PAR-Clip - Ein Verfahren zur Transkriptom-weiten die Bindungsstellen des RNA-bindende Proteine Identifizieren
2. Juli 2010
RNA-Transkripte sind Gegenstand intensiver posttranskriptioneller Regelung, die durch eine Vielzahl von trans-agierenden RNA-bindende Proteine (RBPs) vermittelt wird. Hier präsentieren wir Ihnen eine verallgemeinerbare Methode zur Identifizierung und präzise auf Transkriptom-weiten Skala der RNA-Bindungsstellen von RBPs.
Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die transkriptomweiten Bindungsstellen von RNA-Bindungsproteinen oder RVPs zu bestimmen. Dies wird erreicht, indem zunächst photoreaktive Nukleosidanaloga für die in vivo-Markierung von naszierenden Transkripten verwendet werden. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, RNA und RNA-bindende Proteine mit 365 Nanometer UV-Licht zu vernetzen.
Der dritte Schritt des Verfahrens besteht darin, das untersuchte RNA-Bindungsprotein immunzu präzipitieren und die Vernetzung mit RNA wiederherzustellen. Der letzte Schritt des Verfahrens besteht darin, die RNA in eine CD-NA-Bibliothek und eine tiefe Sequenz umzuwandeln. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die transkriptomweite Bindungsstellen der RVPs zeigen und die Definition des RNA-Erkennungselements und seiner Bindungspräferenzen ermöglichen.
Hallo, mein Name ist Marcus Hoffner aus dem Labor von Tom SEL an der Rockefeller University in New York. Heute zeigen wir eine Methode namens Par-Lip oder Photoable Rib Nucleosid Analog Enhanced Crosslinking and Immunoprecipitation. Wir verwenden dieses Verfahren in unserem Labor, um auf einem Transkriptom anhand seiner Skala Bindungsstellen von RNA-Bindungsproteinen sowie deren Bindungsmotive und -präferenzen zu identifizieren.
Okay, fangen wir an. Die In-vivo-UV-Vernetzung beginnt in einer Laminar-Flow-Haube. In diesem Protokoll werden wir als beispielhaftes Modell mit steriler Technik markierte IGF-Zellen mit zwei BP-Eins-Zellen verwenden.
Expandieren Sie HEK 2 93 Zellen, die das Flag HA stabil exprimieren, markiert IGF zwei BP, eine unter Kontrolle eines Tet-Repressors in HEK 2 93 Zellkulturmedium zwischen 100 und 400 mal 10 auf die sechsten Zellen und züchten Sie sie auf etwa 80 % Co-Fluenz. 14 Stunden vor dem Crosslinking hatten die Zellen das photoreaktive Ribosid-Analogon für Thiouridin oder für SU direkt an das Zellkulturmedium. Alternativ können sechs Guineen oder sechs SG nach Zugabe des photoreaktiven Ribosids verwendet werden, um die Expression der Flagge HA zu induzieren, die mit IGF markiert ist, zwei BP eins durch die Zugabe von Doxycyclin Zellen werden dann über Nacht im Zellinkubator inkubiert.
Dekantieren Sie anschließend das Wachstumsmedium. Waschen Sie die Zellen dann einmal mit 10 Millilitern eiskalter, phosphatgepufferter Kochsalzlösung pro Platte. Entfernen Sie dann das PBS vollständig durch Dekantieren.
Legen Sie die unbedeckten Platten auf ein Tablett mit Eis und bestrahlen Sie sie mit 365 Nanometer UV-Licht in einem Spreizlinker 2, 400 UV-Vernetzer oder gleichwertig im Anschluss an die UV-Strahlung, kratzen Sie die Zellen mit einem Gummipolizisten in einem Milliliter PBS pro Platte ab. Füllen Sie die Zellen in 50-Milliliter-Zentrifugationsröhrchen und zentrifugieren Sie sie fünf Minuten lang bei 500 g bei vier Grad Celsius. Verwerfen Sie den Supernamen und behalten Sie das Zellpellet.
Zu diesem Zeitpunkt können die Zellpellets in flüssigem Stickstoff schockgefroren und mindestens 12 Monate lang bei minus 80 gelagert werden. Um mit dem Verfahren fortzufahren, reus Sie das Pellet in drei Volumina eines X NP 40 Lysepuffers und inkubieren Sie es 10 Minuten lang auf Eis. Das Zelllysat wird durch Zentrifugation bei 13.000 g für 15 Minuten bei vier Grad Celsius klargestellt.
