Name: Ablehnung des Fluorescence Resonance Hintergrund in und Spontane Raman Mikrospektroskopie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-18T12:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 4 s
Description: Lernen Sie die Konstruktion eines optischen Gates zur Trennung von Raman-Streulicht und Fluoreszenzsignalen. Diese Methode ermöglicht biochemische Quantifizierung mit hohem Signal-Rausch-Verhältnis für biophysikalische Anwendungen.

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Diese Arbeit wurde von der NSF Auszeichnung DBI 0852891 gefördert. Ein Teil dieser Arbeiten wurde auch durch das Zentrum für Biophotonik Science and Technology, einem ausgewiesenen NSF Science and Technology Center der University of California, Davis gelungen, unter Cooperative Agreement No PHY0120999 finanziert.

1. Einige Vorsicht ist bei der Vorbereitung und Platzierung eines Raman-Probe innerhalb dieses Systems getroffen werden. <ol><li> Da das System in der Regel nutzt eine sehr hohe numerische Apertur Ziele mit sehr geringen Arbeitsabstand, werden die Proben auf einem Deckglas platziert. Biologische Proben sind in der Regel auf einer Nr. 1 Dicke Deckglas in einem Attofluor Zellkammer (Invitrogen, Carlsbad, CA) montiert platziert. </li><li> Flüssige Proben, vor allem für den Menschen giftig sind in einer kleinen Glasflasche mit einem Deckglas zementiert, um die Öffnung durch eine Silikon-Epoxy-gelegt. Die Flasche wird dann für die Messung invertiert. </li><li> Da unser System hängt präzises Timing der Pumpe und Signalimpulse, sind wir gezwungen nicht auf die herkömmliche Fokuseinstellung unserer Mikroskop, das das Ziel übersetzt nach oben und unten verwenden. Dies addiert und subtrahiert optischen Weg von unserem System. Stattdessen legen wir unsere Proben auf einer zweiten Stufe auf der Oberseite des Mikroskops, dass ihre eigenen, unabhängigen Fokus Kontrolle hat montiert. </li></ol> 2. Um Zeit-gated Raman-Spektren lassen, muss der Anregungsstrahl gut vorbereitet sein. <ol><li> Wir beginnen mit Licht, das aus einem 2,4 W abstimmbare, gepulste Ti: Sapph Laser (Chameleon, Coherent Systems, Santa Clara, CA). Jeder Impuls in der 80 MHz Impulsfolge hat 30 nJ Energie, hat eine zeitliche Breite von 140 fs und hat ein Spektrum bei 808 nm mit einer spektralen Bandbreite von ca. 6 nm zentriert. </li><li> Um zu verhindern, Back-Reflexionen von Wiedereinstieg in den Laserresonator wird das Licht durch einen Faraday-Isolator weitergegeben. Ein Halbwellenplatte vor dem Faraday-Isolator gelegt ermöglicht eine kontinuierliche Optimierung der Gesamtleistung in das System gesendet werden. </li><li> Weil 6 nm ist eine zu breite Bandbreite für die meisten Raman-Modi zu lösen, wird der Strahl durch eine sehr schmale (0,8 nm FWHM, Andover Corporation, Salem, NH) Bandpassfilter bei 808 nm zentriert geschickt. </li><li> Das Licht wird dann durch eine achromatische Dublett (f = 100 mm) auf eine 5 mm β-Barium-Borat (BBO) Kristall (CASIX, Fuzhou, Fujian, VR China) auf die Wellenlänge von 808 nm bis 404 nm zu halbieren konzentriert. Die BBO-Kristall ist in eine Halterung mit Spitze und Neigefunktion gelegt, und auch auf eine Übersetzung der Bühne montiert. Zur