Name: PAR-Clip - Ein Verfahren zur Transkriptom-weiten die Bindungsstellen des RNA-bindende Proteine Identifizieren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-07-02T17:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 24 s
Description: Lernen Sie das PAR-Clip-Verfahren zur transkriptomweiten Identifizierung von RNA-Bindungsstellen RNA-bindender Proteine mittels photoreaktiver Nukleosidanaloga und UV-Crosslinking. Diese Methode ermöglicht die Definition von RNA-Erkennungselementen.

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Wir danken Mitglieder der Tuschl Labor für hilfreiche Diskussionen. MH ist durch den Deutschen Akademischen Austauschdienst (DAAD) unterstützt. Diese Arbeit wurde vom Schweizerischen Nationalfonds Grant # 3100A0-114001 bis MZ unterstützt; TT ist ein HHMI Ermittler, und die Arbeit in seinem Labor wurde durch die NIH gewährt GM073047 und MH08442 und der Starr Foundation unterstützt.

Das Protokoll beschreibt die PAR-CliP Verfahren für HEK293-Zellen, die FLAG / IGF2BP1 bei Induktion mit Doxycyclin HA-markierten. Wir werden eine Anti-FLAG-Antikörper für die Immunpräzipitation verwendet werden. PAR-Clip wird mit jeder Zelllinie nachweisbare Mengen des endogenen, untagged RNA bindenden Proteins (RBP) von Interesse, wenn eine effiziente Antikörper für die Immunpräzipitation ist Arbeit. Expanding Cells <ol><li> Expand FlpIn-HEK293/TO/FLAG/HA-IGF2BP1 Zellen in Wachstumsmedium. Wir empfehlen zwischen 100-400 x 10 6 Zellen (ca. 10 bis 40 15 cm Zellkulturplatten) mit als Ausgangspunkt. Wachsen sie auf etwa 80% Konfluenz. </li><li> 14 h vor dem Vernetzen add a) 4-Thiouridin bis zu einer Endkonzentration von 100 nM (1:1000 v / v einer 1 M 4-Thiouridin Stammlösung) direkt an das Zellkulturmedium und b) induzieren die Expression der FLAG / HA getaggt IGF2BP1 durch Zugabe von 1 pg / ml Doxycyclin (1:10.000 v / v von 10 mg / ml Doxycyclin Stammlösung). HINWEIS: statt 4-Thiouridin können Sie auch 100 uM von 6-thioguanosine. </li></ol> UV-Crosslinking <ol><li> Wash-Zellen einmal mit 10 ml eiskaltem PBS pro Platte und entfernen PBS vollständig. </li><li> Legen Platten auf einem Tablett mit Eis und bestrahlen mit 0,15 J / cm 2 von 365 nm UV-Licht in einem Stratalinker 2400 (Stratagene) oder ein ähnliches Gerät entdeckt. </li><li> Scrape-Zellen mit einem Gummi-Polizist in 1 ml PBS pro Platte, Transfer zum 50 ml Zentrifugenröhrchen sammeln und durch Zentrifugation bei 500 xg für 5 min bei 4 ° C und den Überstand verwerfen. 100 x 10 6 HEK293-Zellen (10 15 cm-Platten) werden Ausbeute ca.. 1 ml des nassen Zellpellets. </li><li> (Optional) Wenn Sie nicht direkt weiter mit Zelllyse wollen, frieren Schock das Zellpellet in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei -80 ° C. Zellpellets können für mindestens 12 Monate gelagert werden. </li></ol> Zelllyse und RNaseT1 verdauen <ol><li> Nehmen Sie Zellpellet aus vernetzten Zellen in 3 Bänden von 1x NP40-Lysepuffer und auf Eis inkubieren für 10 min. </li><li> Klare Zelllysat durch Zentrifugation bei 13.000 xg für 15 min bei 4 ° C. </li><li> Deaktivieren Sie das Lysat durch Filtrieren über eine 0,2 um Membran Spritzenfilter (Pall Acrodisc oder gleichwertig). </li><li> Add RNase T1 (Fermentas, 10.000 U / ul) auf eine Endkonzentration von 1 U / ul und inkubieren in einem Wasserbad für 15 min bei 22 ° C. Coole Reaktion anschließend für 5 min auf Eis, bevor Sie fortfahren. </li></ol> Immunpräzipitation und Wiederherstellung von vernetzten Ziel-RNA-Fragmente Mit dem Magnetabscheider Befolgen Sie diese Richtlinien in der Probenvorbereitung auf die magnetischen Beads vor dem Austrocknen zu verhindern. <ol><li> Das Röhrchen mit den Perlen auf den magnetischen Ständer für 1 2 Minuten. </li><li> Fügen Sie den Puffer in die Röhre, während der Schlauch auf dem Magnetabscheider. </li><li> Cap der Röhre, entfernen Sie sie aus dem Magnetabscheider und resuspendieren Perlen. Sie können die Perlen durch flicking das Rohr mit dem Finger resuspendieren oder verwenden Sie einen Vortexer bei 5 6 gesetzt. </li><li> Kurz zentrifugieren, um Beads, die in die Röhre Kappe verbleiben können zu sammeln. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 1 bis 4 wie erforderlich. </li></ol> Herstellung von magnetischen Kügelchen <ol><li> Transfer 10 ul der Dynabeads Protein G magnetischen Partikeln (Invitrogen) pro ml Zelllysat (bei einem typischen Experiment sollte ca.. 40 50 ul von Kugeln) in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Wash Perlen zweimal mit 1 ml Citrat-Phosphat-Puffer. </li><li> Resuspendieren in das doppelte Volumen von Citrat-Phosphat-Puffer gegenüber dem ursprünglichen Volumen von Beadsuspension. </li><li> Add 0,25 ug der anti-FLAG M2 monoklonalen Antikörper (Sigma) pro ml Suspension und Inkubation auf einem rotierenden Rad für 40 min bei Raumtemperatur. </li><li> Wash Perlen zweimal in 1 ml Citrat-Phosphat-Puffer, um ungebundenen Antikörper zu entfernen. </li><li> Resuspendieren Perlen in das doppelte Volumen von Citrat-Phosphat-Puffer gegenüber dem ursprünglichen Volumen von Beadsuspension. </li></ol> Immunpräzipitation (IP), zweite RNase T1 Verdauung und Dephosphorylierung <ol><li> Add 20 ul frisch zubereiteten Antikörper-konjugierten magnetischen Beads pro ml teilweisen RNase T1 behandelt Zelllysat und inkubieren in 15 ml Zentrifugenröhrchen auf einem rotierenden Rad für 1 h bei 4 ° C. </li><li> Sammeln magnetische Perlen auf einer magnetischen Partikel Sammler für 15 und 50 ml Zentrifugenröhrchen (Invitrogen) und Transfer zu 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. </li><li> Wash Perlen 3-mal in 1 ml IP-Waschpuffer. </li><li> Add RNaseT1 (Fermentas, 10.000 U / ul) auf eine Endkonzentration von 100 U / ul und inkubieren der Beadsuspension in einem Wasserbad für 15 min bei 22 ° C. Coole anschließend auf Eisfür 5 min. </li><li> Wash Perlen 3-mal in 1 ml der High-Salz Waschpuffer. </li><li> Resuspendieren Perlen in 1 Volumen Dephosphorylierungspuffer </li><li> Add Kälberdarm alkalische Phosphatase (CIAP, NEB) auf eine Endkonzentration von 0,5 U / ul, und inkubieren der Suspension für 10 min bei 37 ° C. </li><li> Wash Perlen zweimal in 1 ml der Phosphatase Waschpuffer </li><li> Wash Perlen zweimal in Polynukleotidkinase (PNK)-Puffer ohne DTT (DTT-Konzentration, die für die enzymatische Reaktion ist hoch genug, um die magnetischen Beads Schaden). </li><li> Resuspendieren Perlen in einem Original bead Volumen von PNK-Puffer </li></ol> Radiomarkierung von RNA-Segmente vernetzt immunpräzipitiert Proteine <ol><li> Um der Beadsuspension oben beschrieben, fügen Υ-32 P-ATP zu einer Endkonzentration von 0,5 Ci / ul und T4 PNK (NEB) auf 1 U / ul in einem Original bead Volumen. Inkubieren der Suspension für 30 min bei 37 ° C. </li><li> Fügen Sie nicht radioaktiven ATP zu einer Endkonzentration von 100 uM zu erhalten und Inkubation für weitere 5 min bei 37 ° C. </li><li> Waschen Sie die magnetischen Beads 5-mal mit 800 ul PNK-Puffer ohne DTT. </li><li> Resuspendieren der Beads in 70 ul SDS-PAGE-Ladepuffer. </li></ol> SDS-PAGE und Elektroelution aus vernetztem RNA-Protein-Komplexe aus Gelscheiben <ol><li> Inkubieren Sie die radioaktiv markierten Suspension für 5 min in einem Heizblock bei 95 ° C zu denaturieren und lassen Sie die immunpräzipitiert RBP mit vernetzten RNA und vortexen. </li><li> Entfernen Sie die magnetische Kügelchen auf dem Separator und den Überstand in ein sauberes 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. </li><li> Last 40 ul des Überstandes pro Vertiefung einer Novex Bis-Tris 4-12% (Invitrogen) Fertigteile Polyacrylamidgel und führen Sie das Gel für 55 min bei 200 V. </li><li> Demontieren Sie die Gelkammer und Abbau des Gels, so dass es montiert auf einer Platte. Zur Erleichterung der Ausrichtung des Gels auf die Phosporimager Papierausdruck, empfehlen wir implantieren drei winzige radioaktive Gelstückchen asymmetrisch an drei der vier Ecken des Gels. Radioaktive Gelstücke können von Gelen, die bisher verwendet wurden, um radioaktiv markierte synthetische Oligonukleotide reinigen gesammelt werden. Wickeln Sie das Gel in Kunststoff-Folie (zB Frischhaltefolie), um Verunreinigungen zu vermeiden. </li><li> Setzen Sie das Gel auf eine ausgeblendet Phosporimager Bildschirm für 1 h und visualisieren auf einem Phosporimager. </li><li> Richten Sie das Gel auf der Oberseite des Phosporimager Ausdruck