Nach der Zentrifugation reinigen Sie das Lysat weiter, indem Sie es durch einen Fünf-Mikron-Membranspritzenfilter filtrieren. Zum Schluss wird die RNA T one bis zu einer Endkonzentration von einer Einheit pro Mikroliter zugegeben und 15 Minuten lang in einem Wasserbad bei 22 Grad Celsius inkubiert. Anschließend die Reaktion fünf Minuten lang auf Eis abkühlen lassen.
Im Anschluss an die in vivo UV-Vernetzung. Bereiten Sie die magnetischen Kügelchen für die Immunpräzipitation vor. Übertragen Sie 10 Mikroliter dyna beads protein G magnetische Partikel pro mil Zelllysat in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen.
Legen Sie dann die Tube mit den Perlen für ein bis zwei Minuten auf einen Magnetständer. Entfernen Sie den Überstand und geben Sie einen Milliliter Citratphosphatpuffer in das Röhrchen, während es sich auf dem Magnetabscheider befindet. Verschließen Sie dann das Röhrchen und wirbeln Sie die Probe vortexen, um die Kügelchen wieder zu resuspendieren.
Kurz zentrifugieren, um die im Röhrchendeckel verbliebenen Kügelchen aufzufangen. Wiederholen Sie diese Wäsche mit einem zusätzlichen Milliliter Citratphosphatpuffer. Nach der Waschreus werden die Kügelchen und der Citratphosphatpuffer in einer Menge suspendiert, die dem Zweifachen des ursprünglichen Volumens der Rübensuspension entspricht.
Fügen Sie dann 0,25 Milligramm Anti-Flag M hinzu, zwei monoklonale Antikörper pro Milliliter Beat-Suspension. Inkubieren Sie die Suspension nach der Inkubation 40 Minuten lang bei Raumtemperatur, waschen Sie die Kügelchen zweimal in einem Milliliter Citratphosphatpuffer, wie zuvor beschrieben, diese Wäsche dient dazu, alle ungebundenen Antikörper nach dem Waschen Resus zu entfernen, suspendieren Sie die Kügelchen und Citratphosphatpuffer wie vor vier. Um mit der Immunpräzipitation zu beginnen, fügen Sie die frisch zubereiteten Antikörper-konjugierten magnetischen Kügelchen zu den RNAs T eins-behandeltem Zelllysat hinzu.
Füllen Sie die Mischung in 15-Milliliter-Zentrifugationsröhrchen um und drehen Sie sie eine Stunde lang bei vier Grad Celsius. Nach der Inkubation werden die magnetischen Kügelchen gesammelt, die überstehenden Resuspendierungskügelchen in einem Milliliter IP-Waschpuffer entsorgt und in 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen überführt. Waschen Sie die Kügelchen wie zuvor beschrieben zweimal in einem Milliliter IP-Waschpuffer.
Nach der letzten Wäsche werden die Kügelchen im ursprünglichen Bead-Volumen des IP-Waschpuffers wieder aufgehängt. Geben Sie dann RNAT eins bis zu einer Endkonzentration von 100 Einheiten pro Mikroliter hinzu. Inkubieren Sie die Perlensuspension 15 Minuten lang in einem 22 Grad Celsius warmen Wasserbad.
Anschließend die Suspension fünf Minuten lang auf Eis abkühlen lassen. Waschen Sie die Kügelchen anschließend dreimal in einem Milliliter Waschpuffer mit hohem Salzgehalt. Dann resuspendieren Sie die Kügelchen in einem ursprünglichen Beadsvolumen aus Dephosphorylierungspuffer.
Geben Sie alkalische Phosphatase aus dem Kälberdarm bis zu einer Endkonzentration von 0,5 Einheiten pro Mikroliter hinzu und inkubieren Sie die Suspension 10 Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Waschen Sie die Kügelchen zweimal in einem Milliliter Phosphatase-Waschpuffer und dann noch zweimal in Polynukleotidkinase oder PNK-Puffer ohne DTT. Zum Schluss resuspendieren Sie die Kügelchen in einem ursprünglichen Perlenvolumen aus PNK-Puffer.
Um mit der Radiomarkierung von vernetzter RNA zu beginnen. Gamma 32 PATP und T vier PNK zu einem ursprünglichen Bead-Volumen der frisch zubereiteten Bead-Suspension geben. Inkubieren Sie die Suspension 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius.