Maximierung der Effizienz der Wellenlänge Umwandlung, muss der Kristall platziert genau symmetrisch um den Schwerpunkt des Dubletts, und mit seinen Kristall-Achse auf die Polarisation des einfallenden Strahls ausgerichtet. </li><li> Da die Effizienz der Wellenlänge Umwandlung polarisationsabhängigen kann die Kontrolle über die Menge des Lichts an der Probe, indem sie eine zweite Halbwellenplatte nach dem Faraday-Isolator erhältlich. Durch Drehen dieses Verzögerungsplatte, kann die Intensität des Lichts an der Probe unabhängig von der Intensität in der Pumpstrahl (die nachstehend erörtert werden) geschickt angepasst werden. </li><li> Die Wellenlängen-konvertierte Licht wird durch eine zweite achromatische Dublett (f = 500 mm) gewählt werden, dass der austretende Strahl groß genug, um den Rücken Apertur des Mikroskop-Objektivs zu füllen, und gerichtet in einem inversen Mikroskop (IX-71, Olympus ist rekollimierten, Center Valley, PA) mit Hilfe von zwei Kippspiegel. </li><li> Die Mikroskop-Objektiv, wobei das optische Element in die monolithische Komponente des Systems untergebracht ist, definiert der optischen Achse. So richten Sie den Anregungsstrahl zu dieser Achse, ist ein Spiegel in der Probe des Mikroskops platziert. Die beiden Kippspiegel werden dann iterativ optimiert unter Beachtung der Back-reflektierter Laserstrahl auf einen CCD-cam-era (μEye, IDS, Obersulm, Deutschland) an der Imaging-Anschluss des Mikroskops. Unter der Annahme, dass das Bild auf der Kamera auf dem Mikroskop-field-of-view zentriert ist, wird der Strahl auf der Achse, wenn der Brennfleck auf dem Mikroskop-Chip und die Übersetzung von dem Ziel entlang der z-Achse zentriert ist nicht ändert den Mittelpunkt der defokussiertem Strahl. </li><li> Wenn eine Probe in der Probe Ebene platziert und Bestrahlung mit Laserlicht Raman-Streuung auftritt. Eine dichroitische Filter unterhalb des Mikroskop-Objektivs platziert trennt die Wellenlängen verschoben Raman-Streulicht (und Fluoreszenz) von der Anregungsstrahl, die Leitung der Raman-Streulicht auf der Seite Port des Mikroskops. Das Mikroskop wurde modifiziert, um alle Objektive in diesem Weg, so dass das Signal Licht aus dem Mikroskop kollimiert entsteht entfernen. </li><li> Da das Signal austretende Strahl aus dem Mikroskop ist größer als die Apertur des Glan-Thompson-Polarisatoren eine 0.47x Teleskop aus zwei achromatischen Dubletts (f1 = 75 mm, f2 = 35 mm) gebaut wird verwendet, um den Strahl zu schrumpfen. </li><li> Das Signal Licht wird dann durch eine polarisierte Glan-Thompson Polarisator orientiert bei 0 ° in Bezug auf vertikale im Laborsystem, und auf einen dichroitischen Spiegel, wo sie mit den Pumpstrahl rekombiniert wird. </li></ol> 3. Um für die optische Tor mit höchster Effizienz zu betreiben, muss bei der Vorbereitung der Pumpstrahl (Kerr Balken) als auch eingenommen werden. <ol> Der Pump-Puls wird zunächst durch 0.35x mit einem Teleskop mit zwei achromatischen Dubletts (f1 = 35 mm, f2 = 100 mm) gebaut, um die endgültige Größe des Signals Strahl Spiel vergrößert. <li> Der Pumpstrahl wird dann in eine Delay-Line aus einem rechtwinkligen Prisma auf eine lineare Übersetzung Bühne, die abgestimmt auf zeitliche