mit dem implantierten Gelstückchen zur Orientierung. Schneiden Sie die Bänder, die zu der erwarteten Größe von RBP (IGF2BP1, ca.. 75 kDa) entsprechen und in ein D-Tube Dialysator Midi Tube und fügen Sie 800 ul 1x SDS Laufpuffer. </li><li> Electroelute das vernetzte RNA-RBP-Komplex in 1x SDS-Laufpuffer bei 100 V für 2 h. aus dem Gel und elektroeluiert in einem D-Rohr Dialysator Midi (Novagen) in 800 ul SDS Laufpuffer gemäß den Anweisungen des Herstellers. </li></ol> Proteinase K-Verdau <ol><li> Fügen Sie dem gleichen Volumen 2x Proteinase K Puffer mit Bezug auf die electroeluate, durch die Zugabe von Proteinase K (Roche) auf eine Endkonzentration von 1,2 mg / ml an. Inkubieren für 30 min bei 55 ° C. </li><li> Recover der RNA durch saure Phenol / Chloroform / IAA-Extraktion (25:24:1, pH 4,0), gefolgt von einer Chloroform-Extraktion. Add 1 ul Glykogen (10 mg / ml Stammlösung) Fällung der RNA durch Zugabe von 3 Volumen Ethanol. Lösen Sie das Pellet in 10,5 ul Wasser. </li></ol> cDNA-Bibliothek Vorbereitung und Deep-Sequencing Carry das gewonnene RNA über einen Standard-cDNA-Bibliothek Vorbereitung Protokoll ursprünglich für das Klonen von kleinen regulatorischen RNAs 19 beschrieben. Der erste Schritt, 3 'Adaptorligation, wurde, wie auf einem 20 ul Skala In 10.5 ul des gewonnenen RNA beschrieben. Verwenden Sie die Solexa-Sequenzierung Adapter-Sets beschrieben. Je nach der Menge der RNA erholt, kann 5'-Adapter-3'-Adapter Produkte ohne Einsätze nach Amplifikation der cDNA als zusätzliche PCR-Bands erkannt werden. In solchen Fällen, Verbrauchsteuer je länger PCR-Produkt der erwarteten Größe von einem 3% NuSieve niedrigen Schmelzpunkt Agarosegel eluiert das PCR-Produkt aus dem Gel Stücke mit dem GelElute Kit (Qiagen) und die Sequenz mit der Solexa-Technologie. Ein Solexa-Sequenzierung laufen in der Regel bietet zwischen 6 und 10 Millionen Reihenfolge liest, dass genug sind für eine Transkriptom breite Abdeckung der Bindungsstellen der RNA-bindenden Proteinen. Die bioinformatische Analyse Sorgfältige bioinformatische Analyse der Sequenz liest getan werden muss, um aussagekräftige Einblicke in die RNA-Bindungsstellen für die untersuchten RBP, wie die RNA-Erkennung Element, das bevorzugte bindenden Regionen der RBP hat (exonische vs intronischen zu erhalten, kodierender Sequenz vs unübersetzt Sequenz). Die Sequenzabschnitte müssen gegen die Genom-und EST-Datenbanken ausgerichtet werden. Wir verwenden normalerweise liest Mapping eindeutig das Genom mit bis zu einem Missverhältnis, Insertion oder Deletion von Clustern von Sequenz zu bauen heißt es, dass kann dann weiter analysiert werden. Die Frequenz der charakteristischen Mutationen in den gruppierten sequenziert liest, T zu C-Übergänge bei der Verwendung von 4-SU und G bis A-Übergänge bei der Verwendung von 6-SG, sind bezeichnend für erfolgreich vernetzt Sequenzen. In unserer Erfahrung unvernetzten RNAs mit 4-SU beschriftet zeigen einen Hintergrund Mutationsrate von ca. 20%. Diese Rate wird erhöht auf ca.. 50-80% auf Vernetzung. Eine detaillierte Beschreibung der bioinformatischen Analyse kann in der ergänzenden Material der Veröffentlichung von Hafner et al. 18 Optional Steps Bestimmung der Inkorporation Ebenen des 4-Thiouridin in Gesamt-RNA Isolieren der Gesamt-RNA aus der Zelllinie stabil exprimieren die RBP von Interesse nach wächst in Medium mit 100 uM 4SU 16 h vor der Ernte ergänzt. Als Kontrolle Ernte Zellen ohne 4SU hinaus gewachsen. Isolieren der Gesamt-RNA durch Zugabe von 3 Volumen Trizol Reagenz (Sigma) zu den gewaschenen Zellpellets nach Angaben des Herstellers s Anweisungen. war weiter zu reinigen Gesamt-RNA mit Qiagen RNeasy nach dem Protokoll des Herstellers. Um zu verhindern, Oxidation von 4SU während der RNA-Isolierung und Analyse, fügen 0,1 mM Dithiothreitol (DTT), um den Waschpuffer und nachfolgende enzymatische Schritte. Digest und dephosphoryliert Gesamt-RNA zu einzelnen Nukleoside zur HPLC-Analyse, wie zuvor beschrieben 20. Kurz gesagt, in einem 30 ul Volumen, inkubieren 40 ug des gereinigten Gesamt-RNA wurden für 16 h bei 37 ° C mit 0,4 U bakterieller alkalischer Phosphatase (Worthington Biochemical) und 0,09 U Schlangengift-Phosphodiesterase (Worthington Biochemical). Als Referenz-Standard, mit einem synthetischen 4SU-markierte RNA, (wir standardmäßig verwenden CGUACGCGGAAUACUUCGA (4SU) U) und unterliegen auch sie enzymatische Verdauung abgeschlossen. Trennen Sie die resultierenden Mischungen von Ribonukleosiden durch HPLC auf einer Supelco Entdeckung C18 (gebundene Phase Silica 5 uM Partikel, 250 x 4,6 mm) Reverse-Phase-Säule (Bellefonte PA, USA). HPLC Puffer 0,1 M TEAA in 3% Acetonitril (A) und 90% Acetonitril in Wasser (B). Verwenden Sie einen isokratischen Gradienten: 0% B für 15 min, 0 bis 10% B für 20 min, 10 bis 100% B für 30 min. Tragen Sie eine 5 min 100% B waschen angewendet zwischen den Läufen auf der HPLC-Säule zu reinigen. Repräsentative Ergebnisse <img src="/files/ftp_upload/2034/2034fig1.jpg" alt="Abbildung 1"> Abbildung 1 (rechts) zeigt ein repräsentatives Ergebnis einer PAR-Clip mit Zelllinien, FLAG / HA-markierten IGF2BP1 mit 4-SU und 6-SG durchgeführt. Beachten Sie, dass die Vernetzung Effizienz des 6-SG für IGF2BP1 niedriger als die Vernetzungseffizienz für 4-SU ist. Die untere Vernetzungseffizienz wird in eine höhere Hintergrund-Sequenzen aus Fragmenten von reichlich zellulären RNAs abgeleitete Ergebnis und deshalb sollten Sie sich überlegen Aufstockung des Experiments bei der Verwendung von weniger effizienten photoreaktiven Nukleoside. Der linke Teil der Abbildung 1 zeigt einen Vergleich der mit verschiedenen photoreaktiven Uridin-Analoga, die potenziell für PAR-CliP werden im Vergleich zu herkömmlichen UV 254 nm Vernetzung könnte verwendet werden. Die Intensität der radioaktiven Bande der richtigen Länge gibt Ihnen eine gute Idee, ob die PAR-CliP Experiment hat funktioniert, und Sie haben genügend RNA isoliert zu tragen durch ein kleines RNA-Sequenzierung Protokoll (Schritt-für-Schritt-Beschreibung für cDNA-Bibliothek Herstellung kleiner RNAs Sequenzierung kann in 19 zu finden). Die Häufigkeit der charakteristische Mutationen im sequenziert liest, T zu C-Übergänge bei der Verwendung von 4-SU und G bis A-Übergänge bei der Verwendung von 6-SG, sind bezeichnend für erfolgreich vernetzt Sequenzen. In unserer Erfahrung unvernetzten RNAs mit 4-SU beschriftet zeigen einen Hintergrund Mutationsrate von ca. 20%. Diese Rate wird erhöht auf ca.. 50-80% auf Vernetzung.

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TT ist Mitbegründer und wissenschaftlicher Berater Alnylam Pharmaceuticals und Berater Regulus Therapeutics.

Puffer und Reagenzien Wachstumsmedium HEK293-Zellen <ul><li> DMEM </li><li> 10% FBS </li><li> 2 mM L-Glutamin </li><li> 100 U / ml Penicillin </li><li> 100 U / ml Streptomycin </li><li> 100 pg / ml Hygromycin </li><li> 15 ug / ml Blasticidin </li></ul> 4-Thiouridin Stammlösung (1 M) <ul><li> 260,27 mg 4-Thiouridin </li><li> 1 ml DMSO </li></ul> Doxycyclin Lager (10 mg / ml) <ul><li> 10 mg Doxycyclin </li><li> 1 ml DMSO </li></ul> 1x NP40-Lysepuffer Bereiten Sie einen Bestand von 5x Puffer ohne DTT und Protease-Inhibitoren. Add DTT und Protease-Inhibitor direkt vor dem Experiment. <ul><li> 50 mM HEPES, pH 7,5 </li><li> 150 mM KCl </li><li> 2 mM EDTA </li><li> 1 mM NaF </li><li> 0,5% (v / v) NP40 </li><li> 0,5 mM DTT </li><li> komplette EDTA-freie Protease Inhibitor Cocktail (Roche) </li></ul> Citrat-Phosphat-Puffer <ul><li> 4,7 g / l Zitronensäure </li><li> 9,2 g / l Na 2 HPO 4 </li><li> pH 5,0 </li></ul> IP-Waschpuffer <ul><li> 50 mM HEPES-KOH, pH 7,5 </li><li> 300 mM KCl </li><li> 0,05% (v / v) NP40 </li><li> 0,5 mM DTT (add direkt vor Experiment) </li><li> komplette EDTA-freie Protease Inhibitor Cocktail (Roche) (add direkt vor Experiment) </li></ul> High-Salz Waschpuffer <ul><li> 50 mM HEPES-KOH, pH 7,5 </li><li> 500 mM KCl </li><li> 0,05% (v / v) NP40 </li><li> 0,5 mM DTT (add direkt vor dem Experiment) </li><li> komplette EDTA-freie Protease Inhibitor Cocktail (Roche) (add direkt vor dem Experiment) </li></ul> Dephosphorylierungspuffer <ul><li> 50 mM Tris-HCl, pH 7,9 </li><li> 100 mM NaCl </li><li> 10 mM MgCl 2 </li><li> 1 mM DTT </li></ul> Phosphatase Waschpuffer <ul><li> 50 mM Tris-HCl, pH 7,5 </li><li> 20 mM EGTA </li><li> 0,5% (v / v) NP40 </li></ul> Polynukleotid-Kinase (PNK)-Puffer ohne DTT <ul><li> 50 mM Tris-HCl, pH 7,5 </li><li> 50 mM NaCl </li><li> 10 mM MgCl 2 </li></ul> PNK-Puffer <ul><li> 50 mM Tris-HCl, pH 7,5 </li><li> 50 mM NaCl </li><li> 10 mM MgCl 2 </li><li> 5 mM DTT </li></ul> SDS-PAGE-Ladepuffer <ul><li> 10% Glycerin (v / v) </li><li> 50 mM Tris-HCl, pH 6,8 </li><li> 2 mM EDTA </li><li> 2% SDS (w / v) </li><li> 100 mM DTT </li><li> 0,1% Bromphenolblau </li></ul> 2x Proteinase K-Puffer <ul><li> 100 mM Tris-HCl, pH 7,5 </li><li> 150 mM NaCl </li><li> 12,5 mM EDTA </li><li> 2% (w / v) SDS </li></ul>