Als nächstes fügen Sie der Suspension ein nicht-radioaktives TP hinzu und inkubieren sie weitere fünf Minuten bei 37 Grad Celsius. Waschen Sie dann die magnetischen Kügelchen fünfmal mit 800 Mikrolitern PNK-Puffer ohne DTT. Zum Schluss resuspendieren Sie die Kügelchen in 70 Mikrolitern SDS-Seite.
Mit einem Ladepuffer inkubieren Sie die Radiomarkierungssuspension fünf Minuten lang in einem Wärmeblock bei 95 Grad Celsius, um die immunpräzipitierten RNA-Bindungsproteine mit der vernetzten RNA zu denaturieren und freizusetzen. Entfernen Sie dann die magnetischen Kügelchen auf dem Separator und geben Sie das Super Natin in ein sauberes 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Laden Sie 40 Mikroliter des Suade pro Vertiefung eines novox bis triss vier bis 12 % vorgefertigten Polyacrylamid-Gels und lassen Sie das Gel 55 Minuten lang bei 200 Volt laufen. Sobald das Gel abgelaufen ist, zerlegen Sie die Gelkammer und zerlegen Sie die Platten, wobei das Gel auf einer Platte montiert bleibt, um die Ausrichtung des Gels auf dem Phospho-Imager-Papierausdruck zu erleichtern.
Implantieren Sie drei winzige radioaktive Gelstücke asymmetrisch an den Gelecken. Wickeln Sie das Gel in eine Plastikfolie wie z. B. Saran-Folie ein, um eine Kontamination zu vermeiden. Setzen Sie das Gel eine Stunde lang einem leeren Phospho-Imager-Bildschirm aus und dann auf einem Phospho-Imager.
Richten Sie als Nächstes das Gel auf dem Phospho-Imager-Ausdruck aus, indem Sie die implantierten Gelstücke zur Orientierung verwenden. Schneiden Sie die Banden aus, die der erwarteten Größe des RNA-Bindungsproteins oder RBP entsprechen. Übertragen Sie die Bänder auf eine MIDI-Röhre des DTU-Dialysators und fügen Sie 800 Mikroliter eines XSDS-Laufpuffer-Elektroelues hinzu.
Der vernetzte R-N-A-R-B-P-Komplex bei 100 Volt für zwei Stunden gemäß den Anweisungen des Herstellers. Im Anschluss an die Elektroelution. Fügen Sie Proteinase K-Puffer und Proteinase K hinzu und inkubieren Sie die Lösung 30 Minuten lang bei 55 Grad Celsius.
Die RNA wird durch Extraktion mit saurem Phenolchloroform-Isoamylalkohol zurückgewonnen, gefolgt von einer Chloroform-Extraktion. Fügen Sie dann einen Mikroliter Glykogen hinzu und fällen Sie die RNA aus, indem Sie drei Volumen Ethanol hinzufügen. Zum Schluss lösen Sie das resultierende Pellet in 10,5 Mikrolitern Wasser auf.
Sobald die RNA zurückgewonnen wurde, führen Sie sie durch ein Standard-CDNA-Bibliotheksvorbereitungsprotokoll und führen Sie eine sorgfältige bioinformatische Analyse der Sequenzlesevorgänge durch. Repräsentative Ergebnisse für einen Par-Clip, der mit HK 2 93 Zellen durchgeführt wurde, die die Flagge H ha exprimieren, die IGF zwei BP und eins markiert haben, sind mit den photoreaktiven Nukleosidanaloga vier SU und sechs SG dargestellt: Die Vernetzungseffizienz des alternativen photoreaktiven Ribosids sechs SG ist im Allgemeinen niedriger als für vier su. Die geringere Vernetzungseffizienz könnte zu einem höheren Hintergrund von Sequenzen führen, die aus Fragmenten reichlich vorhandener zellulärer RNAs stammen, und daher sollten zunächst mehr Zellen für das Experiment verwendet werden.
Verschiedene photoreaktive Uridin-Analoga mit par-Clips werden mit herkömmlichen UV-2-, 54-Nanometer-Vernetzungen oder Clips verglichen, wie hier zu sehen. Die Vernetzung von RNA-Proteinen mit UV 2 54 Nanometern hat eine begrenzte Vernetzungseffizienz. Die Intensität der entsprechend großen radioaktiven Bande zeigt an, ob das Par-Clip-Experiment funktioniert hat und ob genügend RNA isoliert wurde, um ein kleines RNA-Sequenzierungsprotokoll zu durchlaufen.
