Name: Stabilisierte longitudinale In Vivo Visualisierung der Bauchspeicheldrüse auf zellulärer Ebene in einem Murinenmodell mit einem Pankreas-Intravital-Bildgebungsfenster (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-06T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 52 s
Description: Erfahren Sie die stabilisierte longitudinale In-vivo-Bildgebung der Bauchspeicheldrüse auf zellulärer Ebene mit einem neuartigen Pankreas-Intravital-Bildgebungsfenster. Diese Methode ermöglicht bewegungslose, hochauflösende 3D-Aufnahmen über drei Wochen.

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Diese Studie wurde durch den Zuschuss Nr. 14-2020-002 des SNUBH Research Fund und durch den von der koreanischen Regierung (MSIT) finanzierten Zuschuss der National Research Foundation of Korea (NRF) (NRF-2020R1F1A1058381, NRF-2020R1A2C3005694) unterstützt.

Alle in diesem Artikel beschriebenen Verfahren wurden in Übereinstimmung mit der8. Ausgabe des Leitfadens für die Pflege und Verwendung von Versuchstieren (2011)26 durchgeführt und vom Institutional Animal Care and Use Committee am Korea Advanced Institute of Science and Technology (KAIST) und dem Seoul National University Bundang Hospital (SNUBH) genehmigt.
1. Vorbereitung des Fensters und anderer Materialien
<ol><li>Entwerfen Sie das intravitale Bildgebungsfenster der Bauchspeicheldrüse individuell, um die Bauchspeicheldrüse vom Darm in der Bauchhöhle abzuschöpfen18 (Abbildung 1A, B). Ein detaillierter Bauplan des Fensters ist in einer ergänzenden Abbildung einer früheren Studiebeschrieben 18.</li>
	<li>Verwenden Sie C57BL / 6N-Mäuse, 8-12 Wochen alte Männchen, für die intravitale Pankreasbildgebung. Injizieren Sie Anti-CD31-Antikörper, konjugiert mit einem Alexa 647-Fluorophor, 2 h vor der Bildgebung, zum Zwecke der Gefäßmarkierung18.</li>
	<li>Bereiten Sie für die Inselchenstudie ein transgenes Mausmodell vor, bei dem die Inseln mit einem fluoreszierenden Reporterprotein markiert werden. Hier verwendeten wir MIP-GFP, bei dem grün fluoreszierendes Protein unter der Kontrolle des Insulin-1-Genpromotors der Maus exprimiert wurde, der in den Betazellen aller Inseln der Maus aktiv ist24.</li>
	<li>Bereiten Sie für die Bauchspeicheldrüsenkrebsstudie transgene Krebszellen vor, die mit einem fluoreszierenden Reporterprotein und BALB / C-Nacktmäusen markiert sind. In dieser Studie wurden die PANC-1 NucLight Red-Zellen verwendet. PANC-1 Krebszellen25 wurden mit der NucLight Red Fluoreszenzsonde markiert.</li>
	<li>Sterilisieren Sie alle chirurgischen Werkzeuge, Deckglas (mit PEG oder nicht) und Bildfenster mit einem Autoklaven.</li>
	<li>Tragen Sie die PEG-Beschichtung auf das Deckglas auf, um Entzündungsreaktionen zu verhindern und die Biokompatibilität zu erhöhen, die für die Langzeitbildgebung geeignet ist.</li>
</ol>2. Chirurgie
<ol><li>Bereiten Sie eine sterile chirurgische Plattform vor und sterilisieren Sie die Oberflächen mit 70% Ethanol. HINWEIS: Für longitudinale Bildgebungssitzungen ist eine aseptische Technik unerlässlich.</li>
	<li>Anästhesie von Mäusen mit einer Mischung aus Tiletamin/Zolazepam (30 mg/kg) und Xylazin (10 mg/kg). HINWEIS: Die Verwendung von Tiletamin / Zolazepam wird anstelle von Ketamin wegen seiner nachteiligen Wirkung von Hyperglykämie empfohlen. Optimale Anästhesie sollte für den Zweck des Experiments9,27ausgewählt werden.</li>
	<li>Überwachen Sie die Körpertemperatur mit einer Rektalsonde mit einem homöothermisch gesteuerten Heizkissen.</li>
	<li>Rasieren Sie die linke Flanke der Maus und tragen Sie drei Runden abwechselnd Alkohol und Jod-basiertes Peeling auf. HINWEIS: Wenn Enthaarungscreme verwendet wird, lassen Sie nicht länger als 1 Minute, um chemische Verbrennungen zu vermeiden.</li>