par-clip - ein verfahren zur transkriptom-weiten die bindungsstellen des rna-bindende proteine ​​identifizieren

PAR-CliP - A Method to Identify Transcriptome-wide the Binding Sites of RNA Binding Proteins

RNA-Transkripte sind post-transkriptionellen Genregulation durch die Interaktion mit Hunderten von RNA-bindenden Proteinen (RBPs) und microRNA-haltigen Ribonukleoproteinkomplexe (miRNPs), die oft in einem Zelltyp abhängig exprimiert werden. Unterzogen Um zu verstehen, wie das Zusammenspiel dieser RNA-bindenden Faktoren beeinflusst die Regulierung einzelner Transkripte, hochauflösende Karten von in vivo Protein-RNA-Wechselwirkungen sind notwendig 1. Eine Kombination von genetischen, biochemischen und computergestützte Ansätze sind in der Regel angewendet, um RNA-RBP-oder RNA-RNP-Interaktionen zu identifizieren. Microarray-Profiling von RNAs mit immunopurified RBPs assoziiert (RIP-Chip) 2 definiert Ziele bei einer Transkriptom-Ebene, aber ihre Anwendung ist die Charakterisierung von kinetisch stabile Interaktionen und nur in seltenen Fällen 3,4 erlaubt es, die RBP Anerkennung Element (RRE identifizieren begrenzt ) innerhalb der langen Ziel-RNA. Mehr direkte RBP Zielort Informationen wird durch die Kombination in vivo UV-Vernetzung mit 5,6 Immunpräzipitation 7-9 durch die Isolierung aus vernetztem RNA-Segmenten und cDNA-Sequenzierung (CLIP) 10 gewonnen wird. CLIP wurde benutzt, um Ziele einer Reihe von RBPs 11-17 identifizieren. Allerdings ist CLIP durch die geringe Effizienz der UV 254 nm RNA-Protein-Vernetzung beschränkt, und die Lage der Vernetzung ist nicht leicht zu identifizieren innerhalb des sequenzierten vernetzt Fragmente, was es schwierig macht UV-vernetzten Ziel-RNA-Segmente aus dem Hintergrund nicht-vernetzten separaten RNA-Fragmente auch in der Probe vorhanden. Wir entwickelten eine starke Zell-basierten Ansatz zur Vernetzung bei hoher Auflösung und Transkriptom-weiten Bindungsstellen der zellulären RBPs und miRNPs feststellen, dass wir als PAR-Clip (Photoaktivierbare-Ribonucleosid-Enhanced Vernetzung und Immunpräzipitation) (siehe Abb.. 1A für eine Gliederung der Methode). Die Methode beruht auf dem Einbau von photoreaktiven Ribonukleosid Analoga, wie 4-Thiouridin (4-SU) und 6-thioguanosine (6-SG) in naszierenden RNA-Transkripte von lebenden Zellen. Die Bestrahlung der Zellen durch UV-Licht von 365 nm induziert eine effiziente Vernetzung von photoreaktiven Nukleosid-markierten zellulären RNAs zu interagieren RBPs. Immunpräzipitation des RBP in der Umgebung ist durch Isolierung des vernetzten und coimmunoprecipitated RNA gefolgt. Die isolierte RNA wird in einer cDNA-Bibliothek umgewandelt und tiefe sequenziert mit Solexa-Technologie. Ein charakteristisches Merkmal von cDNA-Bibliotheken von PAR-CliP vorbereitet ist, dass die genaue Position der Vernetzung durch Mutationen mit Wohnsitz in der sequenzierten cDNA identifiziert werden können. Bei der Verwendung von 4-SU, Thymidin vernetzt Sequenzen zu Cytidin Übergang, während mit 6-SG-Ergebnis in Guanosin zu Adenosin-Mutationen. Das Vorhandensein der Mutationen in vernetzten Sequenzen ist es möglich, sie aus dem Hintergrund der Sequenzen aus reichlich zellulären RNAs abgeleitet trennen. Die Anwendung der Methode auf eine Reihe von verschiedenen RNA-bindende Proteine ​​wurde in Hafner et al. 18

RNA-Transkripte sind Gegenstand intensiver posttranskriptioneller Regelung, die durch eine Vielzahl von trans-agierenden RNA-bindende Proteine ​​(RBPs) vermittelt wird. Hier präsentieren wir Ihnen eine verallgemeinerbare Methode zur Identifizierung und präzise auf Transkriptom-weiten Skala der RNA-Bindungsstellen von RBPs.

