Immunfluoreszenz-Nachweis von zwei Thymidinanaloga (CldU und IDU) in primärem Gewebe
7. Dezember 2010
Wir haben eine Strategie zur sequentiellen Aufnahme von Thymidin-Analoga (CldU und IDU) in das Gewebe erwachsener Mäuse zu erkennen an zwei aufeinander folgenden Runden der Zellteilung zu quantifizieren abgeleitet. Diese Strategie ist sinnvoll, die Zellerneuerung an langlebigen Geweben, onkogenen Transformation oder die Durchreise verstärkenden Zellen zu erkennen.
Hallo und willkommen zum Calor-D-U-I-D-U-Färbeprotokoll. Heute beginnt unser Video mit Schritt drei, der Rehydratisierung, Permeabilisierung und Antigen-Retrieval. Beginnen Sie damit, Ihre Objektträger in den Halter einzulegen.
Nachdem die Objektträger beladen sind, legen Sie sie für fünf Minuten in ein Xylolbad. Anschließend folgt ein zweites Xylolbad, ebenfalls für fünf Minuten.
Fahren Sie mit der Rehydratisierung Ihrer Objektträger fort, indem Sie diese in Ethanol-Lösung überführen, beginnend mit 100%iger Lösung und endend bei 50%. Schließen Sie die Rehydratisierung der Objektträger ab, indem Sie die Objektträger fünf Minuten lang in eine XPBS-Lösung zur Permeabilisierung der Zellmembranen geben. Tauchen Sie Ihre Objektträger fünf Minuten lang in eine 0,2%ige Triton X-Lösung ein. Bereiten Sie Ihre Objektträger für die Mikrowellen-Gewebereparatur von Antigenen vor, indem Sie sie in ein Glasgefäß mit ausreichendem Volumen an 0,01-molarer Natriumcitrat-Pufferlösung geben, sodass die Lösung fünf Zentimeter über der Oberkante der Objektträger steht.
Um Verdunstungsverluste auszugleichen, erhitzen Sie die Objektträger im Mikrowellenofen, bis die Lösung kocht. Dies sollte bei voller Leistung etwa drei bis zehn Minuten dauern. Überprüfen Sie, ob die Objektträger kochen.
Verringern Sie die Mikrowellenleistung zwischen 10 und 80 % und lassen Sie die Objektträger weitere 20 Minuten langsam weiterköcheln. Stellen Sie nach dem Kochen das Becherglas mit den Objektträgern auf die Laborbank, um sie etwa zwei Stunden langsam abkühlen zu lassen, bis sie Raumtemperatur erreicht haben. Vergewissern Sie sich, dass die Objektträger Raumtemperatur erreicht haben.
Die Objektträger 40 Minuten lang bei Raumtemperatur in 1,5 natürlicher Salzsäure einlegen. Nehmen Sie die Objektträger aus der Salzsäure heraus und legen Sie sie fünf Minuten lang in eine XPBS-Spülung. Anschließend folgt eine zweite XPBS-Spülung.
Entfernen Sie Ihre Objektträger aus der 1× PBS-Lösung mit einem flüssigen Blockierwachsstift. Umkreisen Sie jeden Gewebeschnitt und legen Sie den Objektträger anschließend zurück in die PBS-Lösung. Stellen Sie eine feuchte Inkubationskammer her, indem Sie ein angefeuchtetes Papiertuch auf den Boden eines luftdichten Behälters legen.
Stellen Sie eine Blockierungslösung aus 10 % Docking-Serum her, das in einem XPBS verdünnt ist. Es ist wichtig, jeden Gewebeschnitt vollständig mit der Lösung zu bedecken, insbesondere bei Gewebeproben mit typischer Größe von etwa einem mal 1,5 Zentimetern. Ein Volumen von 50 Mikrolitern Blockierungslösung ist ausreichend.