	<li>Machen Sie einen 1,5 cm großen Schnitt an der linken Flanke der Maus und sezieren Sie Haut und Muskeln.</li>
	<li>Führen Sie eine Geldbörsen-Saitennäht mit einer schwarzen oder Nylon-4-0-Naht am Schnittrand durch.</li>
	<li>Verwenden Sie einen Mikroretraktor auf dem Schnitt und legen Sie die Milz vorsichtig frei.</li>
	<li>Die Milz vorsichtig mit einer Ringzette zusammenlegen und die Bauchspeicheldrüse identifizieren.</li>
	<li>Platzieren Sie das Fenster an der Flanke der Maus und führen Sie Milz und Bauchspeicheldrüse durch den offenen Raum des Fensters. Die Manipulation der Bauchspeicheldrüse muss sehr nichtjüdisch sein, da sie Blutungen oder Pankreatitis verursachen kann</li>
	<li>Legen Sie die Bauchspeicheldrüse vorsichtig auf die Platte des Bildfensters; Die Milz wird auf den offenen Raum des Fensters gelegt.</li>
	<li>Für die Krebszellstudie injizieren Sie PANC-1 NucLight Red (1,0 x10 6 Zellen) direkt in die Bauchspeicheldrüse. HINWEIS: Für die Bildgebung der orthotopen humanen Bauchspeicheldrüsenkrebs-Xenotransplantate könnte die direkte Implantation von Krebszellen wie PANC-1 oder anderen menschlichen Bauchspeicheldrüsenkrebszellen erleichtert werden28. Zur Visualisierung mit intravitaler Fluoreszenzmikroskopie wurden PANC-1-Zellen mit rot fluoreszierendem Protein unter Verwendung des linsiviralen Reagenziens NucLight Red transduziert, das den Kern29markiert. Obwohl das maximale Injektionsvolumen unsicher ist, verringern Sie das Volumen so gut wie möglich, um den Druckeffekt in der Bauchspeicheldrüse zu vermeiden.</li>
	<li>Tragen Sie Tropfen N-Butylcyanoacrylatkleber auf den Rand des Bildfensters auf.<ol>
<li>Um die Menge des aufgetragenen Klebstoffs zu minimieren, verwenden Sie eine 31 G Katheternadel für die Anwendung. Wenn die Menge des Tropfens groß ist, haftet das Gewebe unbeabsichtigt am Fenster oder Deckglas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tragen Sie vorsichtig ein 12 mm rundes Deckglas auf den Rand des Bildfensters auf.</li>
	<li>Ziehen Sie die Nahtschlaufe, um in die seitliche Nut des Fensters zu passen, und binden Sie sie dreimal.</li>
	<li>Schneiden Sie die maximale proximale Stelle des Knotens ab, um die Unterbrechung enger Stiche zu verhindern, wenn diese Mäuse wach sind.</li>
	<li>Lassen Sie Mäuse sich von der Anästhesie erholen (2-3 Stunden) und injizieren Sie Ketoprofen (5 mg / kg, subkutan in die lose Haut an der Basis des Halses oder der Hüfte des Tieres) zur Schmerzlinderung. Neubewertung auf Anzeichen von Schmerzen alle 12 Stunden und Ketoprofen sollte alle 24 Stunden für 1-3 Tage in Betracht gezogen werden. HINWEIS: Analgesie beeinflusst die Insulinsekretion als Reaktion auf Glukose9. Die Wahl und der Zeitpunkt der Analgesie müssen für den experimentellen Zweck individualisiert werden.</li>
	<li>Unterbringung der Maus im Käfig mit ausreichender Einstreu, um den Kontakt des Fensters zum Käfig zu vermeiden. Vermeiden Sie es, das Haus mit den Mäusen ohne die Fensteroperation zu beherbergen.</li>
</ol>3. Intravitalen Bildgebung
<ol><li>Schalten Sie das Intravitalenmikroskop einschließlich der Laserleistung ein.</li>
	<li>Schalten Sie das Heizkissen ein und stellen Sie die homöotherme Regelung auf 37 °C ein. HINWEIS: Alternativ können Sie ein passives Heizkissen oder eine Lampe mit häufiger Steuerung verwenden, wenn keine homöotherme Regelung vorhanden ist.</li>
	<li>Führen Sie eine intramuskuläre Anästhesie mit einer Mischung aus Tiletamin/Zolazepam (30 mg/kg) und Xylazin (10 mg/kg) durch. HINWEIS: Die Verwendung von Tiletamin / Zolazepam wird anstelle von Ketamin wegen seiner nachteiligen Wirkung von Hyperglykämie empfohlen. Optimale Anästhesie sollte für den Zweck der Experimente9,27ausgewählt werden.</li>