PAR-Clip - Ein Verfahren zur Transkriptom-weiten die Bindungsstellen des RNA-bindende Proteine ​​Identifizieren

RNA transcripts are subjected to post-transcriptional gene regulation by interacting with hundreds of RNA-binding proteins (RBPs) and microRNA-containing ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die transkriptomweiten Bindungsstellen von RNA-Bindungsproteinen oder RVPs zu bestimmen. Dies wird erreicht, indem zunächst photoreaktive Nukleosidanaloga für die in vivo-Markierung von naszierenden Transkripten verwendet werden. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, RNA und RNA-bindende Proteine mit 365 Nanometer UV-Licht zu vernetzen.Der dritte Schritt des Verfahrens besteht darin, das untersuchte RNA-Bindungsprotein immunzu präzipitieren und die Vernetzung mit RNA wiederherzustellen. Der letzte Schritt des Verfahrens besteht darin, die RNA in eine CD-NA-Bibliothek und eine tiefe Sequenz umzuwandeln. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die transkriptomweite Bindungsstellen der RVPs zeigen und die Definition des RNA-Erkennungselements und seiner Bindungspräferenzen ermöglichen.Hallo, mein Name ist Marcus Hoffner aus dem Labor von Tom SEL an der Rockefeller University in New York. Heute zeigen wir eine Methode namens Par-Lip oder Photoable Rib Nucleosid Analog Enhanced Crosslinking and Immunoprecipitation. Wir verwenden dieses Verfahren in unserem Labor, um auf einem Transkriptom anhand seiner Skala Bindungsstellen von RNA-Bindungsproteinen sowie deren Bindungsmotive und -präferenzen zu identifizieren.Okay, fangen wir an. Die In-vivo-UV-Vernetzung beginnt in einer Laminar-Flow-Haube. In diesem Protokoll werden wir als beispielhaftes Modell mit steriler Technik markierte IGF-Zellen mit zwei BP-Eins-Zellen verwenden.Expandieren Sie HEK 2 93 Zellen, die das Flag HA stabil exprimieren, markiert IGF zwei BP, eine unter Kontrolle eines Tet-Repressors in HEK 2 93 Zellkulturmedium zwischen 100 und 400 mal 10 auf die sechsten Zellen und züchten Sie sie auf etwa 80 % Co-Fluenz. 14 Stunden vor dem Crosslinking hatten die Zellen das photoreaktive Ribosid-Analogon für Thiouridin oder für SU direkt an das Zellkulturmedium. Alternativ können sechs Guineen oder sechs SG nach Zugabe des photoreaktiven Ribosids verwendet werden, um die Expression der Flagge HA zu induzieren, die mit IGF markiert ist, zwei BP eins durch die Zugabe von Doxycyclin Zellen werden dann über Nacht im Zellinkubator inkubiert.Dekantieren Sie anschließend das Wachstumsmedium. Waschen Sie die Zellen dann einmal mit 10 Millilitern eiskalter, phosphatgepufferter Kochsalzlösung pro Platte. Entfernen Sie dann das PBS vollständig durch Dekantieren.Legen Sie die unbedeckten Platten auf ein Tablett mit Eis und bestrahlen Sie sie mit 365 Nanometer UV-Licht in einem Spreizlinker 2, 400 UV-Vernetzer oder gleichwertig im Anschluss an die UV-Strahlung, kratzen Sie die Zellen mit einem Gummipolizisten in einem Milliliter PBS pro Platte ab. Füllen Sie die Zellen in 50-Milliliter-Zentrifugationsröhrchen und zentrifugieren Sie sie fünf Minuten lang bei 500 g bei vier Grad Celsius. Verwerfen Sie den Supernamen und behalten Sie das Zellpellet.Zu diesem Zeitpunkt können die Zellpellets in flüssigem Stickstoff schockgefroren und mindestens 12 Monate lang bei minus 80 gelagert werden. Um mit dem Verfahren fortzufahren, reus Sie das Pellet in drei Volumina eines X NP 40 Lysepuffers und inkubieren Sie es 10 Minuten lang auf Eis. Das Zelllysat wird durch Zentrifugation bei 13.000 g für 15 Minuten bei vier Grad Celsius klargestellt.Nach der Zentrifugation reinigen Sie das Lysat weiter, indem Sie es durch einen Fünf-Mikron-Membranspritzenfilter filtrieren. Zum Schluss wird die RNA T one bis zu einer Endkonzentration von einer Einheit pro Mikroliter zugegeben und 15 Minuten lang in einem Wasserbad bei 22 Grad Celsius inkubiert. Anschließend die Reaktion fünf Minuten lang auf Eis abkühlen lassen.Im Anschluss an die in vivo UV-Vernetzung. Bereiten