Bereiten Sie den primären IDU-Antikörper vor, indem Sie Maus-anti-BRDU-Antiserum in 5 % Eselserum verdünnen. Fügen Sie eine Konzentration von 1 zu 250 hinzu. Pipettieren Sie die primäre Lösung auf jeden Objektträgerabschnitt.
Stellen Sie Ihre Objektträger in einen Kühlschrank bei vier Grad Celsius. Für eine Übernacht-Inkubation bereiten Sie eine Hochstringenz-Waschung vor. TBST eignet sich gut dafür.
Präparatgläser rückseitig zueinander ausrichten. Legen Sie die Präparatgläser in etwa 35 bis 40 Milliliter TBST-Lösung. Stellen Sie die Röhrchen in einen schüttelnden Bakterienkulturtrockenschrank bei 37 Grad Celsius.
Lassen Sie sie 20 Minuten lang bei 225 U/min schütteln. Laden Sie nun Ihre Objektträger in einen Träger. Legen Sie Ihre Objektträger für eine fünfminütige PBS-Waschung in ein XPBS.
Dies erfolgt durch eine zweite XPBS-Waschung für fünf Minuten. Bereiten Sie die primäre CLDU-Antikörperlösung vor, indem Sie rat anti BRDU in 5 % Eselsumserum verdünnen. Geben Sie eine Konzentration von 1 zu 250 auf Objektträger, die auf einem Papiertuch liegen, und umreißen Sie diese anschließend mit einem Wachsstift.
Decken Sie jeden Gewebeschnitt mit einer Pipette mit primärer CLDU-Lösung ab. Verwenden Sie etwa 50 Mikroliter der Lösung, um sicherzustellen, dass jeder Gewebeschnitt vollständig bedeckt ist. Legen Sie Ihre Objektträger für eine Übernacht-Inkubation in einen Kühlschrank bei vier Grad Celsius.
Platzieren Sie Ihre Objektträger in einem Träger und anschließend in eine erste XPBS-Waschung für fünf Minuten. Geben Sie Ihre Objektträger in eine zweite XPBS-Waschung für fünf Minuten. Bereiten Sie sekundäre Antikörper vor, indem Sie CY two Esel-anti-RAD- und PS five Esel-anti-Maus-Antikörper in 5 % Eselserum verdünnen. DPI wird ebenfalls für die Kernfärbung verwendet. Decken Sie die Gewebeschnitte vollständig mit den sekundären Antikörpern ab.
50 µL der Lösung sollten ausreichen, um Ihr Gewebe vollständig zu bedecken. Stellen Sie die Rehydratisierungskammer eine Stunde lang an einen dunklen Ort bei Raumtemperatur zur Inkubation. Legen Sie Ihre Objektträger in einen Träger und anschließend für fünf Minuten in eine XPBS-Spülung.
Legen Sie Ihre Objektträger für fünf Minuten in eine zweite X-PBS-Spülung. Tappen Sie überschüssige PBS-Lösung auf einem Papiertuch ab. Geben Sie dann ein verlängerndes Gold-Anti-Fade-Montagemedium und platzieren Sie einen kleinen Tropfen davon auf jeden Gewebeschnitt.
Nehmen Sie einen Deckgläser und legen Sie ihn vorsichtig auf Ihre Objektträgerpräparate. Verwenden Sie das Papiertuch als Andruckmittel, um überschüssige Luftblasen herauszudrücken, die sich möglicherweise zwischen den Objektträgerpräparaten und dem Deckglas eingeschlossen haben. Drücken Sie abschließend mit einer Pipettenspitze verbliebene Luftblasen heraus. Bilden Sie Ihr gewünschtes Gewebe mit einem fluoreszenzmikroskopischen Gerät ab, das über eine Hochleistungslichtquelle und mehrere fluoreszierende Kanäle verfügt, um die Ergebnisse zu quantifizieren.
Zählen Sie zunächst die Anzahl der Dabi-positiven Zellen. Zählen Sie die Anzahl der CLDU-positiven Zellen unter Verwendung des SI-Zweikanalbildes. Zählen Sie die Anzahl der IDU-positiven Zellen unter Verwendung des SCI-Fünfkanalbildes.