Überlappung der Pumpe und Signalimpulse (Abstimmung auf unten diskutiert werden) sicherstellen können platziert werden zusammen verschickt. </li><li> Nach der Delay-Line wird der Strahl durch einen Halbwellenplatte und Polarisator, die unter 45 ° zur vertikalen geschickt im Laborsystem. Dies gewährleistet die richtige Polarisationszustand des Pumpstrahl, wenn es das nichtlineare Medium erreicht. </li><li> Das Licht wird dann von zwei Kippspiegel, eins mit piezo-elektrischen Steuerungen, die verwendet werden, um eine Feineinstellung der Position der Pumpstrahl reflektiert werden, so dass es Überschneidungen räumlich mit dem Signal Strahl. Die Überlappung ist durch die Beobachtung der Pumpe und Signal Balken an zwei Standorten, einem in der Nähe und man weit von dem dichroitischen Spiegel, wo die Strahlen in Kombination erhalten. Durch den Einsatz der ersten Kippspiegel der beiden Strahlen an der Nahpunkt, und der Piezo-Spiegel die Strahlen am äußersten Punkt überschneiden, kann die Pumpe Strahl exakt kollinear mit dem Signal Strahl getroffen werden. </li><li> Mit den beiden Strahlen kombiniert, sind die Kerr-Gate-und Sammelsystem bis zu den gesammelten Zeit-gated-Signal maximieren gesetzt. </li></ol> 4. Mit den beiden Strahlen kombiniert, sind die Kerr-Gate-und Sammelsystem bis zu den gesammelten Zeit-gated-Signal maximieren gesetzt. <ol><li> Die Pumpe und Signal Balken werden zunächst durch einen dichroitischen Filter, einem Außendurchmesser von 6 hat bei 404 nm, um restliche Anregungslicht von spannenden Raman-Streuung innerhalb der nichtlinearen Medium zu verhindern weitergegeben. </li><li> Die Pumpe und Signal Strahlen werden dann sowohl durch eine achromatische Dublett (f = 35 mm) in einen 1 cm Schichtdicke Quarzküvette mit dem nichtlinearen Material konzentriert. Jede nichtlineare Material mit einem entsprechend hohen nichtlinearen Index (höher als CS 2), und entsprechend kurzen zeitlichen Reaktion (&lt;2 ps), können hier genutzt werden. Für diese Experimente verwenden wir Schwefelkohlenstoff, CS 2, dass eine nicht-lineare Index n 2 = 3,1 x 10 -18 m 2 / W. hat Das Licht wird dann durch eine zweite Dublett mit einer Brennweite identisch mit dem ersten rekollimierten. </li><li> Die Strahlen werden dann durchlaufen und Glan-Thompson-Analysator auf einer rotierenden Halterung, und dann durch eine Reihe von Absorption und Interferenz-Filter, die haben einen Außendurchmesser von 10 bei 808 nm kombiniert. </li><li> Schließlich ist das Signal Licht durch eine achromatische Dublett (f = 35 mm) in eine 50 um Multimode-Glasfaser, wo die Faser in eine Bühne, die Übersetzung in x, y und z können montiert ist fokussiert Die Faser wird dann zu einem kommerziellen Imaging-Spektrographen mit angeschlossener CCD-Kamera (SP2300i und Pixis 100B bzw. beide von Princeton Instruments, Trenton hergestellt, NJ) gekoppelt. </li><li> So richten Sie die Sammelstellen gesammelt Signal zu maximieren, wird der Analysator auf 0 ° und eine Probe von Toluol ist in der Probe Ebene platziert. Durch die Anpassung der x, y, und z steuert der Faser montieren, werden die gesammelten Raman-Signal optimiert. </li><li> Um eine ordnungsgemäße räumliche und zeitliche Überlappung der