Sie die magnetischen Kügelchen für die Immunpräzipitation vor. Übertragen Sie 10 Mikroliter dyna beads protein G magnetische Partikel pro mil Zelllysat in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen.Legen Sie dann die Tube mit den Perlen für ein bis zwei Minuten auf einen Magnetständer. Entfernen Sie den Überstand und geben Sie einen Milliliter Citratphosphatpuffer in das Röhrchen, während es sich auf dem Magnetabscheider befindet. Verschließen Sie dann das Röhrchen und wirbeln Sie die Probe vortexen, um die Kügelchen wieder zu resuspendieren.Kurz zentrifugieren, um die im Röhrchendeckel verbliebenen Kügelchen aufzufangen. Wiederholen Sie diese Wäsche mit einem zusätzlichen Milliliter Citratphosphatpuffer. Nach der Waschreus werden die Kügelchen und der Citratphosphatpuffer in einer Menge suspendiert, die dem Zweifachen des ursprünglichen Volumens der Rübensuspension entspricht.Fügen Sie dann 0,25 Milligramm Anti-Flag M hinzu, zwei monoklonale Antikörper pro Milliliter Beat-Suspension. Inkubieren Sie die Suspension nach der Inkubation 40 Minuten lang bei Raumtemperatur, waschen Sie die Kügelchen zweimal in einem Milliliter Citratphosphatpuffer, wie zuvor beschrieben, diese Wäsche dient dazu, alle ungebundenen Antikörper nach dem Waschen Resus zu entfernen, suspendieren Sie die Kügelchen und Citratphosphatpuffer wie vor vier. Um mit der Immunpräzipitation zu beginnen, fügen Sie die frisch zubereiteten Antikörper-konjugierten magnetischen Kügelchen zu den RNAs T eins-behandeltem Zelllysat hinzu.Füllen Sie die Mischung in 15-Milliliter-Zentrifugationsröhrchen um und drehen Sie sie eine Stunde lang bei vier Grad Celsius. Nach der Inkubation werden die magnetischen Kügelchen gesammelt, die überstehenden Resuspendierungskügelchen in einem Milliliter IP-Waschpuffer entsorgt und in 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen überführt. Waschen Sie die Kügelchen wie zuvor beschrieben zweimal in einem Milliliter IP-Waschpuffer.Nach der letzten Wäsche werden die Kügelchen im ursprünglichen Bead-Volumen des IP-Waschpuffers wieder aufgehängt. Geben Sie dann RNAT eins bis zu einer Endkonzentration von 100 Einheiten pro Mikroliter hinzu. Inkubieren Sie die Perlensuspension 15 Minuten lang in einem 22 Grad Celsius warmen Wasserbad.Anschließend die Suspension fünf Minuten lang auf Eis abkühlen lassen. Waschen Sie die Kügelchen anschließend dreimal in einem Milliliter Waschpuffer mit hohem Salzgehalt. Dann resuspendieren Sie die Kügelchen in einem ursprünglichen Beadsvolumen aus Dephosphorylierungspuffer.Geben Sie alkalische Phosphatase aus dem Kälberdarm bis zu einer Endkonzentration von 0,5 Einheiten pro Mikroliter hinzu und inkubieren Sie die Suspension 10 Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Waschen Sie die Kügelchen zweimal in einem Milliliter Phosphatase-Waschpuffer und dann noch zweimal in Polynukleotidkinase oder PNK-Puffer ohne DTT. Zum Schluss resuspendieren Sie die Kügelchen in einem ursprünglichen Perlenvolumen aus PNK-Puffer.Um mit der Radiomarkierung von vernetzter RNA zu beginnen. Gamma 32 PATP und T vier PNK zu einem ursprünglichen Bead-Volumen der frisch zubereiteten Bead-Suspension geben. Inkubieren Sie die Suspension 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius.Als nächstes fügen Sie der Suspension ein nicht-radioaktives TP hinzu und inkubieren sie weitere fünf Minuten bei 37 Grad Celsius. Waschen Sie dann die magnetischen Kügelchen fünfmal mit 800 Mikrolitern PNK-Puffer ohne DTT. Zum Schluss resuspendieren Sie die Kügelchen in 70 Mikrolitern SDS-Seite.Mit einem Ladepuffer inkubieren Sie die Radiomarkierungssuspension fünf Minuten lang in einem Wärmeblock bei 95 Grad Celsius, um die immunpräzipitierten RNA-Bindungsproteine mit der vernetzten RNA zu denaturieren und freizusetzen. Entfernen Sie dann die magnetischen Kügelchen auf dem Separator und geben Sie das Super Natin in ein sauberes 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Laden Sie 40 