Zählen Sie abschließend die doppelt positiv markierten Zellen, indem Sie zwischen der SCI zwei- und der SCI fünf-Kanal-Bilddatei wechseln.
Übersicht
Dieser Artikel stellt eine Methode zur Detektion der sequenziellen Einlagerung von Thymidinanaloge (CldU und IdU) in Geweben erwachsener Mäuse vor, die es ermöglicht, zwei aufeinanderfolgende Zellteilungsrunden zu quantifizieren. Diese Technik ist wertvoll für die Untersuchung der Zellneubildung in langlebigen Geweben, der onkogenen Transformation sowie von Transit-Amplifizierungs-Zellen.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Zellbiologie
- Neurowissenschaften
- Onkologie
Hintergrund
- Thymidinanaloge werden verwendet, um teilende Zellen zu markieren.
- Das Verständnis der Zellteilung ist entscheidend für die Untersuchung der Geweberegeneration.
- Der Zellumsatz ist sowohl in der normalen Physiologie als auch bei Krankheitszuständen von Bedeutung.
- Durch sequenzielle Markierung können Erkenntnisse über die Dynamik von Zellpopulationen gewonnen werden.
Zweck der Studie
- Entwicklung einer zuverlässigen Methode zur Quantifizierung der Zellteilung in Geweben.
- Bewertung der Auswirkungen des Zellumsatzes in verschiedenen biologischen Kontexten.
- Verbesserung des Verständnisses onkogener Prozesse durch die Analyse der Zellteilung.
Verwendete Methoden
- Sequenzielle Einbindung von CldU und IdU in Mausgeweben.
- Fluoreszenzmikroskopie zur Visualisierung markierter Zellen.
- Quantifizierung von DAB-, CldU- und IdU-positiven Zellen.
- Verwendung spezifischer Antikörper zum Nachweis von Thymidinanalogon.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Detektion sequenzieller Zellteilung in Gewebeproben.
- Quantitative Analyse der Zellumsatzraten.
- Identifizierung potenzieller Marker für onkogene Transformation.
- Erkenntnisse zum Verhalten von Transit-Amplifikationszellen.
Schlussfolgerungen
- Die entwickelte Methode bietet einen robusten Ansatz zur Untersuchung der Zellteilung.
- Die Ergebnisse tragen zum Verständnis der Gewebestruktur in Gesundheit und Krankheit bei.
- Diese Technik kann auf verschiedene Forschungsbereiche angewendet werden, darunter Onkologie und regenerative Medizin.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Eine genaue Quantifizierung der sequenziellen Zellteilung ermöglicht eine mechanistische Entlastung bei der Zielvalidierung, indem sie die proliferativen Dynamiken in krankheitsrelevanten Systemen klärt. Dieser Ansatz stärkt das Vorhersagevertrauen in präklinische Modelle, indem er zwischen vorübergehenden und anhaltenden proliferativen Reaktionen unterscheidet und somit die Identifizierung von Leitstrukturen sowie die Portfolio-Priorisierung unterstützt. Die Anwendbarkeit der Methode auf langlebige Gewebe fördert die entdeckungsbasierte Identifizierung translationaler Biomarker in der Onkologie und regenerativen Medizin.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Überprüft therapeutische Hypothesen, indem zwei aufeinanderfolgende Zellteilungsrunden in primärem Gewebe gemessen werden.
- Operationaler Wert: Ermöglicht die funktionelle Zielvalidierung durch direkte Visualisierung der proliferativen Kinetik in Krankheitsmodellen.
- Prädiktiver Wert: Unterstützt die mechanistische Risikominimierung, indem Zellumsatzraten quantifiziert werden, die Aufschluss über die Zielverlässlichkeit und die Modulation von Signalwegen geben.
Screening und Assay-Entwicklung
- Assay-Bereitschaft: Bereitet validierte biologische Systeme für die nachgeschaltete Verbindungsbewertung mittels standardisierter Immunfärbungsprotokolle vor.
