集束イオンビームは、粉砕し、脳組織の走査型電子顕微鏡

この手順の目的は、集束イオンビームと走査型電子顕微鏡を使用して、脳組織の特定の領域を通じて連続画像を収集することです。これは、最初に脳をスライスして染色し、次に樹脂を埋め込むことによって達成されます。2つ目のステップは、埋め込まれた脳の部分から関心領域を切り取り、ブランクレジンブロックにマウントすることです。

3つ目のステップは、レジンブロックをウルトラミクロトームでトリミングし、顕微鏡のイオンビームを使用して、イメージングする領域のみを分離することです。最後のステップは、イオンビームを使用して樹脂ブロックの面を連続的にイメージングし、各画像を撮影する前に薄い層を繰り返し除去することです。最終的には、関心領域を通じてシリアル画像を示す結果を取得できます。

画像シリーズは自動的に収集され、データセットには通常、等方性ボクセルがあるため、スタック内の任意の角度から画像構造を表示できます。この技術の主な利点は、シリアルセクション透過型電子顕微鏡のような既存の方法よりも優れていますが、はるかに高いZ分解能を達成することができます。また、電子線トモグラフィーと比較して、樹脂包埋サンプルに最適な解像度ではるかに大きなボリュームをイメージングできます。

この手順は、麻酔をかけた灌流ラットから固定脳を解剖することから始まります。プラスチック金型の温かい5%エアロスに脳を埋め込み、アロスがビブラートスライスを使用して脳を内部にしたエアロスブロックをサンプルホルダーにしっかりと取り付ける前に、脳を正しい角度に向けます。80ミクロンの冠状切片は、関心領域を含めるために必要な数の切片を切断します。

次に、サンプルを20ミリリットルのガラス断熱バイアルに入れます。バイアルごとに最大10切片を配置します。サンプルを0.1モルKコートバッファーでそれぞれ5分間3回すすぎます。

次に、サンプルを1.5%シアン化カリウムと1%四酸化オスミウムで0.1モルKコートバッファーに30分間染色します。1%四酸化オスミウムでサンプルを0.1モルKコートバッファー中で30分間染色し続けます。この後、二重蒸留水で3分間1回すすぎ、次に1%alアセテートで2倍の蒸留水で30分間染色します。

次に、切片を二重蒸留水で5分間すすぎ、次に等級付けされたアルコールシリーズで脱水し、交換ごとに2分間待ちます。次のステップは、アルコールと混合されたデュラン樹脂の濃度の増加にセクションを埋め込むことであり、交換の間に30分かかります。50〜50エタノールを樹脂に、次に30〜70、次に10〜90、最後に100%樹脂に30分間のセクションで

次に、媒体を100%新鮮なデュラン樹脂と交換します。ローラーミキサーで1時間ゆっくりと攪拌します。埋め込みに続いて、木製のカクテルスティックを使用して、以前に金型分離剤でコーティングされたガラス顕微鏡スライドにセクションを配置します。

スライドにはできるだけ多くのセクションを配置しますが、スライドが過密にならないように注意してください。顕微鏡スライドの間にもIDラベルが配置されていることを確認してください。スライドを摂氏65度のオーブンに24時間置きます。

翌日、サンプルをオーブンから取り出します。顕微鏡ガラスのスライドの間にカミソリの刃をそっと押し込み、サンプルを含む樹脂層をスライドの間から取り出し、樹脂層を指で保持します。サンプルを流水でやさしく洗います。

金型分離剤を除去するには、低倍率対物レンズを使用して透過照明を備えた解剖顕微鏡にサンプルを置きます。細い針で関心のある領域をマークします。かみそりの刃を使用して、関心のある領域の周りに小さな3ミリメートル×3ミリメートル四方を切ります。

アクリル接着剤を使って、小さなレジンブロックをブランクレジンブロックの上部に取り付けます。次に、ブロックをウルトラミクロトームのホルダーに固定します。付属の実体顕微鏡を覗いて、かみそりの刃を使用して、材料の小さなピラミッドだけが残るまで関心領域の周りをトリミングします。

ウルトラミクロトームに固定されたガラスナイフを使用して、ブロックの上面に対して斜めに、関心領域に近いブロックの端を切り取ります。さらにブロックをトリムして、対象領域がブロック表面の寸法に対して正確に配置されるようにします。ウルトラミクロトームからブロックを取り外し、透過光顕微鏡の下に置きます。

対象領域を撮影します。宝石商のこぎりを使用して、トリミングされたブロックをカーボンペイントで残りの樹脂スタブから切り取ります。SAオフブロックをSEMサンプルホルダーに貼り付け、画像化する側が最も外側の端を向くように向き

接着剤が乾燥したら、調製物を三日月形の真空蒸着システムに移し、ブロックを20ナノメートルを超える金の薄層でコーティングします。これで、樹脂に包埋された組織ブロックを集束イオンビーム走査型電子顕微鏡でイメージングする準備が整いました。ホルダー内のサンプルを低倍率で顕微鏡に挿入し、二次電子イメージングを使用して、関心領域とイメージングするブロックの側面が向くようにブロックを向けます。

オペレーターは、イメージ化される面がフライスビームと平行になるようにブロックの向きを合わせます。これにより、電子ビームは、13〜27ナノアンペアのイオンビーム電流を使用して、この面に対して54度に向けられます。30キロボルトで。

イメージする領域の前面から細いレジンの帯を取り除きます。次に、後方散乱イメージングモードに切り替えて、関心領域を覆うフライス加工された面を表示します。以前に撮影した光学顕微鏡の参照画像と粉砕された面の画像を使用して、顕微鏡のガス注入システムを使用して、粉砕および画像化されるブロック上の正確な領域を特定します。

厚さ約1ミクロンの炭素または金属の保護層を、700ピコアンペアの電流を使用して、関心領域の上のブロックの表面に堆積させます。最後に、最終的な画像が撮影されるブロックの領域をミルします。このイメージ面にミリングアーチファクトが見えなくなるまで、ミリングビームでこのイメージ面を完全にミリングします。

顔の連続イメージングのための顕微鏡パラメータを選択します。一般的なパラメータは、1.2〜2キロボルトの電圧で、ピクセルサイズは4〜20ナノメートルです。ピクセル滞留時間は約 10 マイクロ秒にして、顔をフライス加工して 1 つの画像を取得する合計時間が 2 分未満になるようにする必要があります。

熱変化がないか、顕微鏡を少なくとも2時間休ませます。消散するには、ミリングとイメージングのプロセスを開始して、関心領域を通じてシリアル画像を取得します。この図は、ラップブレインの領域内の超構造を示すブロック面の逆コントラスト後方散乱画像を示しています。

すべての膜と大きな高分子構造が見えます。この図は、5ナノメートル間隔で収集された合計1, 600枚の画像で構成されており、等方性ボクセルを含む画像スタックが得られます。このスタックは、同じ解像度で任意の平面で画像化できます。

したがって、このビデオを見た後、フォーカス・オン・ビーム走査型電子顕微鏡を使用して連続イメージング用の脳組織を準備する方法について十分に理解できるはずです。