Mikroliter des Suade pro Vertiefung eines novox bis triss vier bis 12 % vorgefertigten Polyacrylamid-Gels und lassen Sie das Gel 55 Minuten lang bei 200 Volt laufen. Sobald das Gel abgelaufen ist, zerlegen Sie die Gelkammer und zerlegen Sie die Platten, wobei das Gel auf einer Platte montiert bleibt, um die Ausrichtung des Gels auf dem Phospho-Imager-Papierausdruck zu erleichtern.Implantieren Sie drei winzige radioaktive Gelstücke asymmetrisch an den Gelecken. Wickeln Sie das Gel in eine Plastikfolie wie z. B. Saran-Folie ein, um eine Kontamination zu vermeiden. Setzen Sie das Gel eine Stunde lang einem leeren Phospho-Imager-Bildschirm aus und dann auf einem Phospho-Imager.Richten Sie als Nächstes das Gel auf dem Phospho-Imager-Ausdruck aus, indem Sie die implantierten Gelstücke zur Orientierung verwenden. Schneiden Sie die Banden aus, die der erwarteten Größe des RNA-Bindungsproteins oder RBP entsprechen. Übertragen Sie die Bänder auf eine MIDI-Röhre des DTU-Dialysators und fügen Sie 800 Mikroliter eines XSDS-Laufpuffer-Elektroelues hinzu.Der vernetzte R-N-A-R-B-P-Komplex bei 100 Volt für zwei Stunden gemäß den Anweisungen des Herstellers. Im Anschluss an die Elektroelution. Fügen Sie Proteinase K-Puffer und Proteinase K hinzu und inkubieren Sie die Lösung 30 Minuten lang bei 55 Grad Celsius.Die RNA wird durch Extraktion mit saurem Phenolchloroform-Isoamylalkohol zurückgewonnen, gefolgt von einer Chloroform-Extraktion. Fügen Sie dann einen Mikroliter Glykogen hinzu und fällen Sie die RNA aus, indem Sie drei Volumen Ethanol hinzufügen. Zum Schluss lösen Sie das resultierende Pellet in 10,5 Mikrolitern Wasser auf.Sobald die RNA zurückgewonnen wurde, führen Sie sie durch ein Standard-CDNA-Bibliotheksvorbereitungsprotokoll und führen Sie eine sorgfältige bioinformatische Analyse der Sequenzlesevorgänge durch. Repräsentative Ergebnisse für einen Par-Clip, der mit HK 2 93 Zellen durchgeführt wurde, die die Flagge H ha exprimieren, die IGF zwei BP und eins markiert haben, sind mit den photoreaktiven Nukleosidanaloga vier SU und sechs SG dargestellt: Die Vernetzungseffizienz des alternativen photoreaktiven Ribosids sechs SG ist im Allgemeinen niedriger als für vier su. Die geringere Vernetzungseffizienz könnte zu einem höheren Hintergrund von Sequenzen führen, die aus Fragmenten reichlich vorhandener zellulärer RNAs stammen, und daher sollten zunächst mehr Zellen für das Experiment verwendet werden.Verschiedene photoreaktive Uridin-Analoga mit par-Clips werden mit herkömmlichen UV-2-, 54-Nanometer-Vernetzungen oder Clips verglichen, wie hier zu sehen. Die Vernetzung von RNA-Proteinen mit UV 2 54 Nanometern hat eine begrenzte Vernetzungseffizienz. Die Intensität der entsprechend großen radioaktiven Bande zeigt an, ob das Par-Clip-Experiment funktioniert hat und ob genügend RNA isoliert wurde, um ein kleines RNA-Sequenzierungsprotokoll zu durchlaufen.Die Häufigkeit charakteristischer Mutationen in den sequenzierten Reads nach bioinformatischer Analyse ist ein Hinweis auf erfolgreich vernetzte Sequenzen. Diese Mutationen sind T-zwei-C-Übergänge bei Verwendung von vier SU-Übergängen und G-zwei A-Übergänge bei Verwendung von Erfolg. G.Das definierende Merkmal von Park Lip ist die Möglichkeit, den Ort der Quervernetzung abzuleiten, indem eine charakteristische Mutation in den CD-NA-Bibliotheken bewertet wird, die aus den wiedergefundenen RNAs hergestellt wurden.Dies ermöglicht die einfache Trennung des Signals, das von spezifisch gebundenen RNAs abgeleitet wird, vom Rauschen von Sequenzen, die von co-isolierten Fragmenten reichlich vorhandener zellulärer RNAs abgeleitet sind. Deshalb haben wir Ihnen heute gezeigt, wie Sie RNA-Segmente isolieren können, die spezifisch von RNA-bindenden Proteinen erkannt werden. Wenn Sie dieses Verfahren ausführen.Es ist wichtig, RNAs frei zu arbeiten. Das war es also. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei den Experimenten.

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