Ablehnung des Fluorescence Resonance Hintergrund in und Spontane Raman Mikrospektroskopie

Wir diskutieren den Bau und Betrieb einer komplexen nichtlinearen optischen System, das ultraschnelle all-optische Schaltelemente verwendet zu isolieren Raman von Fluoreszenz-Signalen. Mit diesem System sind wir in der Lage, erfolgreich getrennt Raman-und Fluoreszenz-Signale nutzen Pulsenergien und mittleren Leistungen, die biologisch unbedenklich bleiben.

Das Ziel dieses Verfahrens ist es, einen rein optischen Gang zu konstruieren, der Raman-Streulicht durchlässt und gleichzeitig Fluoreszenzsignale unterdrückt. Dies wird erreicht, indem zunächst die Raman-Streuung angeregt und polarisiert wird. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, den Pumpbalken für die Betätigung des Tores vorzubereiten.

Drittens müssen Pumpe, Stößel und Impulse so eingestellt werden, dass sie sich überlappen. Der letzte Schritt des Verfahrens besteht darin, zeitgesteuerte Spektren zu erfassen. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die eine biochemische Quantifizierung und Klassifizierung durch die Analyse von Ramen-Signalen mit hohen Signal-Rausch-Verhältnissen zeigen.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, wie z. B. der Softwareentfernung des Fluoreszenzhintergrunds, besteht darin, dass das durch die Fluoreszenz erzeugte Schrotrauschen erheblich reduziert wird. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im biologischen und biomedizinischen Bereich zu beantworten, wie z. B. die nicht-invasive Charakterisierung der chemischen Zusammensetzung von endogenem Fluor in Bakterienzellen und -geweben, das Verständnis zellulärer Prozesse und Krankheiten wie Krebs, Gefäß- oder neurodegenerative Erkrankungen unter Verwendung intrinsischer Marker. Diese Methode kann auch bei der Entwicklung neuer Sonden helfen, die sowohl als Fluoreszenz- und RAM-Markierungen als auch für nicht-invasive medizinische Sensoren für die Blutanalyse verwendet werden könnten.

Diese Methode kann jedoch Einblicke in biologische Systeme für die Biomedizintechnik liefern. Es kann auch in anderen Bereichen wie Biokraftstoffen, Forschung oder Telekommunikationsindustrie angewendet werden. Biologische Proben werden in der Regel auf einem Deckglas mit der Dicke Nummer eins platziert, das in einer ATO-Fluor-Zellkammer montiert ist.

Flüssige Proben, insbesondere solche, die für den Menschen giftig sind, werden in eine kleine Glasflasche gegeben, deren Abdeckfolie mit Silikon-Epoxidharz an der Öffnung befestigt ist, die dann für die Messung umgedreht wird. Platzieren Sie die Proben auf dem Sekundärtisch, der auf dem Mikroskoptisch montiert ist und über eine eigene unabhängige Fokussteuerung verfügt, um zeitgesteuerte Ramen-Spektren aufzunehmen. Zunächst muss der Anregungsstrahl richtig vorbereitet werden. Beginnen Sie mit Licht, das von einem durchstimmbaren gepulsten GI-Saphirlaser mit einer Leistung von 2,4 Watt austritt. Jeder Puls in der 80-Megahertz-Pulsfolge sollte eine Energie von 30 Nanojoule, eine zeitliche Breite von 140 Femtosekunden und ein Spektrum mit einem Zentrum von 808 Nanometern und einer spektralen Bandbreite von etwa sechs Nanometern haben, um zu verhindern, dass Rückreflexionen wieder in den Laserresonator eintreten, das Licht sollte durch einen Faradayschen Isolatorplatz geleitet werden, eine Halbwellenplatte vor dem Faradayschen Isolator, um eine kontinuierliche Abstimmung der Gesamtleistung zu ermöglichen, die in den Laserresonator gesendet wird. System.

Da sechs Nanometer eine zu breite Bandbreite sind, um die meisten Ramen-Moden aufzulösen, wird der Strahl durch einen sehr schmalen Bandpassfilter geschickt. Senden Sie es mit 808 Nanometern. Verwenden Sie anschließend ein aromatisches Dublett, um das Licht auf eine fünf Millimeter große Beta-Barium-Bohrung zu fokussieren.

