走査型電子顕微鏡互換光学イメージング法によるメソスコーピック全細胞脳マッピング

私たちの研究はコネクトミクスに焦点を当てています。私たちは高スループットの光学または電子画像取得手法を開発し、神経回路およびシナプス結合の特徴を解析し、神経回路の基本的な接続論理を解読することを可能にします。元々の高回転コネクトミクスは高コストなデータ取得と精密さのため、脳容量が小さいのに対し、迅速な顕微鏡解析や標的顕微鏡的研究は全脳コネクトミクスの可能性を秘めています。

ラーセン顕微鏡など他の顕微鏡的手法と比べて、OMLITは樹状突起および軸索の心配情報を持つすべてのニューロンの画像を捉えます。電子顕微鏡との互換性に加え、EFではさらにナノスケールの解像度イメージングも可能です。OMLITは包括的な脳モデルを構築し、方向、強度、タイプを含むすべての長距離投影を局所的なマイクロ回路と並べてマッピングし、シリアルテーマと組み合わせます。構造化された構造や脳全体の情報の流れについての洞察を提供します。

OMLITで定義されたRIに基づく自動OMLIT画像およびEMデータ取得を開発しており、大規模な脳体積または全脳体積にわたる効率的なコネクトミックデータ収集と解析を可能にします。まず、厚さ50マイクロメートルのキャプトンフィルムまたはD50フィルムを選び、モーター巻き上げシステムに取り付けます。ダブルヘッドマグネトロンスパッタリングシステムを用いて、クロムやアルミニウム、銀、銅などの金属の均一な薄膜をテープ表面に堆積させます。

テープはスパッタリングするターゲットから80ミリメートルの距離に位置します。直流電流で、99.99%のアルゴンガスで調整された1パスカルの圧力でこのプロセスを行います。次に、テープ巻き上げ速度を秒速0.6ミリに設定し、金属コーティングの厚さを50ナノメートルにします。

沈着後、室温まで冷めたらテープをシステムから取り出します。スタイラスプロファイラー、原子間力顕微鏡、走査型電子顕微鏡を用いて、コーティングの厚さと均一性を評価します。低反射率戦略としては、80ワットのプラズマクリーナーでテープを秒速7ミリメートルで動かしながら、テープを清掃し親水性に仕上げます。

処理後、テープ表面に水滴を置き、それらが急速に薄膜に広がることを確認します。小型のグラインダーや類似の切断工具を使い、サンプル側の樹脂を粗くトリミングして周囲の空白樹脂を取り除き、サンプル部分を露出させます。樹脂で埋め込まれたブロックをサンプルホルダーに入れ、しっかりと締めてブロックを固定します。

サンプルホルダーをマイクロトームの可動アームに取り付けてください。ガラスナイフやダイヤモンドトリミングナイフをナイフホルダーに45度の角度で取り付けます。顕微鏡下で試料表面をピラミッド型に整えて滑らかにし、その後サンプルブロックの4辺を切り詰めて余分な樹脂を取り除きます。

ノブを回して、ブロックの前後の端を水平に合わせます。トリミングナイフを外し、45度の角度でセットしたダイヤモンドナイフに交換します。マイクロトームの基部の傾き角度を6度に設定し、ナイフホルダーをノブでゆっくり動かし、ナイフの前端が試料表面から1〜2ミリメートル離れるまで動かします。

サンプル表面とナイフの刃の間の明るい帯を観察し、傾斜角度を調整してバンドが上下および左右に均等になるように調整してください。次に、ダイヤモンドナイフの溝に蒸留水を注入して刃を湿らせます。注射器で水を抜き、液体のレベルが沈み、反射が銀色になるまで続けます。

次に、制御ユニットで断面厚さの切断速度と切断ウィンドウを設定します。試料の品質に応じて、切断速度を秒速0.6ミリメートル、厚さを60ナノメートルに調整してください。ミクロトームで切片を始めてください。

安定して均一なセクションができたら、工程を一時停止します。その後、細いブラシで切り取った部分やゴミを取り除く。次に、コーティングされたテープリールと空のテイクアップリールの両方を自動の超薄セクション収集システムに取り付けます。

ロック機構を固定し、一定速度でスムーズなテープの動きと巻き取りリールへの適切な集積を確認するための試験作業を行います。テープで固定された採取装置の収集ヘッドをダイヤモンドナイフの水浴に浸し、サンプルスライス長の1.5倍でナイフの刃に平行に調整します。収集装置を固定し、区画整理を再開しながら同時にテープ収集装置を稼働させます。

十分な連続断面を集めたら、断面作業を一時停止します。テープは区切りのない部分で切ります。テープ回収装置を動かし、すべてのテープがスプールに絡みつくまで続けます。

次にスプールを取り出し、電子乾燥オーブンに入れます。テープ収集装置とミクロトームを清掃し、すべての付属品を元の場所に戻してください。シリコンウェハに取り付ける場合は、両面導電テープの透明保護フィルムを剥がします。

テープは両面導電テープと平行に貼り、各部分に最大3セグメントのテープを貼ります。シリコンウェハを光学顕微鏡のステージに置き、残留物のない接着テープで固定します。5倍レンズを用いてシリコンウェハ、テープ、試料の全体像を取得します。

概要画像では各セクションをアウトライン化し、ソートし、フォーカスと露光ポイントを追加して、ウェハ全体で20倍または50倍の倍率で自動イメージングを行います。撮影後、画像を保存し、画質を確認し、ピントが合っていなかったり画質が悪い場合は再ピントを合わせて再撮像してください。TIFF画像スタックをVAST 22にインポートし、インポートを選択し、その後画像からVSVファイルへ画像ボリュームをインポートします。

外部タブレットを接続し、ブラシツールとセグメント描画モードで手動で構造を区切り・トレースします。ショートカットキーのAとZを使って画像スライス間を移動できます。次に、ウィンドウを選択し、3Dビューア→表示→更新」を選んで、分割構造を3次元で可視化します。

最後に、ファイルを選択してセグメンテーションを保存した後にセグメンテーション結果を保存します。高反射率画像では、細胞質および血管腔領域が周囲領域に比べて強度が高いのに対し、低反射率画像では細胞質腔および血管腔領域が強度が低く示されました。定量化された結果は、高反射率戦略と低反射率戦略が示されました。

それぞれにコントラストや情報のエントロピーという点で利点がありました。OMLIT光学顕微鏡イメージングにより、軸索、血管、細胞体、樹状突起の同定が可能となりました。VASTを用いたオムレツ画像の手動分割により、多数の密に配置された細胞体、樹状突起、軸索が確認されました。

分割された結果は元の画像と組み合わせて三次元可視化を図りました。拡大OMLIT画像は、より細かい構造を明らかにするには解像度が不足していました。同じ領域の電子顕微鏡画像では、シナプス、ミトコンドリア、細胞核、小胞が明らかになりました。