Aorten-Ring-Test

Das übergeordnete Ziel des Aortenring-Assays ist es, ein flexibles experimentelles System bereitzustellen, bei dem Blutgefäße aus ganzen Stücken der Maus-Aorta in einer 3D-Matrix gekeimt werden. Dies wird erreicht, indem man bei einer Maus zunächst die thorakale Aorta präpariert und sie dann vorsichtig von umliegendem Gewebe befreit. Scheiben der sauberen Aorta oder Aortenringe werden in einzelne Vertiefungen einer 48-Well-Platte gelegt, die jeweils Basalmatrixextrakt oder BME enthalten, die zu Kuppeln geformt sind.

Ein zusätzlicher Tropfen BME umschließt den Ring in einer 3D-Struktur. Die Matrix kann ein beliebiges experimentelles Reagenz seiner Wahl enthalten. Nach mehrtägiger Inkubation kann beobachtet werden, wie Gefäße aus Aortenringen sprießen und das angiogene Potenzial der Testsubstanzen beurteilt werden kann.

Hallo, ich bin Karen Bein aus dem Labor von Dr.E. Lewis in der Abteilung für klinische Biochemie an der Beon University of the Negative in Be Sheva Israel. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren für den Aortenring-Assay an der Maus. Mit diesem Verfahren untersuchen wir in unserem Labor die Auswirkungen verschiedener Materialien auf die Blutgefäßbildung.

Also lasst uns loslegen. Um diesen Vorgang zu starten, lassen Sie den Basalmatrix-Extrakt oder BME auf Eis oder bei vier Grad Celsius auftauen. Halten Sie den BME nach dem Auftauen weiterhin kalt, um zu verhindern, dass er sich wieder verfestigt.

Am Tag des Experiments wurde eine sechs bis sieben Wochen alte Maus durch eine Standard-Ketamin-Injektion eingeschläfert, wobei Xylazin schnell durch die Halsarterien blutete, gefolgt von einer Gebärmutterhalsluxation. Beginnen Sie den Eingriff, indem Sie das Tier mit 70 % Ethanol in einer sterilen Laminar-Flow-Haube abwischen. Als nächstes führen Sie bei der Arbeit unter einem Präparierfernrohr mit einer sterilen Pinzette und einer Präparierschere einen vertikalen Schnitt der Haut durch und öffnen die Bauchfellwand.

Der Schnitt sollte so erfolgen, dass das obere Brustbein freigelegt wird, wo auch der Brustkorb durchtrennt und das Zwerchfell entfernt wird. Schieben Sie vorsichtig alle Organe beiseite, legen Sie die thorakale Aorta entlang der Wirbelsäule vollständig frei, wobei die Aorta freiliegt, und führen Sie eine dünne, sterile Pinzette zwischen der Aorta und der Wirbelsäule ein. Spreizen Sie die Pinzette und heben Sie die Aorta nach und nach aus ihrem Bett, wobei Sie das Brustsegment vom Rest der Aorta trennen.

Jetzt, da die Aorta durchtrennt ist, schneiden Sie sie mit einer scharfen Schere von der Maus ab, beginnend am Ende, das sich in unmittelbarer Nähe der Nierengefäße befindet und in der Nähe des Herzens endet. Legen Sie die herausgeschnittene thorakale Aorta in eine Petrischale, die mit kaltem, sterilem PBS gefüllt ist. Nachdem die Aorta entfernt wurde, können die Aortenringe mit zwei sterilen Pinzetten und unter einem Fernglas vorbereitet werden.

Reinigen Sie die thorakale Aorta vom umgebenden Fettgewebe. Achten Sie darauf, die Aorta nicht zu beschädigen und halten Sie sie nur an den Rändern fest. Die Aorta sollte wiederholt in die PBS-haltige Petrischale getaucht werden, um eine Austrocknung zu verhindern, bis sie schließlich gereinigt wird.

Jetzt, da die thorakale Aorta sauber ist, verwenden Sie eine chirurgische Klinge und arbeiten Sie unter dem Fernglas, um die Aorta gleichmäßig in ein Millimeter große Ringe zu schneiden. Achten Sie mit einem Lineal, das als Führung unter der Schnittfläche platziert ist, darauf, eine neue Klinge zu verwenden und sie von Zeit zu Zeit auszutauschen, um die Schärfe zu erhalten. Die Enden der Aorta werden nicht verwendet Nachdem Sie jeden Ring abgeschnitten haben, verwenden Sie eine Pinzette, um ihn sehr vorsichtig in eine neue Schale mit kaltem PBS zu übertragen.