	<li>Führen Sie einen Gefäßkatheter für die Injektion ein.<ol>
<li>Drücken Sie mit dem Zeigefinger und dem dritten Finger als Alternative zu einer Tourniquet-Anwendung auf die proximale Seite des Schwanzes. Erhitzen Sie den Schwanz bei Bedarf mit einer Lampe.</li>
		<li>Sterilisieren Sie die Schwanzvene mit einem 70% Ethanolspray.</li>
		<li>Führen Sie einen 30 G Katheter in die seitliche Schwanzvene ein. Das Aufstoßen des Blutes wird in der PE10-Röhre visualisiert.</li>
		<li>Tragen Sie ein Seidenband auf den Katheter auf, um ihn zu stabilisieren.</li>
		<li>Injizieren Sie FITC/TMR-Dextran oder andere fluoreszierende Sonden (25 μg Anti-CD31 konjugiert mit Alexa 647), je nach Bedarf, entsprechend der Kombination der fluoreszierenden Sonden18. HINWEIS: Für fluoreszierende konjugierte Antikörpersonden 2 h vor der Bildgebungssitzung injizieren.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Übertragen Sie die Maus von der operationsigen Plattform in die bildgebungsgebende Phase.</li>
	<li>Setzen Sie eine Rektalsonde ein, um die Körpertemperatur mit dem homöothermischen Heizkissensystem automatisch zu steuern.</li>
	<li>Setzen Sie das Pankreasbildfenster in den Fensterhalter ein, der während der IntravitalenMikroskopie vorbereitet wurde (Abbildung 2). Für ein invertiertes Mikroskop ist möglicherweise kein Fensterhalter erforderlich.</li>
	<li>Führen Sie eine intravitalen Bildgebung durch.<ol>
<li>Für die Abbildung der Bauchspeicheldrüse beginnen Sie mit einer Objektivlinse mit niedriger Vergrößerung (z. B. 4x), um die gesamte Ansicht der Bauchspeicheldrüse im Pankreasbildfenster zu scannen (empfohlenes Sichtfeld: 2500 x 2500 μm).</li>
		<li>Nach der Bestimmung des interessierenden Bereichs wechseln Sie zu einem Objektiv mit höherer Vergrößerung (20x oder 40x), um die Bildgebung auf zellulärer Ebene durchzuführen (empfohlenes Sichtfeld: 500 x 500 μm oder 250 x 250 μm). In diesem Experiment betrug die laterale und axiale Auflösung etwa 0,5 μm bzw. 3 μm.</li>
		<li>Führen Sie Z-Stack- oder Zeitrafferbilder durch, um die 3D-Struktur oder die Dynamik auf zellulärer Ebene, wie z. B. die Zellmigration, zu beobachten. HINWEIS: Für die Bildgebung der fluoreszierenden Protein-exprimierenden Zellen transgener Tiere (MIP-GFP) waren 30 s intermittierende 488 nm Laserbelichtung mit einer Leistung von bis zu 0,43 mW ohne merkliche Photobleachung oder Gewebeschädigung tolerierbar. Für die Abbildung der mit Alexa 647 markierten fluoreszierenden Proteine war die 640 nm Laserleistung bis 0,17 mW ohne merkliche Photobleaching oder Gewebeschädigung tolerierbar. Eine längere Erregungslaserbelichtung mit einer Leistung oberhalb dieser Einstellung kann zu Photobleaching oder Gewebeschäden durch Phototoxizität führen. Passen Sie die angemessene Verstärkung und Leistung an, um den interessierenden Bereich angemessen abbilden zu können. Die detaillierte Einstellung der Parameter in der Intravitalmikroskopie muss für jede im Institut erstellte Intravitalenmikroskopie individualisiert werden.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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<li>Garcia, P. L., Miller, A. L., Yoon, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+xenograft+models+of+pancreatic+cancer%3A+overview+and+comparison+with+other+types+of+models%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Patient-derived xenograft models of pancreatic cancer: overview and comparison with other types of models.</a> Cancers (Basel). 12 (5), 1327(2020).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preiszugeben.

