Computer-assisted Großflächige Visualisierung und Quantifizierung der Inselzellen der Bauchspeicheldrüse Masse, Größenverteilung und Architektur

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, unverzerrte repräsentative Daten innerhalb einer begrenzten Stichprobe zu sammeln und die komplexe dreidimensionale Struktur des Gewebes präzise zu analysieren. Dies wird erreicht, indem zunächst virtuelle Schnitte von immunohistonischen, chemisch gefärbten Pankreasschnitten erfasst werden. Dann werden die virtuellen Slices mit dem IHC-Makro für virtuelle Slices in der Image J-Software quantifiziert und die Daten mit Skripten analysiert, die für Mathematica geschrieben wurden.

Als nächstes wird eine 3D-Rekonstruktion der virtuellen Schichten mit Image J durchgeführt. Der letzte Schritt des Verfahrens besteht darin, einen Stapel einzelner Inselbilder mit der Diabuch-Software zu erfassen und die Bildstapel manuell in drei Dimensionen mit dem Stereo-Investigator zu kartieren. Letztendlich kann eine präzise Ösenarchitektur mit 3D-Koordinaten für jede Ösenzelle durch eine kombinierte Methode aus 3D-Bildgebung und manueller Kartierung erhalten werden. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der Adipositas- und Diabetesstudien zu beantworten, z. B. wie physiologische und physiologische Bedingungen die Bauchspeicheldrüse, die Massenverteilung der Betazellen und die Architektur beeinflussen.

Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf die Diagnose oder Therapie von Fettleibigkeit und Diabetes Melitis, da ein besseres Verständnis der Veränderungen der Betazellmasse die Entwicklung und Bewertung therapeutischer Interventionen erleichtern wird. Obwohl die in der vorliegenden Studie beschriebenen Methoden speziell Einblicke in die dynamische immunhistochemische Analyse der Bauchspeicheldrüse geben, können sie auch auf eine Reihe anderer Organismen und Gewebe angewendet werden. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die computergestützten Analyseschritte schwer zu erlernen sind.

Wegen der Komplexität der Analyse solch großer Datensätze in zwei und drei Dimensionen. Beginnen Sie diesen Vorgang, indem Sie einen sauberen Objektträger, der einen gesamten Abschnitt einer immunhistofarbenen, chemisch gefärbten Bauchspeicheldrüse hält, in den Halter eines Fluoreszenzmikroskops legen. Öffnen Sie die Stereo Investigator Software und visualisieren Sie die Probe, indem Sie auf Aufnahme klicken.

Und dann das Live-Bild. Bestimmen Sie die Belichtungsstufen für jeden Kanal mithilfe des Videohistogramm-Fensters, in dem die Intensität der Fluoreszenz angezeigt wird. In diesem Beispiel wird Kanal zwei für DAP, P, Kanal drei für GFP, Kanal vier für RFP, Kanal fünf für sci fünf und Kanal sechs für SCI sieben verwendet.

Passen Sie im Fenster mit den Kameraeinstellungen die Belichtungsstufe so an, dass die Fluoreszenzintensität abnimmt. Am rechten Ende des Videohistogramms kann das Bild mit dem Mikroskop-Fokusrad fokussiert werden. Bevor Sie eine virtuelle Schicht erstellen, konturieren Sie die Probe, indem Sie auf dem Bildschirm auf einen Punkt klicken, der von der Probe entfernt ist, wodurch ein Referenzpunkt markiert wird.

Klicken Sie dann um den Umriss des Musters, wenn die Kontur fertig ist. Klicken Sie mit der rechten Maustaste, und wählen Sie Kontur schließen, um den Anfangs- und Endpunkt zu verbinden, sobald die Kontur geschlossen ist, nehmen Sie eine virtuelle Schicht für das Sample auf, indem Sie "Erfassung" auswählen, und erfassen Sie dann "Virtuelle Schicht". Wenn die Optionen für das virtuelle Slice-Fenster geöffnet werden, wählen Sie High Speed Acquire (Hochgeschwindigkeitserfassung) aus und deaktivieren Sie die manuelle Erfassung.

Fokussieren Sie, indem Sie das Kontrollkästchen neben manuell deaktivieren. Speichern Sie die Datei. Kalibrieren Sie die Voreinstellung, indem Sie mit der rechten Maustaste klicken und Zur Liste der Fokuswebsite hinzufügen auswählen.