Acht Kristalle zur Hälfte der Wellenlänge von 808 Nanometern bis 404 Nanometern. Platzieren Sie den Beta-Barium-Bat-Kristall in einer Halterung mit Kipp- und Neigungssteuerung, die auf einem Translationstisch montiert ist. Um die Effizienz der Wellenlängenumwandlung zu maximieren, muss der Kristall genau symmetrisch um den Fokus des Dubletts platziert werden und seine Kristallachse zur Polarisation des einfallenden Strahls ausgerichtet sein.

Da die Effizienz der Wellenlängenkonversion polarisationsabhängig ist, kann die Kontrolle über die Lichtmenge, die an die Probe gesendet wird, erreicht werden, indem eine zweite Halbwellenplatte nach dem Faraday-Isolator platziert wird. Durch Drehen dieser Wellenplatte kann die Intensität des zur Probe gesendeten Lichts unabhängig von der Intensität des Pumpstrahls eingestellt werden. Das wellenlängenkonvertierte Licht wird dann durch ein zweites aromatisches Dublett rekollimiert, das so gewählt ist, dass der anregende Strahl groß genug ist, um die hintere Öffnung des Mikroskopobjektivs auszufüllen, und mittels zweier Lenkspiegel in ein inverses Mikroskop gelenkt wird.

Das Mikroskopobjektiv definiert die optische Achse, um den Anregungsstrahl auf diese Achse auszurichten. Platzieren Sie einen Spiegel in der Probenebene des Mikroskops. Die beiden Lenkspiegel werden dann iterativ abgestimmt, während der zurückreflektierte Laserstrahl auf einer CCD-Kamera beobachtet wird, die an der Bildöffnung des Mikroskops angebracht ist.

Unter der Annahme, dass das Bild auf der Kamera auf dem Sichtfeld des Mikroskops zentriert ist, befindet sich der Strahl auf der Achse. Wenn der Brennfleck auf dem Mikroskopchip zentriert ist und sich die Verschiebung des Objektivs entlang der Z-Achse nicht ändert. Der Mittelpunkt der defokussierten Strahl-Ramen-Streuung tritt auf, wenn die Probe in der Probenebene platziert und mit Laserlicht bestrahlt wird.

Ein dichroitischer Filter, der unter dem Mikroskopobjektiv platziert ist, trennt die verschobene Welle. Ramen-Streulicht vom Anregungsstrahl, der das Ramen-Streulicht auf die Seitenöffnung des Mikroskops lenkt. Das Mikroskop wurde so modifiziert, dass alle Linsen innerhalb dieses Weges entfernt werden, so dass das Signallicht aus dem Mikroskop beschichtet austritt, da der aus dem Mikroskop austretende Signalstrahl größer ist als die freie Öffnung der Drüse.

Thompson-Polarisatoren, ein 0,47-faches Teleskop, das aus zwei aromatischen Dubletten besteht, werden verwendet, um den Strahl zu verkleinern. Das Signallicht wird dann durch einen Thompson-Polarisator polarisiert, der im Laborrahmen in einem Winkel von null Grad zur Vertikalen ausgerichtet ist, und auf einen dichroitischen Spiegel gerichtet, wo es mit dem Pumpstrahl rekombiniert wird. Der Pumpstrahl wird in eine Verzögerungsleitung geschickt, die aus zwei rechtwinklig zueinander stehenden Spiegeln besteht, die beide auf einem linearen Translationstisch angeordnet sind, der so abgestimmt werden kann, dass eine zeitliche Überlappung der Pump- und Signalimpulse gewährleistet ist.

Nach der Verzögerungsleitung wird der Strahl durch eine Halbplatte und einen Polarisator geschickt, die im Laborrahmen um 45 Grad zur Vertikalen ausgerichtet sind. Dies gewährleistet den richtigen Polarisationszustand des Pumpstrahls, wenn er das nichtlineare Medium erreicht. Das Licht wird dann von zwei Lenkspiegeln reflektiert, einer davon mit piezoelektrischer Steuerung, mit denen schließlich die Position des Pumpstrahls so eingestellt werden soll, dass er sich räumlich mit dem Signalstrahl überlappt.

