Ein Handbuch Kleine Molecule Bildschirm Nähern Hochdurch Mit Zebrafischembryonen

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, ein chemisches Screening in Zebrafischembryonen durch manuelle Probenverarbeitung durchzuführen. Dies wird erreicht, indem adulte Zebrafische zunächst über Nacht in Paarungskammern mit einer Trennwand gesetzt und dann am nächsten Morgen die Trennwand entfernt werden, um die Embryonen zu sammeln. Die nächsten Gruppen von Zebrafischembryonen werden in 96-Well-Platten angeordnet und dann im gewünschten Entwicklungsstadium mit einem Medikament behandelt.

Dann werden die Embryonen entwickelt, mit 4% Paraldehyd fixiert und getestet, um die Auswirkungen kleiner Moleküle auf den interessierenden Entwicklungsprozess zu messen. Die Ergebnisse zeigen Entwicklungsveränderungen, wie z.B. den Zu- oder Verlust von Genexpressionsdomänen, die auf Veränderungen der Sulfat- oder Gewebemorphogenese hinweisen können, die durch die untersuchten kleinen Moleküle verursacht werden. Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf die klinische Behandlung einer Vielzahl von Krankheiten, da potenziell therapeutische Verbindungen identifiziert werden können.

Im Allgemeinen können Personen, die mit dieser Technik noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten haben, da sie die für die Arbeit mit Embryonen erforderliche Geschicklichkeit erwerben müssen, z. B. den Transfer zwischen Multi-Well-Platten ohne Beschädigung. Ich und Eric Donahue, ein Forscher im Labor, um Zebrafisch-Paarungen einzurichten, werden das Verfahren demonstrieren. Verwenden Sie Paarungskammern mit Trennwänden, platzieren Sie erwachsene männliche Zebrafische auf einer Seite der Trennwand und erwachsene weibliche Zebrafische auf der anderen Seite.

Für jede 96-Well-Platte mit kleinen Molekülen, die getestet werden sollen. Richten Sie 25 passende Tanks ein und lassen Sie sie über Nacht stehen. Am nächsten Tag entfernen Sie die Kammer, die jedes Fischpaar trennt, und entnehmen Sie nach einer Stunde mit einem feinmaschigen Sieb die Embryonen, bevor Sie sie mit einer Transferpipette in Petrischalen mit dem Medium E drei legen.

Entfernen Sie Schmutz von den Platten und unter einem Stereoskop. Beobachten Sie jedes Gelege von Embryonen und entfernen Sie unbefruchtete Eizellen. E drei medium umfüllen und durch frisches E drei ersetzen.

Legen Sie dann jede Schale mit Embryonen für zwei Stunden in einen 28,5 Grad Celsius heißen Inkubator. Überprüfen Sie die Platten erneut und entsorgen Sie alle zusätzlichen unbefruchteten Eizellen. Fahren Sie mit der Inkubation der Embryonen bis zum 40%eely-Stadium fort.

Entfernen Sie die chemische Bibliotheksplatte bei minus 80 Grad Celsius. Verwenden Sie Aluminiumfolie, um es abzudecken, und lassen Sie es bei Raumtemperatur mit einer Achtkanalpipette auftauen. Fügen Sie 99 Mikroliter E drei zu den Spalten zwei bis 12 einer 96-Well-Platte hinzu.

Geben Sie dann einen Mikroliter der entsprechenden Verbindungen in die Vertiefungen in den Spalten zwei bis 11 hier, die als Versuchsproben bezeichnet sind. Pipettieren Sie einen Mikroliter DMSO in die Kontrollsäule, die hier als Säule 12 ausgelegt ist. Verwenden Sie Aluminiumfolie, um die Verdünnungsplatte abzudecken, und stellen Sie die chemische Bibliothek wieder in den Gefrierschrank. Nachdem Sie eine Petrischale mit Embryonen im 40%-Epi-Stadium ausgewählt haben, verwenden Sie eine Transferpipette, um etwa 10 Embryonen pro Vertiefung vorsichtig in die Spalten zwei bis 12 von 96 zu platzieren.

