CTC-Immunfluoreszenz-Assay : Eine Technik zur Charakterisierung zirkulierender Tumorzellen

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Krebsforschung

0 Ansichten • 4:05 Min. • April 30th, 2023

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- Verdünnen Sie zunächst die isolierten zirkulierenden Tumorzellen oder CTCs auf die erforderliche Konzentration mit einer Anti-Bindungslösung, die die Zellen vor Flüssigkeitsscher- und Druckschäden schützt. Montieren Sie als Nächstes einen mit Polylysin beschichteten Objektträger und eine Zytozentrifugen-Filterkarte zu einer Zytozentrifugen-Trichterbaugruppe. Übertragen Sie die Zellsuspension in den Trichteranschluss der Anordnung, gefolgt von einer Zytozentrifugation.

Die Zentrifugalkraft konzentriert und lagert eine Monoschicht von Zellen auf einer kreisförmigen Fläche auf dem Objektträger ab. Isolieren Sie den mit Zellen abgelagerten Bereich mit einem Silikonisolator. Nach dem Trocknen fixieren Sie die Zellen mit Paraformaldehyd. Als nächstes inkubieren Sie die Zellen mit einer geeigneten Blocklösung, die Proteine enthält, die leicht an unspezifische Bindungsstellen auf der Zelloberfläche binden.

Markieren Sie nun die Zellen mit einer fluoreszenzmarkierten Antikörperlösung. Die Fluorophor-markierten Antikörper erkennen und binden an spezifische Zielmoleküle auf der Zelloberfläche. Waschen Sie die Probe, um ungebundene Antikörper zu entfernen. Fügen Sie eine Einbettlösung hinzu, um die Probe für die Bildgebung vorzubereiten.

Verwenden Sie ein Fluoreszenzmikroskop, um das Licht zu detektieren, das von den Antikörper-Fluorophor-Konjugaten emittiert wird, die an die Zielantigene auf CTCs gebunden sind. In diesem Protokoll werden wir einen Immunfluoreszenz-Assay von CTCs in Patientenproben von nicht-kleinzelligem Lungenkrebs durchführen.

- Für die Immunfluoreszenzfärbung zählen Sie die Zellen in einem Hämozytometer und verdünnen Sie die angereicherte Probe auf 1 mal 10 bis fünfte Zellen pro 100 Mikroliter mit einer Konzentration von 0,2 % Anti-Bindungslösung. Verwenden Sie anschließend ein mit 50 Mikrolitern Anti-Bindungslösung getränktes Wattestäbchen, um die Kontur der Probenkammer zu befeuchten, und platzieren Sie einen Objektträger aus Polylysinglas in der Probenkammer.

Schließen Sie die Kammer und pipettieren Sie dreimal auf und ab, um eine Mikropipettenspitze mit der Bindelösung zu beschichten, bevor Sie die Probe in den letzten 100 Mikrolitern des Überstands wieder suspendieren. Übertragen Sie die Zelllösung in die Probenkammer und zytospinnen Sie die Probe in einer speziellen Zentrifuge mit 400 Umdrehungen pro Minute für 4 Minuten bei geringer Beschleunigung.

Am Ende der Zentrifugation legen Sie einen Silikonisolator um den Abscheidungsbereich und lassen den Objektträger zwei Minuten lang unter einer mikrobiologischen Sicherheitswerkbank trocknen. Fixieren Sie dann die zytogesponnene Probe mit 100 Mikrolitern 4 % Paraformaldehyd für 10 Minuten bei Raumtemperatur, gefolgt von drei 2-minütigen Waschgängen mit 200 Mikrolitern PBS pro Waschgang bei Raumtemperatur.

Nach dem letzten Waschen wird jede unspezifische Bindung durch eine 30-minütige Inkubation in einem Blockierungsreagenz bei Raumtemperatur blockiert, gefolgt von der Markierung mit 100 Mikrolitern der gewünschten Antikörperlösung. Legen Sie den beschrifteten Objektträger in eine 100 x 15 Milliliter große Petrischale auf ein mit 2 Millilitern sterilem Wasser angefeuchtetes Stück saugfähiges Papier und stellen Sie die Schale über Nacht verschlossen und lichtgeschützt bei 4 Grad Celsius auf.

Am nächsten Morgen waschen Sie die Probe dreimal mit PBS, wie gezeigt, und montieren Sie die Probe mit 10 Mikrolitern einer geeigneten Eindecklösung und einem Glasdeckglas. Anschließend versiegeln Sie den Deckglas mit klarem Nagellack.

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Zuletzt aktualisiert: 1 August 2026