Platzieren Sie alle Ringe in derselben PBS-haltigen Platte, um sicherzustellen, dass der Assay randomisiert ist. Da jedes Segment der Aorta ein etwas anderes angiogenes Potenzial hat, halten Sie die Ringe auf Eis. Bereiten Sie anschließend die Assay-Platte mit vorgekühlten Pipettenspitzen vor.

Geben Sie in jede Vertiefung in einer 48-Well-Platte etwa einen Tropfen von 150 Mikrolitern kaltem BME, der Tropfen verfestigt sich in der Mitte der Bewegung zu einer Kuppel. Der BME ermöglicht den Transport von Substanzen, die Chemotaxis der Zellen und vor allem die Zelldifferenzierung und -migration, die zur Bildung von Neogefäßen führt. Die Vertiefungen des Perimeters sind mit PBS gefüllt. Um eine BME-Dehydrierung zu vermeiden, lassen Sie den BME-Tropfen 20 bis 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius erstarren. Sobald der BME erstarrt ist, heben Sie vorsichtig mit einer Pinzette einen Aortenring aus der Petrischale heraus, um Schäden zu vermeiden, der Ring sollte in den Lipidtropfen übertragen werden, der sich zwischen den Pinzettenspitzen bildet. Infolge der Oberflächenspannung der Flüssigkeit platzieren Sie einen einzelnen Aortenring in der oberen Mitte jeder Kuppel und inkubieren Sie 10 Minuten lang bei 37 Grad Celsius auf jedem Ring. Fügen Sie weitere 150 Mikroliter BME hinzu und inkubieren Sie 20 bis 30 Minuten lang.

Bei 37 Grad Celsius wird der Ring nun in BME eingeschlossen und untersucht. Der Platte können Materialien zugesetzt werden, um den Assay zu starten. Pres-Ergänzung, die zuvor hergestelltes humanes endotheliales Serum, freies Medium, entweder mit dem Versuchsmaterial oder dem Endothelzellwachstumspräparat als Positivkontrolle für eine Negativkontrolle ergänzt.

Verwenden Sie nur das Medium. Geben Sie 500 Mikroliter des Pres-Ergänzungsmediums in jede Vertiefung und inkubieren Sie sechs bis 12 Tage lang bei 37 Grad Celsius. Während dieser Inkubationszeit untersuchen Sie die Platte unter dem Mikroskop und suchen Sie nach Gefäßen, die aus der Aorta sprießen, und nach fortgeschrittenen reifen Gefäßen, die durch weitere verzweigte Gefäße identifiziert werden.

Sollte sich vom Ringgewebe aus erstrecken und die Ringe zwischen dem sechsten und 12. Tag unter dem Standard-Phasenkontraststereoskop dreidimensional fotografieren. Sammeln Sie außerdem Überstände an verschiedenen Tagen zwischen dem sechsten und 12. Tag und lagern Sie sie bei vier Grad für die Verwendung innerhalb eines Tages oder Eloqua und lagern Sie sie bei minus 20 oder minus 80 für die zukünftige Verwendung. Die Überstände können mit verschiedenen Techniken analysiert werden, wie z. B. Eliza für VGF oder Fettassay für Stickoxidwerte.

Diese Bilder wurden 12 Tage nach dem Platzieren der Ringe in den Vertiefungen und der Inkubation entweder mit einer Kultur, einem Medium in der oberen Bildreihe oder einem EKG, das als Positivkontrolle für das Keimen der Gefäße verwendet wurde, aufgenommen. Im unteren Bereich. Jedes Bild ist ein repräsentativer Schnappschuss von vier der 12 Ringe, der typischerweise im Assay pro Bedingung verwendet wird.

Die Ecke jedes Aortenrings in jeder einzelnen Vertiefung ist schwarz. Auf diese Weise fotografiert, zeigen Aortenringe, die einem EKG ausgesetzt waren, ein Gefäßwachstum, und die Pfeile zeigen auf mehrere der vielen Gefäße, die sich gebildet haben. Jedes Gefäß ist als Kette von Endothelzellen charakterisiert, wobei gelegentliche Verzweigungen darauf hinweisen, dass sie reif sind.

In der Kultur sind keine Keimgefäße zu beobachten. Mittlere Vertiefungen im oberen Bereich, Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie Sie den Aortenkorpassay durchführen, wenn Sie dieses Verfahren durchführen. Es ist wichtig, daran zu denken, genau zu arbeiten und ihre Bedingungen zu verstehen.

Das war's also. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.