorid-Amphetsulfat oder durch elektrische Stimulation im Kaliumchlorid-Retentionsversuch entfernt werden, wenn eine Kaliumchlorid-haltige ACSF-Lösung auf das Gehirnschnittpräparat aufgebracht wird; die FFN 511-Markierung verschwindet innerhalb von vier Minuten. Nehmen Sie XYZT-Bilder auf, um die FFN 511-Retention über die Zeit bei der FFN 511-Färbung mittels elektrischer Stimulation zu verfolgen. Erstellen Sie eine Kontroll-Zeitreihe des Zack vor der Stimulation über mindestens fünf Minuten, um eine minimale Bewegung des Schnitts und keinen Photobleaching-Effekt durch den Laser sicherzustellen; anschließend erfolgt die Aufnahme der Kontrollbilder.Setzen Sie die XYZT-Bildgebung fort, während die Stimulation mit Frequenzen von einem, vier oder 20 Hertz beginnt; Reize werden lokal auf das Striatum mittels eines Isof-Lex-Stimulationsisolators angewendet, der von einem Master-Eight-Impulsgenerator über bipolare Elektroden ausgelöst wird. Dieses Video zeigt die Freisetzung von FFN 511 während der Exozytose in einem SAL-Hirnschnittpräparat. Nach Abschluss der Beladung von FFN 511 in das SAL werden eine starke Markierung im Striatum, eine schwache Markierung in der Großhirnrinde und keine Markierung im Balken beobachtet.Die selektive Markierung von Dopamin-Axonalendigungen kann durch hohes Kaliumchlorid hervorgerufen werden, wie in diesen repräsentativen Bildern vor Kaliumchlorid und zwei Minuten nach der Applikation von 70 Millimolar Kaliumchlorid gezeigt. Eine CSF-Ausscheidung der FFN 511-Markierung kann ebenfalls durch Amphetamin erreicht werden. Dieses Bild zeigt die FFN 511-Markierung im Striatum vor der Gabe von Amphetamin.Während dieses Bild den Striatum 20 Minuten nach der Freisetzung mit 20 Mikromolar Amphetamin zeigt, veranschaulichen diese Aufnahmen die Freisetzung von FFN 511 nach lokaler elektrischer Stimulation, wobei die FFN-511-Markierung im Striatum vor der Stimulation sowie 217 Sekunden und 514 Sekunden nach Beginn der Stimulation bei vier Hertz dargestellt ist. Diese Grafik der normalisierten Fluoreszenzintensität über die Zeit zeigt, dass die Freisetzung von FFN 511 abhängig von Calcium und der Stimulationsfrequenz ist. Kontrollen, dargestellt durch nicht ausgefüllte Dreiecke, erhielten keine Stimulation. Die Freisetzung mit Cadmiumchlorid, dargestellt durch nicht ausgefüllte Kreise, war identisch mit den unbehandelten Kontrollen.Die Abnahmekurven für jede Stimulationsfrequenz, dargestellt durch die farbigen Kreise, wurden mit einer einfachen exponentiellen Abklingfunktion angepasst, und die Halbwertszeiten wurden als Tau durch Naut 0,693 berechnet. Wir haben Ihnen soeben gezeigt, wie man einen fluoreszierenden Kraft-Neurotransmitter FFN fünf 11 in Dopamin-Terminale im akuten al-Schnitt lädt und wie man ihn durch hohes Kalium freisetzt und die Stimulation auslöst. Dies ist die erste Methode, die entwickelt wurde, um die Freisetzung von Neurotransmittern optisch auf der Ebene einzelner synaptischer Endigungen zu untersuchen.Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, die Schnitte sehr gesund zu halten, und auf die Beladezeit, Hintergrundausbleichung und Bewegungsartefakte zu achten; die Schnitte zeigen eine gute FFN-five-11-Beladung und können bis zu vier Stunden nach der Schnittpräparation abgebildet werden. Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.

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Biologie

Dieser Bericht zeigt eine Technik zur mechanischen Isolation von einzelnen Neuronen lebensfähig halten befestigt präsynaptischen boutons. Vibrodissociated Neuronen haben die Vorteile der schnellen Produktion, ausgezeichnete pharmakologische Kontrolle und verbesserten Raum-Klemme, ohne Einfluss von benachbarten Zellen. Diese Methode kann für die Bildgebung der synaptischen Elementen und Patch-Clamp-Aufzeichnung verwendet werden.

Vibrodissociation von Neuronen aus Nager Hirnschnitten zu Study Synaptic Transmission and Image präsynaptischen

Eine Live-Fluoreszenz-Imaging-Technik, um den Nachschub und die Mobilisierung der spezifischen synaptischen Vesikel (SV)-Pools in zentralen Nervenendigungen quantifizieren beschrieben. Zwei Runden SV Recycling sind in der gleichen Nervenenden Bereitstellung eines internen Kontrollsystems überwacht.

Quantitative Analyse der synaptischen Vesikel Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Nervenzellen Granulat mit FM Dyes

Mit Fast-Scan-Cyclovoltammetrie zu elektrisch evozierten präsynaptischen Dopamin-Dynamik in striatalen Hirnschnitten zu messen.

Präsynaptische Dynamics in striatalen Hirnschnitten mit Fast-Scan-Cyclovoltammetrie

Inkubieren Sie die Scheibe in aCSF, das fluoreszierende falsche Neurotransmitter oder FFNs enthält.

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Dieses Video zeigt die Implantation von Elektroden und Kanülen in einer anästhesierten Ratte, um die Dopaminfreisetzung im Nucleus accumbens mit einem Potentiostaten und die Infusion von Medikamenten zur Modulation der dopaminergen Aktivität im ventralen tegmentalen Bereich zu messen.

Überwachung der Dopaminfreisetzung in einem Rattenmodell mit VTA-Manipulation des dopaminergen Neuronenrezeptors

Wir beschreiben die Verwendung von Styryl FM Farbstoffe Bild synaptischen Vesikel-Recycling in der funktionellen Nervenenden. Dieses Protokoll kann nicht nur beschworen, sondern auch spontan und Miniatur synaptischen Tätigkeiten angewendet werden. Das Protokoll erweitert die Vielzahl von synaptischen Ereignisse, die effektiv ausgewertet werden können.

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Vierdimensionalen (4D)-Bildgebung verwendet werden, um das Verhalten und die Interaktionen zwischen den zwei Arten von Endosomen in lebenden Wirbeltier-Nervenenden zu studieren. Bewegung dieser kleinen Strukturen in drei Dimensionen gekennzeichnet, wodurch Bestätigung von Veranstaltungen wie Endosomen Fusion und Exozytose.

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Kombinierte Infusion und Stimulation mit zyklischer Fast-Scan-Voltammetrie (CIS-FSCV) zur Beurteilung der ventralen Tegmental-Area-Rezeptor-Regulation von phasischem Dopamin

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