Pumpe und Signal Balken, ist ein Spiegel in der Probe des Mikroskops platziert. Die 404 nm-Filter aus dem System entfernt. Mit den Analysator um 90 ° gedreht das retroreflektierte 404 nm Strahl wird in den Spektrographen mit der Intensität so eingestellt, dass es nicht in die Sättigung der Kamera gesendet. Mit dem Pumpstrahl aus, wird der Analysator gedreht werden, um die übertragenen 404 nm Signal zu minimieren. Mit dem Pumpstrahl wieder eingeschaltet, wird die Verzögerung der Bühne langsam dran, bis die Übertragung der 404 nm-Licht beginnt zu steigen. Dann durch eine iterative Optimierung der Verzögerung der Bühne, die piezo-elektrische Spiegel, und die x-, y-und z-Kontrollen der Faser, maximiert man die Signal. </li><li> Da die retroreflektierten 404 nm Strahl und das Raman-Streulicht leicht unterschiedliche Wege durch das System zu übernehmen, werden letzte Anpassungen, indem eine starke Raman Streuer (wie Toluol) auf die Probe Bühne und die leicht Tweaking die Ausrichtung, indem Sie die gemacht Verzögerungsstufe, piezeo-elektrische Spiegel, und x, y, und z steuert der Faser zur Optimierung der Raman-Signal. </li></ol> 5. Sammlung ein einziges Mal-gated Raman-Spektrum erfordert Erwerb mehrerer Spektren für System-Artefakte zu korrigieren. <ol><li> Mit der Analysator auf 0 °, der Anregungsstrahl auf und der Pumpstrahl off gesetzt ist, wird ein "unbeschrankten" Spektrum aufgenommen, was das Spektrum, das ohne den Vorteil der Zeit-Gating-System erworben werden würde. </li><li> Mit der Analysator auf 90 °, der Anregungsstrahl und der Pumpstrahl noch aus, ist ein Hintergrund-Spektrum aufgenommen, die die Menge an Streulicht undicht durch die Polarisatoren und andere Elemente in das System. </li><li> Mit dem Analysator übrigen bei 90 °und alle Strahlen auf, die "gated" Spektrum aufgenommen, die die Raman-Streulicht durch die gekreuzten Polarisatoren durch die Anwesenheit der Pumpstrahl erlaubt. </li><li> Schließlich mit dem Analysator noch bei 90 °, der Anregungsstrahl ab und die Pumpe Strahl auf, wird ein zweiter Hintergrund Spektrum aufgenommen, was den Beitrag der "gated" Spektrum der Restmengen von 808 nm Licht in den Spektrographen. </li><li> Zusätzlich wird ein Spektrum mit allen Laser abgenommen, die Charakterisierung der Grundlinie "dunkel" Signalpegel der Kamera und Elektronik. </li><li> Da die Spektren erfordern oft langwierige Integration Zeiten ist es unerlässlich, diese Integration Zeit in mehrere Teile (Frames) zu brechen, um die richtige Korrektur der kosmischen Strahlung ermöglichen - ein häufiges Problem beim Erfassen von Daten über Spannweiten von mehreren Minuten. </li></ol> 6. Einmal erworben, sind mehrere Verarbeitungsschritte hilfreich, um die Qualität und das Erscheinungsbild der Daten zu verbessern. <ol><li> Zunächst werden alle Spektren dunkel durch Subtraktion von der "dunklen" Spektrum korrigiert. </li><li> Zur Korrektur der kosmischen Strahlung, die mehrere Frames darstellen eine Akquisition zu einander auf einer Pixel-by-Pixel-Basis verglichen. Für jedes Pixel eines Rahmens, der außerhalb von 2 mittlere Abweichungen vom Mittelwert für dieses Pixel in allen Frames fällt, ist, dass Pixelwerts durch den Medianwert