Das hier beschriebene Protokoll besteht aus der intravitalen Bildgebung der Bauchspeicheldrüse unter Verwendung eines neuartigen unterstützenden integrierten pankreatischen intravitalen Bildgebungsfensters, das von einem abdominalen Bildgebungsfenster modifiziert wurde. Unter den oben beschriebenen Protokollen ist der erste kritische Schritt die Implantation des intravitalen Pankreas-Bildgebungsfensters in die Maus. Für das Auftragen des Klebstoffs im Fenster ist es wichtig, den Kleber zwischen dem Rand des Fensters und ...

Die Bauchspeicheldrüse ist ein Bauchorgan mit einer exokrinen Funktion im Verdauungstrakt und einer endokrinen Funktion, Hormone in den Blutkreislauf zu sezernieren. Hochauflösende zelluläre Bildgebung der Bauchspeicheldrüse könnte die Pathophysiologie verschiedener Erkrankungen der Bauchspeicheldrüse aufdecken, darunter Pankreatitis, Bauchspeicheldrüsenkrebs und Diabetes mellitus1. Herkömmliche diagnostische Bildgebungswerkzeuge wie Computertomographie, Bildgebung mit magnetischer Auflösung und Ultraschall sind im klinischen Bereich weit verbreitet1,2. Diese Bildgebungsmodalitäten beschränken sich jedoch darauf, nur strukturelle oder anatomische Veränderungen zu visualisieren, während Veränderungen auf zellulärer oder molekularer Ebene nicht bestimmt werden können. Da molekulare Veränderungen bei Diabetes mellitus oder Bauchspeicheldrüsenkrebs beim Menschen mehr als 10 Jahre vor der Diagnose3,4beginnenkönnen,hat die Erkennung von Pankreaserkrankungen aus ihrem molekularen Übergang während der Latenzzeit das Potenzial, eine frühzeitige Diagnose und eine rechtzeitige Intervention zu ermöglichen. So wird eine Bildgebung, die die Einschränkungen der Auflösung überwindet und wertvolle Einblicke in die Funktion liefert, bemerkenswert aufmerksamkeitserregen, indem sie eine frühzeitige Diagnose von Bauchspeicheldrüsenkrebs oder eine fortgeschrittene Identifizierung der Veränderung der Inseln während des Fortschreitens von Diabetes mellitus5ermöglicht.
Insbesondere bei den Inseln wurden die nukleare Bildgebung, die Biolumineszenzbildgebung und die optische Kohärenztomographie als nicht-invasive Inselbildgebungsverfahren vorgeschlagen6. Die Auflösung dieser Methoden ist jedoch im Wesentlichen niedrig, mit typischen Werten von mehreren zehn bis hunderten Mikrometern, die eine begrenzte Fähigkeit bieten, Veränderungen auf zellulärer Ebene in den Inseln zu erkennen. Auf der anderen Seite wurden frühere hochauflösende Studien von Inseln unter ex vivo7,8 (z. B. Schneiden oder Verdauung der Bauchspeicheldrüse), nicht-physiologischen9 (z. B. Exteriorisierung der Bauchspeicheldrüse) und heterotopenZuständen 10,11,12 (z. B. Implantation unter der Nierenkapsel, in der Leber und in der vorderen Augenkammer) durchgeführt, was ihre Interpretation und klinischen Auswirkungen einschränkt. Wenn in vivoein physiologisches und orthotopisches Modell der hochauflösenden Bildgebung etabliert werden kann, wird es eine kritische Plattform für die Untersuchung von Pankreasinseln sein.
Die intravitale Bildgebung, die die Pathophysiologie bei einer mikroskopischen Auflösung bei einem lebenden Tier aufzeigen, hat kürzlich große Aufmerksamkeit erhalten13. Von den in vivo bildgebenden Verfahren hat die Entwicklung eines abdominalen Bildgebungsfensters14, das ein Fenster in den Bauch einer Maus implantiert, die Entdeckung neuer Erkenntnisse ermöglicht (d.h. ein Prä-Mikrometastasierungsstadium der frühen Lebermetastasierung15 und Mechanismus der Stammzellerhaltung im Darmepithel16). Obwohl das abdominale Bildgebungsfenster wertvolle Ergebnisse liefert, wurden die Anwendungen dieses Fensters für die Bauchspeicheldrüse und die daraus resultierende intravitale Bildgebungsforschung auf der Grundlage von Erkrankungen der Bauchspeicheldrüse nicht umfassend untersucht.
Im Gegensatz zu den gut definierten festen Organeigenschaften der menschlichen Bauchspeicheldrüse ist die Bauchspeicheldrüse einer Maus eine diffus verteilte weichteilartige Struktur17. Daher wird es unaufhörlich durch physiologische Bewegungen einschließlich Peristaltik und Atmung beeinflusst. Eine frühere Studie über die Anwendung eines abdominalen Bildgebungsfensters für die Bauchspeicheldrüse zeigte, dass das Wandern aufgrund von Bewegungsartefakten auftrat, die durch Stuhlgang induziert wurden18. Im resultierenden gemittelten Bild wurden starke Unschärfen beobachtet, die die Visualisierung und Identifizierung der mikroskaligen Strukturen behinderten.
Hierin beschreiben wir die Verwendung eines neuartigen unterstützenden basenintegrierten pankreasintevitalen intravitalen Bildgebungsfensters in Kombination mit der intravitalenMikroskopie 19,20, um die longitudinalen zellulären Ereignisse bei Erkrankungen der Bauchspeicheldrüse zu untersuchen. Neben einer detaillierten Beschreibung der Methodik in der vorangegangenen Studie18wird in diesem Beitrag die erweiterte Anwendung des Pankreas-Bildgebungsfensters für verschiedene Erkrankungen der Bauchspeicheldrüse behandelt. In diesem Protokoll wurde ein speziell angefertigtes videorates Laser-Scanning-konfokale Mikroskopiesystem als intravitale Mikroskopiesystem verwendet. Vier Lasermodule (Wellenlängen bei 405, 488, 561 und 640 nm) wurden als Anregungsquelle verwendet, und vier Kanäle von Emissionssignalen wurden durch Photomultiplierröhren (PMT) durch Bandpassfilter (BPF1: FF01-442/46; BPF2: FF02-525/50; BPF3: FF01-600/37; BPF4: FF01-685/40). Laserscanning bestand aus einem rotierenden polygonalen Spiegel (X-Achse) und einem Galvanometer-Scanning-Spiegel (Y-Achse), der das Scannen der Videorate (30 Bilder pro Sekunde) ermöglichte. Detaillierte Informationen über die intravitalen Mikroskopie wurden in den vorherigen Studien10,18,19,20,21,22,23beschrieben.
In unserer vorherigen Inselstudie18haben wir die Inseln in lebenden Mäusen mit einem transgenen Mausmodell (MIP-GFP)24, in dem die Inseln mit GFP markiert wurden, erfolgreich und stabil abgebildet. Die Methode ermöglichte eine hochauflösende Visualisierung der Veränderungen in den Inseln über einen Zeitraum von 1 Woche. Es erleichterte auch die Bildgebung der gleichen Inseln für bis zu 3 Wochen, was auf die Machbarkeit von Langzeitstudien der Pankreasinseln für die funktionelle Verfolgung oder Überwachung während der Pathogenese von Diabetes mellitus18hindeutet. Des Weiteren entwickelten wir ein orthotopes Bauchspeicheldrüsenkrebsmodell, bei dem fluoreszierende Bauchspeicheldrüsenkrebszellen (PANC-1 NucLight Red)25 direkt in die Bauchspeicheldrüse der Maus implantiert wurden. Mit der Anwendung des pankreatischen intravitalen Bildgebungsfensters könnte dieses Modell als Plattform zur Untersuchung der zellulären und molekularen Pathophysiologie in der Tumormikroumgebung von Bauchspeicheldrüsenkrebs und zur therapeutischen Überwachung neuartiger Wirkstoffkandidaten genutzt werden.