Um diese Überlappung zu erhalten, beobachten Sie die Pump- und Signalstrahlen an zwei Stellen, eine nahe und eine weit vom dichroitischen Spiegel entfernt, wo die Strahlen kombiniert werden, indem der erste Lenkspiegel verwendet wird, um die beiden Strahlen am Nahpunkt zu überlappen, und der Pizo-Spiegel, um die Strahlen am Fernpunkt zu überlappen, der Pumpstrahl kann genau mit den Signalstrahlen übereinstimmen. Als nächstes sollte das Wellpappen- und Sammelsystem so eingerichtet werden, dass das gesammelte zeitgesteuerte Signal maximiert wird. Dazu werden die Pump- und Signalstrahlen zunächst durch einen diic-Filter geleitet, der einen OD von sechs bei 404 Nanometern hat, um zu verhindern, dass restliches Anregungslicht im nichtlinearen Medium anregt und streut.

Die Pump- und Signalstrahlen werden dann durch ein aromatisches Dublett in ein ein Zentimeter langes Quarzmaterial fokussiert, das das nichtlineare Material enthält, wobei jedes nichtlineare Material mit einem entsprechend hohen nichtlinearen Index und einer entsprechend kurzen zeitlichen Reaktion genutzt werden kann. Hier. Für diese Experimente verwenden wir Disulfidkohlenstoff. Das Licht wird dann durch ein zweites Dublett mit einer Brennweite, die mit der ersten identisch ist, wieder kollimiert.

Die Strahlen werden dann durch einen Thompson-Drüsenanalysator auf einer rotierenden Halterung und dann durch einen Satz Absorptions- und Interferenzfilter geleitet, die zusammen einen Außendurchmesser von 10 bei 808 Nanometern haben. Schließlich wird das Signallicht durch ein aromatisches Dublett in eine 50-Mikron-Multimode-Glasfaser fokussiert, wobei die Faser in einem Tisch montiert ist, der eine Translation in X, Y und Z ermöglicht. Die Faser wird dann an einen kommerziellen abbildenden Spektrographen mit angeschlossener CCD-Kamera gekoppelt, um das Sammelsystem so auszurichten, dass das gesammelte Signal maximiert wird. Stellen Sie den Analysator auf null Grad ein und platzieren Sie eine Testprobe mit Toluol in der Probenebene, optimieren Sie das gesammelte Raman-Signal, indem Sie die X-, Y- und Z-Steuerungen der Faserhalterung anpassen, um eine korrekte räumliche und zeitliche Überlappung der Pumpen- und Signalstrahlen sicherzustellen. Platzieren Sie einen Spiegel in der Probenebene des Mikroskops.

Entfernen Sie dann den 404-Nanometer-Filter aus dem System. Drehen Sie den Analysator um 90 Grad, so dass der retroreflektierte 404-Nanometer-Strahl an den Spektrografen gesendet wird, wobei die Intensität so eingestellt ist, dass er die Kamera nicht sättigt. Drehen Sie nun bei ausgeschaltetem Pumpstrahl den Analysator, um das übertragene 404-Nanometer-Signal zu minimieren.

Schalten Sie dann den Pumpstrahl wieder ein und stellen Sie die Verzögerungsstufe langsam ein, bis die Transmission des 404-Nanometer-Lichts zunimmt. Drehen Sie als Nächstes iterativ die Verzögerungsstufe, den piezoelektrischen Spiegel und die X-, Y- und Z-Steuerungen der Faser, um das Signal zu maximieren, da der retro reflektierte 404-Nanometer-Strahl und das Raman-Streulicht leicht unterschiedliche Wege durch das System nehmen können. Nehmen Sie letzte Anpassungen vor, indem Sie einen starken Raman-Streuer, wie z. B. Toluol, auf dem Probentisch platzieren, den Raman-Filter austauschen und die Ausrichtung leicht anpassen, indem Sie den Pizo-Spiegel der Verzögerungsstufe, den elektrischen Spiegel und die X-, Y- und Z-Regler der Faser ändern, um das Raman-Signal zu optimieren.