Manuelles Fokussieren mehrerer zufälliger Abschnitte in der Vorschau des virtuellen Slices Wenn mehrere Sites fokussiert wurden, starten Sie den virtuellen Slice, indem Sie mit der rechten Maustaste klicken und auswählen. Starten Sie den virtuellen Slice mit prefo, nachdem der virtuelle Slice für das erste Sample abgeschlossen ist, wechseln Sie zum nächsten Kanal und passen Sie die Belichtung entsprechend an. Dieses Verfahren wird für jeden Kanal wiederholt, um eine Quantifizierung der Ösen durchzuführen. Verarbeiten Sie die Bilder mit einem Bild-J-Makro namens I-H-C-V-S, das zuerst geladene Bilder für die Analyse vorbereitet und dann Merkmale von Ösen, wie z. B. die zelluläre Zusammensetzung, quantifiziert.

Das I-H-C-V-S-Makro unterteilt den Stack in die entsprechenden Farbkanäle. In Bild konvertiert J jedes Bild in eine Schwarz-Weiß-Maske mit acht Bit. Nach automatischer Intensität, Thresholding und Addition der einzelnen Kanalbilder werden die einzelnen Kanalbilder arithmetisch zu einer zusammengesetzten Maske addiert.

Die integrierte Partikelanalyse von Image J auf dem Kompositbild identifiziert dann interessante Bereiche oder ROIs, während Partikel, die kleiner als eine Betazelle sind, ausgeschlossen werden. Die Quantifizierung von ROIs. Mit Bild J wird eine Tabelle mit Zellenparametern erstellt.

Speichern Sie die aggregierten Ergebnisse in einer Excel-Tabelle. Speichern von Daten wie der Kreisförmigkeit des Bereichsumfangs, des Fer-Durchmessers und des Ösenmittelpunkts für jede Öse zusammen mit den entsprechenden Zahlen, die im Bild beschriftet sind. Die rechnerische Analyse dieser Parameter kann wie im schriftlichen Protokoll beschrieben durchgeführt werden. Um Informationen einschließlich der Ösenverteilung und der Häufigkeitsanalyse anzuzeigen, führen Sie eine 3D-Rekonstruktion virtueller Schichten durch, indem Sie ein Skript ausführen, das alle JP two-Bilder im Verzeichnis in TIF-Dateien konvertiert, das Format ist, das bei der Konstruktion und Quantifizierung von dreidimensionalen Stapeln aus den virtuellen Schichten verwendet wird.

Hier wird ein Skript namens I MJ two two tiff verwendet. Kopieren Sie das Skript in das Verzeichnis, das die beiden JP-Bilder enthält. Führen Sie das Skript mit der Linux-Shell aus, indem Sie den Punktschrägstrich I am JP two two TIFF in die Konsole eingeben und dann die Eingabetaste drücken.

Wenn alle aufgenommenen Bilder von JP 2 in TIFF-Dateien konvertiert wurden, können sie für die Analyse in Bild J verwendet werden.Öffnen Sie mit Bild J alle Bilder für die erste Probe, die in diesem Fall von einer menschlichen fötalen Bauchspeicheldrüse stammen, und fügen Sie sie zu einem zusammen, indem Sie Bild, Farbe, und dann Kanäle zusammenführen. Wiederholen Sie diesen Vorgang für jedes der Beispiele, wenn alle Muster als Einzelbilder kombiniert wurden. Bereinigen Sie die Bilder, indem Sie unerwünschte Bereiche mit dem Polygonauswahlwerkzeug auswählen.

Füllen Sie sie, indem Sie Bearbeiten und dann Füllen auswählen. Konvertieren Sie jedes Bild in ein RGB-Farbbild. Erstellen Sie abschließend einen Stapel aus den Bildern, nach dem sie weiter mit dem Stack Reg-Plugin ausgerichtet werden können.

Durch das Zusammenführen der Kanäle und das Kombinieren der Bilder entsteht schließlich eine 3D-Montage aller Ösen in der gesamten Bauchspeicheldrüse. Um Bildstapel zu sammeln, platzieren Sie die gesamten Pankreasösen der Montierung unter dem Mikroskop. Tragen Sie Wasser auf, wenn Sie ein Wasserimmersionsobjektiv verwenden.

Öffnen Sie die Diabuch-Software, greifen Sie auf die Aufnahme- und Fokussteuerung zu, indem Sie Strg plus Umschalttaste plus E im Fokussteuerungsfenster drücken. Stellen Sie das Ziel auf 20 oder 40 Mal ein, je nach Größe der Öse. Um das Mikroskopokular zur Ortung der Ösen zu verwenden, stellen Sie bin auf zwei Mal und den Filtersatz auf Benutzer eins ein.

Im Fokussteuerungsfenster sollte die Emissionsauswahl auf 100 % eingestellt werden. Augen in Neutraldichte sollten auf einen Klick auf GFP ey eingestellt werden, und dann den Boden öffnen, um das Muster in der Folienmappe zu visualisieren, zum Fokussteuerungsfenster zurückkehren und den Filter auf fixieren umstellen. Klicken Sie dann auf G-F-P-D-S. Verwenden Sie den Joystick, um die Öse in der Kamera so gut wie möglich um ein Fenster zu zentrieren.