über alle Frames ersetzt. </li><li> Die kosmische Strahlung korrigiert Frames werden dann gemittelt und geglättet durch eine Savitzky-Golay-Filter 1. </li><li> So extrahieren Sie die "wahre" gated-Spektrum, subtrahieren wir den "Anregungs-only" und "Pumpe-only"-Spektren aus den gemessenen gated-Spektrum. </li><li> Schließlich werden die gated und unbeschrankten Spektren dann Hintergrund durch Subtraktion eines 5-ter Ordnung polynomial, ermittelt nach der Methode von Lieber und Mahadevan-Jansen 2 behoben. </li></ol> 7. Repräsentative Ergebnisse: <img src="/files/ftp_upload/2592/2592fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Schematische Darstellung des Kerr-Gating-System. Die Pumpe Strahlengang ist in rot dargestellt, während die SHG Weg in blau dargestellt ist. Der Pfad, Raman-und Fluoreszenz überlagert sind in grün dargestellt, während der Pfad, wo die Fluoreszenz wurde zeitlich hat herausgefiltert gelb dargestellt ist. Abkürzungen wie folgt: BPF, Bandpassfilter, CCD, Charge-Coupled Device; DCM, dichroitischen Spiegel, FI, Faraday-Isolator; λ / 2, Halbwelle Platte; LPF, lang-Pass-Filter, NLM, nichtlineare Medium; P, Polarisator ; SHG, second harmonic generation Kristall. <img src="/files/ftp_upload/2592/2592fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2 oben:. Raw-Spektren von Cumarin in Immersionsöl aufgelöst. Rote Kurve zeigt das Spektrum mit dem Tor offen gehalten (Analysator für maximale Übertragungs-Set) aufgenommen. Schwarze Kurve zeigt das Spektrum mit dem Analysator für minimale Transmission und ein Pumpstrahl angewandt wird (gated-Spektrum) ausgerichtet genommen. Blaue Kurve zeigt den spectum mit dem Analysator für minimale Übertragung und keine Pumpstrahl angewendet ausgerichtet genommen (Tor geschlossen gehalten). Grüne Kurve zeigt das Spektrum nur mit der Pumpstrahl angewendet genommen. Gestrichelte Linien zeigen magenta Spektralbereich in der unten abgebildeten. Alle Spektren wurden mit einem 11-Punkte, 3. Ordnung Savitzky-Golay-Filter geglättet. Unten: Spektren von Cumarin in Immersionsöl nach Fluoreszenz Hintergrundsubtraktion aufgelöst. Rote Kurve ist das Spektrum mit dem Tor offen gehalten, und die blaue Kurve ist der gated-Spektrum. Die gated Spektrum zeigt deutlich die gewundenen hoher Wellenzahl peak Charakteristik Öle.

<ol><li>Savitzky, A., Golay, M. J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Smoothing+and+differentiation+of+data+by+simplified+least+squares+procedures%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Smoothing and differentiation of data by simplified least squares procedures.</a> Analytical Chemistry. 36, 1627-1639 (1964).</li>
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Das Gebiet der biomedizinischen Raman-Spektroskopie hat zunehmendes Interesse in den letzten paar Jahren nicht mehr gesehen als Ergebnis seiner demonstriert Potenzial zur Lösung einigen schwierigen Herausforderungen in der biologischen Diagnostik. Zum Beispiel haben Raman-Spektren wurde gezeigt, dass diagnostische Wert in Krebsfrüherkennung 3, 4, 5, 6 haben. Raman-Spektroskopie hat auch in bakteriellen Quantifizierung 7, 8 und bakteriellen Wirkstoff Antwort 9 verwendet wurde. Es wurde au...