- Quantifizierbare Ausgabe: Erzeugt messbare Anzahlen an DAB-, CldU- und IdU-positiven Zellen als reproduzierbare Screening-Endpunkte.
- Skalierbarkeit: Optimiert für die Gabe geringer Dosen von Thymidinanalogon über das Trinkwasser, wodurch chronische Dosisstudien in präklinischen Modellen ermöglicht werden.
Translationale und präklinische Forschung
- Krankheitsrelevanz: Wird angewendet, um onkogene Transformationen zu identifizieren und den Beitrag von transitverstärkenden Zellen zum Gewebewachstum zu bewerten.
- Translationale Kontinuität: Schließt die Lücke von der Entdeckung bis zur präklinischen Validierung, indem quantitative Proliferationsdaten über verschiedene Gewebetypen hinweg bereitgestellt werden.
- Risikoadjustierte Entscheidungen: Leitet Fortschrittsstrategien ein, indem geklärt wird, ob das beobachtete Wachstum auf Stammzellaktivität oder auf die Expansion transitverstärkender Zellen zurückzuführen ist.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode integriert sich in den Entdeckungsprozess von der Target-Validierung über die Lead-Identifizierung bis hin zur präklinischen Wirksamkeit und liefert Proliferationsmetriken, die Entscheidungen über Fortsetzung oder Abbruch in jeder Phase unterstützen.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die Hypothesenprüfung durch Quantifizierung der sequenziellen DNA-Synthese als Reaktion auf pharmakologische oder genetische Störungen.
- Screening: Bietet gebrauchsfertige Gewebeschnitte mit standardisierter Detektion der Thymidinanalog-Einlagerung für die Wirkstoffprüfung.
- Analytik: Ermöglicht den Vergleich proliferativer Indizes unter verschiedenen Bedingungen durch Trennung der fluoreszierenden Kanäle und Quantifizierung doppelt-positiver Zellen.
- Translationale Forschung: Verbindet die frühe Entdeckung mit der präklinischen Validierung, indem Zellliniendynamiken in für menschliche Erkrankungen relevanten Geweben verfolgt werden.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare Plattform für langfristige Proliferationsstudien über mehrere therapeutische Bereiche hinweg.
Operationelle und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Verringert mechanistische Unschärfen bei der Target-Validierung, indem direkte Nachweise der Zellteilungsgeschichte bereitgestellt werden.
- Operationaler Wert: Stellt Reproduzierbarkeit sicher durch standardisierte Protokolle zur Permeabilisierung, Antigen-Retrieval und multiplexen Immunfärbung.
- Strategischer Wert: Verbessert die Kapitalnutzungseffizienz, indem eine frühzeitige Absicherung von Targets auf der Grundlage proliferativer Risiken ermöglicht wird.
- Portfolio-Implikation: Unterstützt die risikoadjustierte Priorisierung, indem therapeutische Effekte auf Stamm- und Vorläuferzellkompartmente voneinander unterschieden werden.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in der Immunhistochemie und der fluoreszierenden Mikroskopie zur multiplexen Detektion.
- Setzt den Zugang zu einer Antigen-Retrieval-Ausrüstung (Mikrowelle, Citratpuffer) und die Möglichkeit zur sequenziellen Inkubation mit Antikörpern voraus.
- Erfordert eine standardisierte Vorgehensweise zwischen verschiedenen Arbeitsgruppen bei Blockierung, Waschschritten und Einbettung, um Batch-Effekte zu minimieren.
- Die Übertragung auf verschiedene Modellsysteme erfordert die Validierung der Antikörperspezifität und der Gewebedurchlässigkeit in jedem jeweiligen Kontext.
- Praktische Einschränkungen beinhalten das Risiko einer Epitopmaskierung sowie die Notwendigkeit, Analoga-Dosierungsschemata zu optimieren, um Toxizität zu vermeiden.