Fokussieren Sie auf eine Tiefe irgendwo in der Nähe der Mitte der Öse, wo die Zellen leicht zu erkennen sind. Wählen Sie im Fenster zur Fokussteuerung das Zab aus. Verwenden Sie die Zielfernrohrsteuerung, um bis zur obersten Tiefe der Öse zu scrollen, in der Merkmale deutlich erkennbar sind, und klicken Sie auf Oben einstellen.

Scrollen Sie zum unteren Rand der Öse, und klicken Sie auf Festlegen. Klicken Sie unten auf "Los". Um zum Referenzpunkt im Aufnahmefenster zurückzukehren, klicken Sie auf Erweitert und dann auf Wechsel zum Kanalmodus.

Stellen Sie den Bin-Faktor auf das Zweifache und den Aufnahmetyp auf 3D auf der rechten Seite des Fensters ein, klicken Sie auf Obere und untere Positionen verwenden und kehren Sie nach der Aufnahme zur mittleren Lautstärke zurück. Legen Sie die Schrittweite auf drei fest. Legen Sie fest, dass das Filterset unter dem Feld für das Filterset aktiv ist.

Wählen Sie DAP, E-D-S-U-G-F-P-D-S-U-R-F-P-D-S-u und SCI five DSU. Klicken Sie für jeden auf "Am besten finden" unter "Belichtung anpassen". Klicken Sie dann auf Test, um sicherzustellen, dass die ausgewählte Belichtung geeignet ist.

Klicken Sie auf Start, um die Erfassung zu starten. Wenn die Erfassung abgeschlossen ist, passen Sie die Ebenen nach Bedarf an, und ändern Sie die angezeigte Farbe für RFP in Weiß. Speichern Sie die Folie und wechseln Sie zur Ansicht des Exports der TIFF-Serie.

Geben Sie den Namen der Folie mit einem Bindestrich am Ende ein und speichern Sie sie. Es werden Dutzende von einzelnen TIF-Dateien erstellt, daher kann es hilfreich sein, jeden Ösen-Bildstapel in einem separaten Ordner aufzubewahren. Um Bildstapel zuzuordnen, öffnen Sie die Stereo Investigator-Software.

Visualisieren Sie das Bild, indem Sie die Bildstapel im Menü für die Bildskalierung öffnen. Stellen Sie den Abstand zwischen den Bildern auf drei Mikrometer ein, um eine zweifache Biegung zu korrigieren. Wählen Sie in der Diasammlung die Option X- und Y-Skalierung überschreiben aus, und verwenden Sie eine angegebene Quelle für die X- und Y-Skalierung.

Geben Sie 0,65 sowohl für die X- als auch für die Y-Mitte ein und vergrößern Sie das Bild, indem Sie auf die Zoom-Schaltfläche klicken, und dann in der Mitte der im Makrofenstermarkt interessierenden Ilis mindestens eine Zelle. Mit dem entsprechenden Marker erscheinen Betazellen grün. Alpha-Zellen werden rot und Delta-Zellen werden weiß angezeigt.

Markieren Sie die Zellen in der Mitte ihres Zellkerns, die blau erscheinen, wenn die Probe mit DPI gefärbt wurde. Verwenden Sie Marker zwei, um Betazellen zu markieren. Markierung fünf, um Alpha-Zellen zu markieren, und Markierung sechs, um Delta-Zellen zu markieren. Sobald mindestens eine Zelle markiert wurde, zeigen Sie die orthogonale Ansicht über das Symbol im oberen Menü an, aktivieren Sie Z-Filter und symmetrisch.

Der Bereich sollte auf 15.00 eingestellt sein. Beginnend bei 0,0 Z.Scrollen Sie mit dem Mausrad durch die Ösen und markieren Sie jede Zelle mit der entsprechenden Markierung: Markieren Sie jede Zelle nur einmal in der Mitte ihrer Tiefe. Nachdem Sie die einzelnen Z-Ebenen markiert haben, kann das Kontrollkästchen für den Z-Filter deaktiviert werden.

Dadurch werden alle Marker aus allen Z-Ebenen angezeigt. Wenn alle Zellen markiert sind, speichern Sie die Datei als DAT-Datei. Gehen Sie dann zur Ablaufverfolgung für den Dateiexport.

Speichern Sie die Ablaufverfolgung als TXT-Datei. Klicken Sie abschließend auf Neue Datendatei, um den Arbeitsbereich zu löschen, bevor Sie versuchen, neue Ösen zuzuordnen. Die Herstellung virtueller Schnitte aus einer immunhistochemisch gefärbten Pankreasprobe ermöglicht die gemeinsame Untersuchung der endokrinen Alpha-, Beta- und Delta-Zellen in der gesamten Bauchspeicheldrüse, da die immunhistochemische Färbung der Inselzellen für Insulin in grün, Glucagon in rot, Somatostatin in weiß und DAP in blau zu sehen ist.