<table border="1"><tbody><tr><th> Name </th><th> Firma </th><th> Catalog Number </th><th> Kommentare </th></tr><tr><td> Objektive </td><td> ThorLabs </td><td> Verschiedene </td><td> Alle Objektive mit einer maximalen Übertragungsrate Verluste von jeweils 1% haben </td></tr><tr><td> Tunable Ti: Sapph Laser </td><td> Kohärent </td><td> Chamäleon </td><td> 30 nJ, 200 fs, 80 MHz </td></tr><tr><td> 40X Ölimmersionsobjektiv </td><td> Olymp </td><td> UApo/340 </td><td> NA = 1,35 </td></tr><tr><td> Inversen Mikroskop </td><td> Olymp </td><td> IX-71 </td><td> Modifiziert, um alle Objektive in seitlichen Anschluss entfernen </td></tr><tr><td> Halbwelle Platte </td><td> Thorlabs </td><td> AHWP05M-600 </td><td></td></tr><tr><td> Glan-Thompson-Polarisator </td><td> Thorlabs </td><td> GTH10M </td><td> ~ 10% Übertragungsverluste </td></tr><tr><td> Spektrometer </td><td> PI Acton </td><td> SP2300i </td><td></td></tr><tr><td> CCD </td><td> PI Acton </td><td> Pixis 100B </td><td></td></tr><tr><td> Mathematischen Software </td><td> The MathWorks </td><td> MATLAB </td><td> Version 2008a </td></tr><tr><td> Faraday-Isolator </td><td> EOT </td><td> BB8-5I </td><td></td></tr><tr><td> Piezo-elektrische Spiegel </td><td> Newport </td><td> AG-M100 </td><td></td></tr><tr><td> BBO-Kristall </td><td> CASIX </td><td> Brauch </td><td> 1 mm Dicke </td></tr><tr><td> Bandpass-Filter 1 </td><td> Andover </td><td> 008FC14 </td><td> 808 ± 0,4 nm </td></tr><tr><td> Dichroitischen Spiegel </td><td> Semrock </td><td> FF662-FDI01 </td><td> Bandkante bei 662 nm </td></tr><tr><td> Long-Pass-Filter </td><td> Semrock </td><td> BLP01-405R </td><td> Bandkante bei 417 nm </td></tr><tr><td> Bandpass-Filter 2 </td><td> Semrock </td><td> FF02-447/60 </td><td> 417-447 nm </td></tr><tr><td> CS 2 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 335266 </td><td> 99% Reinheit </td></tr><tr><td> Cumarin 30 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 546127 </td><td> 99% Reinheit </td></tr><tr><td> Immersionsöl </td><td> Cargille </td><td> 16242 </td><td> Typ DF </td></tr></tbody></table>

ablehnung des fluorescence resonance hintergrund in und spontane raman mikrospektroskopie

Rejection of Fluorescence Background in Resonance and Spontaneous Raman Microspectroscopy

Raman-Spektroskopie wird häufig durch eine starke Fluoreszenz-Hintergrund geplagt, vor allem für biologische Proben. Wird eine Probe mit einem Zug der ultraschnellen Impulsen, ein System, das zeitlich trennen kann spektral überlappende Signale auf einer Pikosekunden-Zeitskala isolieren können gespannt ist prompt angekommen Raman-Streulicht aus späten Ankunft Fluoreszenzlicht. Hier besprechen wir den Bau und Betrieb einer komplexen nichtlinearen optischen System, das all-optische Schaltelemente verwendet in der Form eines Low-Power-optischen Kerr Tor zum Raman-und Fluoreszenz-Signale zu isolieren. Ein einziger 808 nm-Laser mit 2,4 W Durchschnittsleistung und 80 MHz Wiederholrate ist gespalten, mit ca. 200 mW von 808 nm Licht, das auf &lt;5 mW von 404 nm Licht geschickt, um die Probe zu Raman-Streuung zu erregen umgewandelt. Die restlichen nicht umgesetzten 808 nm Licht wird dann zu einem nichtlinearen Medium, wo es als die Pumpe für die all-optischen Shutter geschickt. Der Verschluss öffnet und schließt in 800 fs mit einem maximalen Wirkungsgrad von etwa 5%. Mit diesem System sind wir in der Lage, erfolgreich getrennt Raman-und Fluoreszenz-Signale bei einer 80 MHz Wiederholrate mit Pulsenergien und mittleren Leistungen, die biologisch unbedenklich bleiben. Da das System keine freien Kapazitäten in Bezug auf die optische Leistung hat, haben wir ausführlich mehrere Design und Ausrichtung Überlegungen, die Hilfe bei der Maximierung des Durchsatzes der Anlage. Wir diskutieren auch unser Protokoll für den Erhalt der räumlichen und zeitlichen Überlappung der Signal-und Pumpstrahlen innerhalb der Kerr-Medium, sowie ein ausführliches Protokoll für Spektrenerfassung. Schließlich berichten wir einige repräsentative Ergebnisse der Raman-Spektren in Gegenwart von starken Fluoreszenz mit unserer Zeit-Gating-System erhalten.