Jetzt ist das System bereit, Spektren zu erfassen. Dies erfordert zunächst die Erfassung mehrerer Hintergrundkurven, um Systemartefakte zu korrigieren. Zuerst wird der Analysator auf null Grad eingestellt, der Anregungsstrahl ein- und der Pumpstrahl ausgeschaltet.

Erhalten Sie ein ungatisiertes Spektrum, stellen Sie den Analysator auf 90 Grad ein und erfassen Sie ein Hintergrundspektrum, das Streulicht darstellt, das durch die Polarisatoren austritt. Schalten Sie dann bei einem Winkel des Analysators von 90 Grad den Ramen-Strahl aus und den Pumpstrahl ein. Erfassen Sie ein zweites Hintergrundspektrum, das die Menge an Pumpenlicht darstellt, die durch die dichroitischen Filter austritt.

Erfassen Sie abschließend bei ausgeschalteten Lasern ein Dunkelspektrum der Grundlinie, das den Dunkelstrompegel der Kamera und der Elektronik darstellt. Schalten Sie schließlich alle Strahlen ein und erfassen Sie ein Gated Spectrum. Um das wahre Spektrum nur des Lichts durch das Gate zu bekommen, müssen die beiden Hintergrundspektrums und das dunkle Spektrum von diesem Gated Spektrum subtrahiert werden.

Hier sehen wir eine schematische Darstellung des Wellpappensystems. Der Strahlengang der Pumpe wird als durchgezogene rote Linie dargestellt, während der SHG-Pfad als durchgezogene Marinelinie dargestellt wird. Der Weg, auf dem sich Ramen und Fluoreszenz überlappen, ist grün dargestellt.

Während der Pfad, auf dem die Fluoreszenz vorübergehend herausgefiltert wurde, gelb dargestellt ist. Hier sehen wir die Rohspektren von Cumarin, das in Immersionsöl gelöst ist. Die rote Kurve zeigt das Spektrum, das bei offenem Gate aufgenommen wurde, während die schwarze Kurve das Spektrum zeigt, das mit dem Analysator aufgenommen wurde, um eine minimale Transmission zu gewährleisten, und einem angelegten Pumpstrahl.

Die blaue Kurve zeigt das Spektrum, das mit dem Analysator für eine minimale Transmission ausgerichtet und ohne Pumpstrahl aufgenommen wurde, und die grüne Kurve zeigt das Spektrum, das nur mit dem Pumpstrahl aufgenommen wurde. Alle Spektren wurden mit einem 11-Punkt-KY-Gole-Filter dritter Ordnung geglättet. Die gestrichelten magentafarbenen Linien zeigen den Spektralbereich, der in der folgenden Grafik dargestellt ist.

Hier sehen wir Spektren von Cumarin, das nach der Subtraktion des Fluoreszenzhintergrunds in Immersionsöl gelöst ist. Die rote Kurve ist das Spektrum, bei dem das Gate offen gehalten wird, und die blaue Kurve ist das Gated-Spektrum. Das Gated-Spektrum zeigt deutlich die gewundene hohe Wellenzahl, den für Öle charakteristischen Peak.

Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass der Laser zunächst über genügend Pulsenergie verfügen muss, um den ga anzutreiben, und dass das System eine exquisite räumliche und zeitliche Überlappung der beiden Pulse erfordert. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen und das beigefügte Protokoll gelesen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie der Laserstrahl in einen Anregungs- und einen Kurvenstrahl unterteilt werden kann. Wie man diese beiden Balken sowohl räumlich als auch zeitlich überlappt.

Wie man ein Ramen-Signal per Spektrograf und C, c, D aufzeichnet und wie man das Ramen-Signal visualisiert und analysiert. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Lasern äußerst gefährlich sein kann und Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen einer Laserbrille immer getroffen werden sollten, wenn Sie dieses Verfahren versuchen. Für die Verwendung des nichtlinearen Materials und für die Verwendung Ihrer spezifischen Probe gelten zusätzliche Sicherheitsvorschriften.