Die Bilder werden dann nach dem automatischen Schwellenwert in die Acht-Bit-Maske konvertiert. Hier ist das Zusammenführungs-Composite-Bild zu sehen. Die Ösenverteilung mittels Virtual Slice ermöglicht aber auch eine individuelle Analyse in getrennten Kanälen.

Hier werden Ansichten der einzelnen Kanäle gezeigt, um die Delta-Zellen, Beta-Zellen und Alpha-Zellen zu zeigen. Die Partikelanalyse mit einer Maske, die durchgeführt wird, wenn die Kompositmaske alle Ösenstrukturen nummeriert und blau hervorgehoben ist. Die Partikelanalyse von Kompositmasken wird als Datentabelle ausgegeben, die Parameter wie die Rundheit des Islas-Bereichs und verschiedene Durchmesser für jede detektierte Öse enthält, deren IDs den nummerierten Tags auf der Kompositmaske entsprechen.

Die großflächige Analyse dieser Bilder führt zur Erstellung von Histogrammen der Gesamtanzahl der Ösen und der Größenverteilung sowie zu detaillierten Vergleichen von Alpha-, Beta- und Delta-Zellbereichen. Eyelet-Mapping und mathematische Analyse der zellulären Zusammensetzung und Architektur können eine einzelne Fokusebene aus einem 3D-rekonstruierten Stapel von Bildern menschlicher Ösen aufdecken, die in Stereo Investigator hochgeladen wurden. Hier befinden sich Beta-Zellen in grün, Alpha-Zellen in rot, Delta-Zellen in weiß und Zellkerne in blau.

Nach der Erfassung unterschiedlicher Ösen werden hier Alpha-, Beta- und Delta-Zellen in verschiedenen Meeresebenen markiert, Fluoreszenzbilder und die entsprechenden Kartendaten für drei verschiedene Fokusebenen im Abstand von 10 Mikrometern gezeigt. Nachdem die Alpha-, Beta- und Delta-Zellen in verschiedenen Ebenen markiert wurden, kann die Öse in 3D visualisiert werden. Hier ist eine 3D-Rekonstruktion der viertel geschnittenen Öse zu sehen, die auf Koordinaten basiert, die durch Ösenkartierung erhalten wurden.

Darüber hinaus kann die automatisierte mathematische Analyse von kartierten Ösen die zelluläre Zusammensetzung und Architektur anzeigen. Hier wird die relative Häufigkeit von Zellabständen zwischen zwei Zellen in einer einzigen Zellpopulation gezeigt. Ebenfalls dargestellt ist die relative Häufigkeit der Zellabstände zwischen zwei verschiedenen Zellpopulationen.

Ebenfalls dargestellt sind die kumulativen Wahrscheinlichkeiten von Zell-zu-Zell-Abstandsverteilungen für Alpha-zu-Alpha-, Beta-zu-Beta- und Delta-zu-Delta-Zellen. Der Cole-OV-, Smirnov- oder KS-Test kann mit diesen Wahrscheinlichkeiten durchgeführt werden, um die entsprechenden KS-Entfernungen zu erhalten. Einmal gemeistert, kann die großflächige Bildgebung und Analyse eines gesamten Gewebeschnitts in vier Stunden durchgeführt werden.

3D-Rekonstruktion eines Gewebeblocks kann in 30 Minuten durchgeführt werden. Schließlich können 3D-Bildgebung und manuelles Mapping in vier Stunden abgeschlossen werden, wenn es richtig durchgeführt wird. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, mit einer qualitativ hochwertigen immunhistochemischen Färbung der Schnitte zu beginnen.

Die Genauigkeit der anschließenden Analyse hängt von den Rohdaten ab. Stellen Sie außerdem sicher, dass Ihre Computer über mindestens acht Gigabyte RAM verfügen, um eine solche groß angelegte Analyse nach der Entwicklung zu verarbeiten. Diese Technik ebnete den Weg für Forscher, nicht nur auf dem Gebiet der Fettleibigkeit und Diabetes, sondern auch in vielen anderen Bereichen, die die pathologische Standardanalyse verwenden.

Dies kann besonders nützlich sein, wenn die Verfügbarkeit von Proben begrenzt ist. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie unverzerrte repräsentative Daten innerhalb einer begrenzten Stichprobengröße mit Standardtechniken sammeln können. Die Auswahl nur einer bestimmten Region ist möglicherweise nicht repräsentativ für das Gesamtbild, wie wir mit unserer Studie zur Verteilung der Pankreasösen gezeigt haben.