Embryobasiertes chemisches Toxizitätsscreen: Bewertung der Auswirkungen auf die Entwicklung von Zebrafischembryonen

- Beginnen Sie damit, 5 Embryonen in E3-Medium in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte zu geben und entfernen Sie das überschüssige Medium mit einer Pipette. Geben Sie Kanamycinhaltiges E3-Medium in jede Vertiefung, um eine Kontamination zu vermeiden. Lassen Sie die Embryonen bei 28 Grad Celsius wachsen.

Verdünnen Sie die interessierende Verbindung mit einem geeigneten Lösungsmittel, wie z. B. DMSO, um mehrere Konzentrationen oder Dosen herzustellen, und testen Sie die Wirkung jeder Dosis auf sich entwickelnde Embryonen. Sobald die Embryonen das gewünschte Stadium erreicht haben, pipettieren Sie jede Stammlösung in einzelne Vertiefungen. Decken Sie den Teller mit einem Deckel ab und schwenken Sie ihn vorsichtig, um den Inhalt zu vermischen. Lassen Sie die Embryonen in der Well-Platte bei 28 Grad Celsius wachsen.

Platzieren Sie die Well-Platte zum gewünschten Zeitpunkt in der Embryonalentwicklung unter einem geeigneten Mikroskop, um den Phänotyp der Embryonen zu untersuchen. Sie können Phänotypen wie Verlust der Augen, verzögertes Wachstum oder Verlust von Melanozyten bei den sich entwickelnden Embryonen beobachten. Im folgenden Protokoll werden wir eine Substanzbibliothek für niedermolekulare Inhibitoren der Vorderhirnentwicklung testen.

- Kleine Molekülbibliotheken werden in der Regel in einer 96-Well-Quellplatte geliefert, wobei jede Verbindung in DMSO als 10-Millimolar-Stamm gelagert wird. Etwa 60 Minuten, bevor die Embryonen das gewünschte Stadium erreichen, tauen Sie eine angemessene Anzahl von 96-Well-Platten auf, die Aliquote kleiner Moleküle enthalten. Notieren Sie sich die Serien- oder andere Identifikationsnummer der Typenschilder. Um die Kondensation auf den Platten zu minimieren, in einer Trockenkammer mit Drierit auftauen.

Schleudern Sie die Platten kurz in einer Tischzentrifuge, die mit einem Multiwell-Plattenadapter ausgestattet ist. Entfernen Sie das Aluminium-Dichtungsband von der Ausgangsplatte. Verdünnen Sie die Verbindungen in der Ausgangsplatte mit einer 12-Kanal-Pipette auf die gewünschte Konzentration mit DMSO. In diesem Protokoll verwenden wir eine Endkonzentration von 0,5 Millimolar und fügen 4,75 Mikroliter DMSO hinzu, um die 10 Millimolare Rohplatte zu verdünnen.

Wenn die Embryonen in der 96-Well-Platte das gewünschte Stadium erreichen, verwenden Sie eine 12-Kanal-Pipette, um 2,5 Mikroliter der Verbindungen von den Ausgangsplatten in die Empfängerplatten mit den Embryonen zu übertragen. Decken Sie die Platten, die jetzt die Embryonen und Verbindungen enthalten, mit Deckeln ab und notieren Sie die Identifikationsnummer der Quellplatten auf den Embryoplatten. Mischen Sie die Platten durch leichtes Schwenken und legen Sie sie in einen 28,5 Grad Celsius heißen Inkubator. Decken Sie jede Quellplatte, die unbenutzte kleine Moleküle enthält, mit Aluminium-Dichtungsband ab und stellen Sie sie zur Langzeitlagerung in einen Gefrierschrank bei minus 80 Grad Celsius.

Formulieren Sie vor dem Ausführen des visuellen Bildschirms ein spezifisches Trefferkriterium. Zum Beispiel kann ein Treffer in einem Screening nach niedermolekularen Inhibitoren der Vorderhirnentwicklung eine Verbindung sein, die den Verlust des Vorderhirns verleiht. Das Fehlen von Augen ist ein einfacher visueller Indikator für den Verlust des Vorderhirns und erfordert keine Fluoreszenz für den Test.

Nehmen Sie zu den gewünschten Zeitpunkten in der Entwicklung die 96-Well-Platten mit compoundbehandelten Embryonen aus dem Inkubator und untersuchen Sie jede Well unter einem Stereomikroskop. Beim Screening auf niedermolekulare Inhibitoren der Vorderhirnentwicklung untersuchen Sie die Platten nach 28 Stunden auf den Verlust des Auges als Marker für die Entwicklungshemmung des Vorderhirns. Notieren Sie die Identität der Platte und die Position der Vertiefung für jede Vertiefung, in der mindestens 3 von 5 Embryonen den vorgeschriebenen Trefferphänotyp aufweisen.

Setzen Sie die 96-Well-Platte wieder in den Inkubator ein. Bestätigen Sie den Verlust von Augen und Vorderhirn nach 48 Stunden. Auch wenn die Embryonen kein Vorderhirn haben, überleben sie mindestens vier Tage. Bestätigen Sie einen potenziellen Treffer, indem Sie die Wirkung der Verbindung in mehreren Dosen erneut testen. Für jede Dosis werden 10 Embryonen in 0,5 Millilitern E3-Medium in einem 48-Well-Plattenformat getestet.

Der Zeitpunkt der Zugabe von Verbindungen für die Wiederholungsprüfung sollte mit dem des ursprünglichen Screenings identisch sein. Ein Treffer wird bestätigt, wenn der ausgelöste Phänotyp bei einer erneuten Prüfung der Substanz dosisabhängig reproduziert wird. Identifizieren Sie schließlich die Trefferverbindung aus der Datenbank der kleinen Moleküle in der chemischen Bibliothek.