Wir diskutieren den Bau und Betrieb einer komplexen nichtlinearen optischen System, das ultraschnelle all-optische Schaltelemente verwendet zu isolieren Raman von Fluoreszenz-Signalen. Mit diesem System sind wir in der Lage, erfolgreich getrennt Raman-und Fluoreszenz-Signale nutzen Pulsenergien und mittleren Leistungen, die biologisch unbedenklich bleiben.

Ablehnung des Fluorescence Resonance Hintergrund in und Spontane Raman Mikrospektroskopie

Die Raman-Spektroskopie ist häufig durch einen starken Fluoreszenzhintergrund belastet, insbesondere bei biologischen Proben. Wenn eine Probe mit einem Zug von ...

Das Ziel dieses Verfahrens besteht darin, ein vollständig optisches Gatter aufzubauen, das Raman-streulicht durchlässt, aber fluoreszente Signale unterdrückt. Dies wird erreicht, indem zunächst die Raman-Streuung angeregt und polarisiert wird. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, den Pumpstrahl zur Betätigung des Gatters vorzubereiten.Drittens müssen die Pumpe, die Ram- und die Pulssignale so eingestellt werden, dass sie überlappen. Der letzte Schritt des Verfahrens besteht darin, zeitgated Spektren aufzuzeichnen. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die eine biochemische Quantifizierung und Klassifizierung durch Analyse der Ramansignale mit hohen Signal-zu-Rausch-Verhältnissen zeigen.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, wie der softwarebasierten Entfernung des Fluoreszenzhintergrunds, liegt darin, dass das durch die Fluoreszenz erzeugte Schrotrauschen signifikant reduziert wird. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen in den biologischen und biomedizinischen Bereichen zu beantworten, beispielsweise die nicht-invasive Charakterisierung der chemischen Zusammensetzung endogener Fluorophore in Bakterienzellen und Geweben, das Verständnis zellulärer Prozesse und Erkrankungen wie Krebs, vaskuläre oder neurodegenerative Erkrankungen mithilfe intrinsischer Marker. Die Methode könnte außerdem bei der Entwicklung neuer Sonden helfen, die sowohl als Fluoreszenz- als auch als RAM-Marker verwendet werden könnten, sowie bei der Herstellung nicht-invasiver medizinischer Sensoren für die Blutanalyse.Obwohl diese Methode Einblicke in biologische Systeme für die biomedizinische Technik ermöglichen kann, ist sie auch auf andere Bereiche wie die Biofuel-Forschung oder die Telekommunikationsindustrie anwendbar. Biologische Proben werden typischerweise auf einer Deckglasnummer-eins-Dicke platziert, die in einer ATO-Fluorzelle befestigt ist.Flüssige Proben, insbesondere solche, die für den Menschen toxisch sind, werden in eine kleine Glasflasche gegeben, deren Öffnung mit einem Deckglas verschlossen ist, das mittels Silikon-Epoxidharz befestigt wird. Die Flasche wird dann zum Messen auf eine sekundäre Stufe umgedreht, die auf dem Mikroskopständer montiert ist und über eine eigene unabhängige Fokussierung verfügt. Um zeitgegatterte Raman-Spektren aufzunehmen, muss zunächst der Anregungsstrahl ordnungsgemäß präpariert werden. Beginnen Sie mit dem Licht einer 2,4-Watt-abstimmbaren gepulsten GI-Saphir-Laserquelle. Jeder Puls im 80-Megahertz-Pulszug sollte eine Energie von 30 Nanojoule, eine zeitliche Breite von 140 Femtosekunden und ein Spektrum mit einem Zentrum bei 808 Nanometern sowie einer spektralen Bandbreite von