<table><tbody><tr><td>Alexa Fluor 647 Succinimidylester (NHS-Ester)</td><td>Invitrogen</td><td>A20006</td><td>Fluoreszenzsonde zum Konjugat mit Antikörper</td></tr><tr><td>BALB/C Nude</td><td>OrientBio</td><td>BALB/C Nude</td><td>BALB/C Nude</td></tr><tr><td>BD Intramedic Polyethylenschlauch</td><td>BD Biosciences</td><td>427401</td><td>PE10 Katheter zum Anschluss an die Nadel</td></tr><tr><td>C57BL/6N</td><td>OrientBio</td><td>C57BL/6N</td><td>C57BL/6N</td></tr><tr><td>Deckglas rund</td><td>Marienfeld</td><td>0111520</td><td>Deckglas für Pankreas-Bildgebungsfenster</td></tr><tr><td>FITC Dextran 2MDa</td><td>Merck (ehemals Sigma Aldrich)</td><td>FD200S</td><td>Zur Gefäßidentifikation</td></tr><tr><td>IMARIS 8.1</td><td>Bitplane</td><td>IMARIS</td><td>Bildverarbeitung</td></tr><tr><td>Intravitalmikroskopie</td><td>IVIM tech</td><td>IVM-C</td><td>Intravitalmikroskopie</td></tr><tr><td>IRIS Schere</td><td>JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD</td><td>S-1107-10</td><td>Dieses Produkt kann durch das Produkt eines anderen Unternehmens ersetzt werden</td></tr><tr><td>Loctite 401</td><td>Henkel</td><td>401</td><td>N-Butylcyanacrylat-Kleber</td></tr><tr><td>Mikronadelhalter</td><td>JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD</td><td>H-1126-10</td><td>Dieses Produkt kann durch das Produkt eines anderen Unternehmens ersetzt werden</td></tr><tr><td>Micro rectractor</td><td>JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD</td><td>17004-03</td><td>Dieses Produkt kann durch das Produkt der anderen Firma</td></tr><tr><td>Micropinps</td><td>JEUNGDO BIO & ersetzt werden PLANT CO, LTD</td><td>F-1034</td><td>Dieses Produkt kann durch das Produkt der anderen Firma</td></tr><tr><td>MIP-GFP</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>006864</td><td>B6 ersetzt werden. Cg-TG (Ins1-EGFP) 1Hara / J</td></tr><tr><td>Nylon 4-0</td><td>AILEE</td><td>NB434</td><td>Nicht resorbierbares Nahtmaterial</td></tr><tr><td>Omnican N 100 30G</td><td>B BRAUN</td><td></td> FT9172220S <td>Für Gefäßkatheter verwenden Sie nur das Nadelteil</td></tr><tr><td>PANC-1 NucLightRed</td><td>Sonderanfertigung</td><td>Sonderanfertigung</td><td>im Labor</td></tr><tr><td>Pankreas-Bildgebungsfenster</td><td>Geumto Engineering</td><td>Sonderanfertigung</td><td>Pankreas-Bildgebungsfenster - Sonderanfertigung</td></tr><tr><td>Physiosuite</td><td>Kent Scientific</td><td>PS-02</td><td>Homöothermer Temperaturregler</td></tr><tr><td>Gereinigt NA/LE Ratte Anti-Maus CD31</td><td>BD Biosciences</td><td>553708</td><td>Antikörper für die in vivo Gefäßmarkierung</td></tr><tr><td>Ringzange</td><td>JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD</td><td>F-1090-3</td><td>Dieses Produkt kann durch das Produkt eines anderen Unternehmens ersetzt werden</td></tr><tr><td>Rompun</td><td>Bayer</td><td>Rompun</td><td>Anästhetikum</td></tr><tr><td>TMR Dextran 65-85kDa</td><td>Merck (ehemals Sigma Aldrich)</td><td>T1162</td><td>Für die Gefäßidentifikation</td></tr><tr><td>Fensterhalter</td><td>Geumto Engineering</td><td>Sonderanfertigung</td><td>Fensterhalter - Sonderanfertigung</td></tr><tr><td>Zoletil</td><td>Virbac</td><td>Zoletil 100</td><td>Betäubungsmittel</td></tr></tbody></table>

stabilisierte longitudinale in vivo visualisierung der bauchspeicheldrüse auf zellulärer ebene in einem murinenmodell mit einem pankreas-intravital-bildgebungsfenster