Gut anrichten. Verwenden Sie eine Glastransferpipette, um überschüssiges E drei aus jeder Vertiefung zu entfernen und in einen Behälter für flüssige Abfälle auszustoßen. Um die Embryonen chemisch zu behandeln, geben Sie 100 Mikroliter jeder chemischen Verdünnung aus der 96-Well-Platte in die jeweilige Vertiefung der Embryonen, um eine feuchte Kammer mit einem Papiertuch zu schaffen, und geben Sie sie in einen lichtempfindlichen Behälter.

Groß genug, um eine 96-Well-Platte aufzunehmen. Verwenden Sie dann eine Deckenmatte, um die Platte zu versiegeln. Legen Sie es in den lichtempfindlichen Behälter und inkubieren Sie es bei 28,5 Grad Celsius für die gewünschte Zeit.

Um die Chemikalien zu entfernen, fügen Sie 300 Mikroliter E drei zu jeder Reihe der mit Medikamenten behandelten Vertiefungen hinzu. Ziehen Sie dann das Medium ab, bevor Sie die Embryonen mit E drei dreimal waschen, um die Embryonen zu fixieren, übertragen Sie sie in vier beschriftete 24-Well-Platten, platzieren Sie die Pipette vor einem dunklen Hintergrund. Entfernen Sie nach jedem Well-Transfer alle toten Embryonen, um die in der Pipette verbliebenen Embryonen zu identifizieren und ein Crossover zu verhindern.

Ziehen Sie das E drei ab, so dass die Embryonen kaum in Flüssigkeit getaucht werden. Geben Sie dann mit einer Glaspipette jeweils zwei Tropfen à 50 Milligramm pro Milliliter Pronase. Inkubieren Sie die Embryonen fünf Minuten lang, bevor Sie die Vertiefungen bewegen, damit der Corian auseinanderbricht.

Nachdem Sie die Embryonen mit E drei zweimal gewaschen haben, ziehen Sie das restliche E drei ab und entsorgen Sie es. Geben Sie 4%P-F-A-P-B-S in jede Vertiefung und inkubieren Sie die Embryonen über Nacht bei vier Grad Celsius. Führen Sie dann ein Screening von Interesse durch, wie z. B. eine Hole-Mount-in-situ-Hybridisierung, oder wünschen Sie, wie im Textprotokoll beschrieben, die Embryonen aus dem chemischen Screening zu bewerten.

Übertragen Sie sie auf beschriftete 12-Well-Platten, bevor Sie sie mit einem Stereomikroskop wie in diesem Diagramm dargestellt betrachten. Es ist praktisch, dass eine einzelne Person im Laufe von neun Wochen ein chemisches genetisches Screening an etwa 600 Verbindungen durchführt, und diese Zeit kann auf drei Wochen verkürzt werden, wenn sie von drei Personen durchgeführt wird. Auf diese Weise kann die Laborzeit einer oder weniger Personen den Bedarf an Geräten mit hohem Ressourcenverbrauch wie automatisierten Systemen umgehen.

Wie hier gezeigt, wurden Zebrafischembryonen einzelnen Verbindungen aus einer bioaktiven Bibliothek von 50% der Menschen bis 24 HPF unterzogen und dann nach Wunsch mit einem Cocktail aus drei Ribosonden getestet, um Nephronsegmente nachzuweisen. Als Beispiel wird das Grading-System eine Verbindung, die zu einem dramatisch vergrößerten proximalen gewundenen Tubulus oder PCT führte, als Klasse eins kategorisiert, die die Klasse darstellt, die mit dem schwersten Defekt und dem höchsten Maß an Konfidenz in dem beobachteten Phänotyp verbunden ist. Die Verbindung würde dann als PCT der ersten Klasse annotiert

Darüber hinaus bietet diese Klassifizierung eine einfache und schnelle Möglichkeit, ein kleines Molekül von Interesse zu beschreiben, einschließlich der Schwere seiner Wirkung auf den Organismus, der Region, die von dem Medikament betroffen ist, und der Art und Weise, wie die Region betroffen ist. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, Ihre Embryonen zum richtigen Entwicklungszeitpunkt zu platzieren. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man ein manuelles chemisches Screening mit Zebrafischembryonen durchführt.