Die Häufigkeit charakteristischer Mutationen in den sequenzierten Reads nach bioinformatischer Analyse ist ein Hinweis auf erfolgreich vernetzte Sequenzen. Diese Mutationen sind T-zwei-C-Übergänge bei Verwendung von vier SU-Übergängen und G-zwei A-Übergänge bei Verwendung von Erfolg. G.Das definierende Merkmal von Park Lip ist die Möglichkeit, den Ort der Quervernetzung abzuleiten, indem eine charakteristische Mutation in den CD-NA-Bibliotheken bewertet wird, die aus den wiedergefundenen RNAs hergestellt wurden.
Dies ermöglicht die einfache Trennung des Signals, das von spezifisch gebundenen RNAs abgeleitet wird, vom Rauschen von Sequenzen, die von co-isolierten Fragmenten reichlich vorhandener zellulärer RNAs abgeleitet sind. Deshalb haben wir Ihnen heute gezeigt, wie Sie RNA-Segmente isolieren können, die spezifisch von RNA-bindenden Proteinen erkannt werden. Wenn Sie dieses Verfahren ausführen.
Es ist wichtig, RNAs frei zu arbeiten. Das war es also. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei den Experimenten.
Übersicht
Dieser Artikel stellt eine Methode zur Identifizierung von RNA-Bindungsstellen von RNA-bindenden Proteinen (RBPs) auf Transkriptom-weiter Ebene vor. Das Verfahren nutzt photoreaktive Nukleosidanaloge und UV-Vernetzung, um die Untersuchung von RBP-Wechselwirkungen mit RNA zu ermöglichen.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Zellbiologie
- Molekularbiologie
Hintergrund
- RNA-Transkripte unterliegen einer umfassenden posttranskriptionellen Regulation.
- RNA-bindende Proteine (RBPs) spielen eine entscheidende Rolle bei dieser Regulation.
- Die Identifizierung der Bindungsstellen von RBPs ist entscheidend für das Verständnis der RNA-Biologie.
- Aktuelle Methoden weisen möglicherweise einen Mangel an Präzision oder einer anwendbaren Abdeckung des gesamten Transkriptoms auf.
Zweck der Studie
- Entwicklung einer übertragbaren Methode zur Identifizierung von RBP-Bindungsstellen.
- Verbesserung des Verständnisses von RNA-Erkennungselementen und Bindungspräferenzen.
- Bereitstellung eines Protokolls, das auf verschiedene RNA-bindende Proteine angewendet werden kann.
Verwendete Methoden
- In-vivo-Markierung neu synthetisierter Transkripte mittels photoreaktiver Nukleosidanaloge.
- Vernetzung von RNA und RBPs mittels UV-Licht.
- Immunpräzipitation von RBPs zur Gewinnung vernetzter RNA.
- Tiefensequenzierung von RNA zur Identifizierung von Bindungsstellen.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Identifizierung transkriptomweiter Bindungsstellen für RBPs.
- Definition von RNA-Erkennungselementen und deren Bindungspräferenzen.
- Nachweis der Anwendbarkeit der Methode auf verschiedene Zelltypen.
Schlussfolgerungen
- Die entwickelte Methode bietet einen robusten Ansatz zur Untersuchung von RBP-Interaktionen.
- Sie vertieft das Verständnis der Mechanismen der posttranskriptionellen Regulation.
- Diese Technik kann in verschiedenen Forschungskontexten zur Erforschung der RNA-Biologie eingesetzt werden.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die Identifizierung von RNA-Protein-Interaktionen im gesamten Transkriptom ermöglicht die mechanistische Absicherung von RNA-bindenden Proteintargets in der frühen Entdeckungsphase. PAR-CliP bietet eine mutationsbasierte Signaldiskriminierung, um die Zuverlässigkeit der Zielstrukturen zu erhöhen und falsch-positive Ergebnisse bei Validierungsworkflows für RBPs zu verringern. Dies trägt dazu bei, die Vorhersagegenauigkeit bei der Identifizierung von Leitstrukturen zu verbessern, indem RNA-Erkennungselemente und Bindungspräferenzen in krankheitsrelevanten Systemen geklärt werden.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen durch Kartierung direkter RNA-Bindungsstellen von RBPs, die an der posttranskriptionellen Regulation beteiligt sind.
- Operationaler Wert: Verwendet photoreaktive Nukleosidanaloge (4-SU, 6-SG) und 365 nm UV-Vernetzung, um vorübergehende und stabile Wechselwirkungen in lebenden Zellen zu erfassen.