Stabilized Longitudinal In Vivo Cellular-Level Visualization of the Pancreas in a Murine Model with a Pancreatic Intravital Imaging Window

Die direkte in vivo zelluläre Bildgebung der Bauchspeicheldrüse in einem lebenden Kleintiermodell war technisch anspruchsvoll. Eine kürzlich durchgeführte intravitale Bildgebungsstudie mit einem abdominalen Bildgebungsfenster ermöglichte die Visualisierung der zellulären Dynamik in Bauchorganen in vivo. Aufgrund der weichen blattartigen Architektur der Bauchspeicheldrüse der Maus, die leicht durch physiologische Bewegungen (z. B. Peristaltik und Atmung) beeinflusst werden kann, war es jedoch schwierig, eine stabilisierte longitudinale In-vivo-Bildgebung über mehrere Wochen auf zellulärer Ebene durchzuführen, um Inselchen oder Krebszellen in der Bauchspeicheldrüse der Maus zu identifizieren, zu verfolgen und zu quantifizieren. Hierin beschreiben wir eine Methode zur Implantation einer neuartigen Stützbasis, einem integrierten pankreatischen intravitalen Bildgebungsfenster, das die Bauchspeicheldrüse räumlich vom Darm trennen kann, um die intravitalen Bildgebung der Bauchspeicheldrüse in Längsschnitt zu drehen. Die longitudinale In-vivo-Bildgebung mit dem Bildgebungsfenster ermöglicht eine stabile Visualisierung, die die Verfolgung von Inseln über einen Zeitraum von 3 Wochen und eine hochauflösende dreidimensionale Abbildung der Mikrostruktur ermöglicht, wie hier in einem orthotopen Bauchspeicheldrüsenkrebsmodell gezeigt. Mit unserer Methode können weitere intravitalen bildgebenden Untersuchungen die Pathophysiologie verschiedener Erkrankungen der Bauchspeicheldrüse auf zellulärer Ebene aufklären.

Die Intravitalenmikroskopie in Kombination mit dem unterstützenden Basen-integrierten pankreasinen intravitalen Bildgebungsfenster ermöglicht die longitudinale zelluläre Bildgebung der Bauchspeicheldrüse in einer Maus. Dieses Protokoll mit dem intravitalen Bildgebungsfenster der Bauchspeicheldrüse bietet eine langfristige Gewebestabilität, die die Erfassung einer hochauflösenden Bildgebung ermöglicht, um einzelne Inseln für bis zu 3 Wochen zu verfolgen. Dadurch können Mosaikbilder für ein erweitertes Sichtfeld, dreidimen...

In vivo wurde die hochauflösende Bildgebung der Bauchspeicheldrüse mit dem pankreasinen intravitalen Bildgebungsfenster erleichtert.

Stabilisierte longitudinale In Vivo Visualisierung der Bauchspeicheldrüse auf zellulärer Ebene in einem Murinenmodell mit einem Pankreas-Intravital-Bildgebungsfenster

Direct in vivo cellular-resolution imaging of the pancreas in a live small animal model has been technically challenging. A recent intravital imaging ...