- Wissenschaftlicher Wert: Definiert RNA-Erkennungselemente und Bindungspräferenzen anhand von T→C- oder G→A-Mutationen in cDNA-Sequenzen und unterscheidet dadurch echtes Signal von Hintergrundrauschen.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erzeugt quantitative, mutationsmarkierte cDNA-Bibliotheken für die Tiefensequenzierung, wodurch die reproduzierbare Detektion von RBP-gebundenen RNA-Fragmenten ermöglicht wird.
- Operationaler Wert: Erzeugt standardisierte, skalierbare Eingabedaten für die bioinformatische Analyse und unterstützt die Bereitschaft des Assays für Target-Engagement-Screenings.
- Wissenschaftlicher Wert: Charakterisiert Bindungspräferenzen und Motivanreicherungen und liefert damit Erkenntnisse für die Entwicklung RNA-zielgerichteter kleiner Moleküle oder Oligonukleotide.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Verbindet RBP-Bindungsstellen mit funktionellen Ergebnissen in krankheitsrelevanten Systemen und unterstützt so die translationale Biomarker-Ausrichtung.
- Operationaler Wert: Funktioniert in verschiedenen Zelltypen (z. B. HEK293) und kann an primäre Zellen oder Zellmodelle von Krankheiten angepasst werden, die markierte RBPs exprimieren.
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht risikoadjustierte Entscheidungen über die Weiterentwicklung, indem die mechanistischen Rollen von RBPs bei der RNA-Stabilität, dem Spleißen oder der Translation geklärt werden.
Pipeline- und Workflow-Integration
PAR-CliP fügt sich in den Entdeckungsprozess von der Target-Validierung über die Identifizierung von Leitverbindungen bis hin zu präklinischen mechanistischen Studien ein und liefert eine Auflösung der Bindungsstellen, die nachgeschaltete Modulationsstrategien informiert.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die Hypothesenprüfung und Klärung von Signalwegen durch Identifizierung direkter RNA-Ziele von RBPs, die krankheitsrelevante Transkripte regulieren.
- Screening: Liefert quantitative, sequenzierungsreife Ergebnisse, die den Vergleich der Bindung unter verschiedenen Bedingungen, bei Mutanten oder nach therapeutischen Störungen ermöglichen.
- Analytik: Beruht auf der bioinformatischen Bewertung charakteristischer Mutationen (T→C, G→A), um die vernetzte RNA von Hintergrundsignalen zu unterscheiden und eine präzise Peak-Detektion zu ermöglichen.
- Translationale Forschung: Verbindet molekulare Bindungsdaten mit funktioneller Kontinuität, indem RBP-Bindungsstellen mit dem Schicksal der RNA in präklinischen Modellen verknüpft werden.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare Plattform zur Profilierung unterschiedlicher RBPs (z. B. IGF2BP1) über Projekte hinweg und reduziert so redundante Methodenentwicklung.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Vorhersagbare Zuverlässigkeit bei der Zielvalidierung, Verringerung mechanistischer Mehrdeutigkeiten bei der Kartierung von RNA-Regulonen.
- Operationaler Wert: Standardisierung durch definierte Vernetzungsbedingungen, mutationsbasierte Filterung und reproduzierbare Bibliotheksherstellung.
- Strategischer Wert: Bessere Go/No-Go-Entscheidungen durch Klärung der Stärke und Spezifität von RBP-RNA-Wechselwirkungen, Verringerung biologischer Risiken in späteren Entwicklungsstadien.
- Portfolio-Wirkung: Risikoadjustierte Priorisierung von RNA-zielgerichteten Therapeutika basierend auf validierten Bindungsstellen und Motivpräferenzen.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in molekularer Klonierung, Zellkultur und UV-Vernetzungsprotokollen.
- Benötigt Zugang zu einem UV-Vernetzer mit 365 nm, Immunpräzipitationsreagenzien und Infrastruktur für Deep-Sequencing.
- Erfordert eine standardisierte Vorgehensweise über Teamgrenzen hinweg hinsichtlich der Dosierung von Analoga, der Vernetzungszeit und der Stringenz der Waschschritte.
- Erfordert Anpassungen beim Wechsel von markierten Überexpressionssystemen zu endogenen oder primären Zellsystemen.
- Praktische Einschränkung: 6-SG weist eine geringere Vernetzungseffizienz als 4-SU auf, was eine höhere Zellanzahl erfordert, um den Hintergrund durch abundante zelluläre RNAs zu überwinden.