Dieses Protokoll beschreibt eine stabilisierte und sich wiederholende zelluläre In-vivo-Bildgebung der Bauchspeicheldrüse mit einem neuartigen intravitalen Bildgebungsfenster der Bauchspeicheldrüse. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass es möglich ist, bewegungslose, dreidimensionale Bildgebung mit Auflösung bis zur zellulären Ebene über drei Wochen in der Bauchspeicheldrüse einer lebenden Maus durchzuführen. Beginnen Sie mit der Vorbereitung der chirurgischen Plattform und desinfizieren Sie die Oberflächen mit 70% Ethanol.Verwenden Sie nach der Betäubung eine rektale Sonde mit einem homöothermisch gesteuerten Heizkissen, um die Körpertemperatur zu überwachen. Entfernen Sie haare von der linken Flanke der Maus und tragen Sie alternativ Alkohol und Jod auf, rotieren Sie von der Inzisionsstelle zur äußeren Oberfläche, gehen Sie nie zurück zur Inzisionsstelle und enden Sie mit Jod. Machen Sie dann einen 1,5 Zentimeter genauen Schnitt an der linken Flanke der Maus und sezieren Sie die Haut und den Muskel.Verwenden Sie eine schwarze oder Nylon-4-0-Naht, um eine Geldbörsensaite am Schnittrand durchzuführen. Ziehen Sie die Milz vorsichtig mit einer Ringzette und identifizieren Sie die Bauchspeicheldrüse. Platzieren Sie das Fenster an der Flanke der Maus, führen Sie die Milz und die Bauchspeicheldrüse durch den offenen Raum des Fensters.Legen Sie dann die Bauchspeicheldrüse vorsichtig auf die Platte des Bildfensters, während Sie die Milz auf den offenen Raum des Fensters legen. PanC-1 nuclite red direkt in die Bauchspeicheldrüse injizieren. Verwenden Sie eine 31-Gauge-Katheternadel, um Tropfen n-Butyl-Cyanacrylat-Klebstoff auf den Rand des Bildgebungsfensters aufzutragen, um sicherzustellen, dass nur eine minimale Menge Klebstoff aufgetragen wird.Tragen Sie vorsichtig ein 12 Millimeter rundes Deckglas auf den Rand des Abbildungsfensters auf. Halten Sie dann die Nahtschlaufe, um in die seitliche Nut des Fensters zu passen, und binden Sie sie dreimal. Um die Unterbrechung dieser engen Stiche zu verhindern, wenn die Mäuse wach sind, schneiden Sie die maximale proximale Stelle der Krawatte ab.Beginnen Sie mit dem Einschalten des Intravitalenmikroskops einschließlich der Laserleistung. Um einen Gefäßkatheter einzuführen, drücken Sie mit dem Zeige- und dritten Finger auf die proximale Seite des Schwanzes. Bei Bedarf den Schwanz mit einer Lampe erhitzen.Desinfizieren Sie die Schwanzvene mit einem 70% Ethanolspray, führen Sie dann einen 30-Gauge-Katheter in die laterale Schwanzvene ein und visualisieren Sie das Aufstoßen von Blut im PE-10-Röhrchen. Tragen Sie Seidenband auf den Katheter auf, um ihn zu stabilisieren. Injizieren Sie FITC-Dextran und TMR-Dextran oder gegebenenfalls andere fluoreszierende Sonden entsprechend der Kombination von Fluoreszenzsonden.Setzen Sie eine Rektalsonde ein, um die Körpertemperatur automatisch mit einem homöothermischen Heizkissensystem zu steuern. Setzen Sie dann das pankreatische Bildgebungsfenster ein, das während der intravitalen Mikroskopie vorbereitet wurde, in den Fensterhalter. Übertragen Sie die Maus von der operationsigen Plattform in die bildgebungsgebende Phase.Um eine intravitalen Bildgebung durchzuführen, beginnen Sie mit der Bildgebung der Bauchspeicheldrüse bei einer geringen Vergrößerung, z. B. viermal, um die gesamte Ansicht der Bauchspeicheldrüse im Pankreasbildfenster zu scannen. Sobald der interessierende Bereich bestimmt wurde, wechseln Sie zu einem Objektiv mit höherer Vergrößerung, z. B. 20- oder 40-fach, um Eine Bildgebung auf zellulärer Ebene mit einer lateralen und axialen Auflösung von etwa 0,5 Mikrometern bzw. 3 Mikrometern durchzuführen. Führen Sie Z-Stack- oder Zeitrafferbilder durch, um die 3D-Struktur oder Dynamiken auf zellulärer Ebene wie Zellmigration zu beobachten.Die Intravitalenmikroskopie in Kombination mit dem intravitalen Bildgebungsfenster der Bauchspeicheldrüse bietet eine langfristige Gewebestabilität, die die Erfassung hochauflösender Bildgebung ermöglicht, um einzelne Inseln bis zu drei Wochen lang zu verfolgen. Das Fenster, das in eine C57 schwarze 6 N Maus mit intravenös injiziertem Anti-CD31-Antikörper implantiert wurde, konjugiert mit einem Alexa 647 Fluorophor, erleichterte die großflächige Bildgebung und vergrößerte die 3D-Bildgebung der Bauchspeicheldrüse. Acinarzellen wurden in den gemittelten Bildern von Pankreasgewebe im benachbarten Gefäß identifiziert, visualisiert mit Autofluoreszenz bzw. Anti-CD31-Antikörpern.Mit dem Mosaik-Bildgebungsverfahren, das eine Weitfeldansicht mit hochauflösender Bildgebung kombiniert, wurden etwa 40 bis 50 Inseln mit dem angrenzenden Gefäßsystem in einer MIP-GFP-Maus visualisiert. Eine frühere Studie zeigte, dass Inseln mit dieser stabilen Bildgebungsmethode bis zu drei Wochen lang verfolgt werden können. Um Krebszellen sichtbar zu machen, wurden PANC-1 Nuclite Rote Blutkörperchen während der Operation direkt in die Bauchspeicheldrüse der Maus implantiert und nahe gelegene Gefäße wurden mit Anti-CD31 gefärbt, konjugiert mit Alexa 647.Mit diesem Protokoll wurden Weitfeldbilder von Bauchspeicheldrüsenkrebs erzeugt. Dies trug dazu bei, den Rand des Tumors abzugrenzen und hochauflösende 3D-Bilder auf Einzelzellebene zu erzielen. Der kritischste Schritt bei dieser Methode ist die geschickte Implantation des Pankreas-Bildgebungsfensters in die Maus.Mit anderen Kombinationen der fluoreszierenden Mauszellen und Antikörpersonden konnte eine dynamische Interaktion benachbarter Zellen mit Entweder Inselchen oder Cancel-Zellen identifiziert werden. Diese Methode kann von denjenigen, die die Veränderung der Insel in verschiedenen pathophysiologischen Zuständen und Mikroumgebungen des Bauchspeicheldrüsenkrebses in situ untersuchen, weit verbreitet sein.

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Dieses Video zeigt das Verfahren zur Implantation eines Pankreas-Bildgebungsfensters, um die Bauchspeicheldrüse vom Darm für eine hochauflösende Längszeitraffer-Bildgebung der Pankreas-Mikrostruktur zu trennen.

Installation eines intravitalen Pankreas-Bildgebungsfensters im Mausmodell: Ein integriertes Pankreas-Bildgebungsfenster für die In-vivo-Bildgebung der murinen Pankreas-Mikrostruktur

In diesem Video beschreiben wir die intravitale Bildgebung einer Bauchspeicheldrüse einer Maus durch ein stabilisiertes Fenster zur Langzeitvisualisierung der zellulären Dynamik.

Intravitale Bildgebung: Eine Methode zur Beobachtung der Bauchspeicheldrüse der Maus auf zellulärer Ebene durch ein stabilisiertes Bildgebungsfenster

Ziel dieses Protokolls ist es, die Dynamik des menschlichen Pankreas-Islet-Entransplantierungsprozesses und des beitragenden Wirts- und Spenderzellen kontinuierlich zu überwachen. Dies wird durch die Transplantation menschlicher Inselchen in die vordere Augenkammer (ACE) eines NOD erreicht. (Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/-Mausempfänger gefolgt von wiederholter 2-Photonen-Bildgebung.

Längsschnitt in Vivo Bildgebung und Quantifizierung der menschlichen Pankreas-Islet-Grafting- und Beitragenden Wirtszellen in der Vorderen Augenkammer

Hier wird ein Ansatz für die intravitale Langzeitbildgebung mit optisch klaren Silikonfenstern vorgestellt, die direkt auf das interessierende Gewebe/Organ und die Haut geklebt werden können. Diese Fenster sind billiger und vielseitiger als andere, die derzeit im Feld verwendet werden, und das chirurgische Einführen verursacht begrenzte Entzündungen und Leiden bei den Tieren.

Längsschnittliche intravitale Bildgebung durch klare Silikonfenster

Wir präsentieren ein Protokoll für die chirurgische Implantation eines stabilisierten optischen Bleibefensters für die subzellulär aufgelöste Bildgebung der murinen Bauchspeicheldrüse, das serielle und longitudinale Studien der gesunden und erkrankten Bauchspeicheldrüse ermöglicht.

Stabilisiertes Fenster für die intravitale Bildgebung der murinen Bauchspeicheldrüse

Durch die Kombination aus poliertem und verstärkte Dünnschicht-Schädel (Ports) cranial Fenster und Glioblastom (GBM) Zellinjektion können wir beobachten, Gliom Initiierung und Wachstum aus injiziert GBM Zellen in das Gehirn eines lebenden Maus Längsrichtung.

Imaging Gliom Initiation<em&gt; In Vivo</em&gt; Durch eine Poliert und Reinforced Thin-skull Cranial Fenster

Ein Modell der Stent-Implantation in Maus Halsschlagader beschrieben. Im Vergleich zu anderen ähnlichen Methoden ist dieses Verfahren sehr schnell, einfach und zugänglich, bietet die Möglichkeit, auf bequeme Weise die Gefäßwand Reaktion auf verschiedene Medikamente-freisetzende Stents und die molekularen Mechanismen der Restenose zu studieren.

Ein Mausmodell der Stentimplantation in der Arteria carotis für das Studium der Restenose

Hier beschreiben wir einen semi-invasiven optischen Mikroskopie-Ansatz zur Induktion eines photothrombotischen Gerinnsels in der somatosensorischen Hirnrinde einer Maus in vivo.  Es werden die technischen Aspekte des bildgebenden Verfahrens von der Induktion eines photothrombotischen Ereignisses über die Anwendung bis hin zur Datenerhebung beschrieben.

Rose Bengal Photothrombosis von konfokalen optischen Imaging<em&gt; In Vivo</em&gt;: Ein Modell des Einzelfahrzeug Stroke

Mit Längs Zwei-Photonen - Mikroskopie Dieses Manuskript beschreibt ein Verfahren , um den Umbau des cerebrovasculature während Amyloid - Plaque - Akkumulation in vivo zu verfolgen. Ein ausgedünnten Schädel Vorbereitung ermöglicht die Visualisierung von Fluoreszenzfarbstoffen, das Fortschreiten von zerebrovaskulären Schädigung in einem Mausmodell der Alzheimer-Krankheit zu bewerten.

in Längsrichtung<em&gt; In Vivo</em&gt; Imaging des Cerebrovasculature: Bedeutung für ZNS-Erkrankungen

Erfahren Sie die stabilisierte longitudinale In-vivo-Bildgebung der Bauchspeicheldrüse auf zellulärer Ebene mit einem neuartigen Pankreas-Intravital-Bildgebungsfenster. Diese Methode ermöglicht bewegungslose, hochauflösende 3D-Aufnahmen über drei Wochen.

Stabilisierte longitudinale In Vivo Visualisierung der Bauchspeicheldrüse auf zellulärer Ebene in einem Murinenmodell mit einem Pankreas-Intravital-Bildgebungsfenster (Video) | JoVE Journal

Stabilisierte longitudinale In Vivo Visualisierung der Bauchspeicheldrüse auf zellulärer Ebene in einem Murinenmodell mit einem Pankreas-Intravital-Bildgebungsfenster

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