etwa sechs Nanometern aufweisen. Um Rückreflexionen zu verhindern, die in den Laserresonator zurückgelangen könnten, sollte das Licht durch einen Faraday-Isolator geleitet werden. Platziert man eine λ/2-Platte vor dem Faraday-Isolator, kann die gesamte in das System eingespeiste Leistung kontinuierlich justiert werden.Da sechs Nanometer eine zu breite Bandbreite sind, um die meisten Raman-Modi aufzulösen, wird der Strahl durch einen sehr engen Bandpassfilter geleitet. Leiten Sie ihn bei 808 Nanometern weiter. Verwenden Sie danach ein aromatisches Dublett, um das Licht auf einen fünf Millimeter langen Beta-Bariumborat-Kristall zu fokussieren.Acht Kristalle zur Halbwellenlänge von 808 Nanometern auf 404 Nanometer. Platziere den Beta-Bariumborsäure-Kristall in einer Halterung mit Kipp- und Neigungsverstellung, die auf einer Translationsstufe montiert ist. Um die Effizienz der Wellenlängenumwandlung zu maximieren, muss der Kristall exakt symmetrisch zur Fokusebene des Dubletts angeordnet sein, und die Kristallachse muss mit der Polarisation des einfallenden Strahls ausgerichtet sein.Da die Effizienz der Wellenlängenumwandlung von der Polarisation abhängt, kann durch Einsetzen einer zweiten Halbwellenplatte nach dem Faraday-Isolator eine Kontrolle über die Menge des zum Probenobjekt geleiteten Lichts erreicht werden. Durch Drehen dieser Wellenplatte lässt sich die Intensität des zum Probenobjekt geleiteten Lichts unabhängig von der Intensität des Pumpstrahls einstellen. Das wellenlängenkonvertierte Licht wird anschließend durch ein zweites aromatisches Dublett wieder kollimiert, das so gewählt ist, dass der anregende Strahl groß genug ist, um die hintere Öffnung des Mikroskopobjektivs auszufüllen, und mittels zweier Lenkspiegel in ein inverses Mikroskop gelenkt.Das Mikroskopobjektiv definiert die optische Achse, um den Anregungsstrahl an dieser Achse auszurichten. Platzieren Sie einen Spiegel in der Probenebene des Mikroskops. Anschließend werden die beiden Lenkspiegel iterativ justiert, während der rückgestreute Laserstrahl auf einer an den Abbildungsport des Mikroskops angeschlossenen CCD-Kamera beobachtet wird.Unter der Annahme, dass das Bild auf der Kamera im Zentrum des mikroskopischen Sichtfelds liegt, befindet sich der Strahl auf der optischen Achse. Wenn der Fokuspunkt im Zentrum des Mikroskop-Chips liegt und sich bei einer Translation des Objektivs entlang der Z-Achse nichts ändert, tritt Ramanscattering des defokussierten Strahls auf, wenn die Probe in der Probenebene platziert und mit Laserlicht bestrahlt wird.Ein unterhalb des Mikroskopobjektivs angebrachter Dichroitscher Filter trennt das wellenverschobene Ramanserien-Streulicht vom Anregungsstrahl und leitet das Ramanserien-Streulicht zum Seitenanschluss des Mikroskops. Das Mikroskop wurde modifiziert, um alle Linsen in diesem Strahlengang zu entfernen, sodass das Signallicht unbeeinträchtigt aus dem Mikroskop austritt, da der Signalstrahl, der aus dem Mikroskop austritt, größer ist als die lichte Öffnung der Linse.Thompson-Polarisatoren, ein 0,47-fach verkleinerndes Teleskop, das aus zwei aromatischen Dubletts besteht, wird verwendet, um den Strahl zu verengen. Das Signallicht wird anschließend durch einen glandförmigen Thompson-Polarisator polarisiert, der im Laborsystem bezüglich der Vertikalen um null Grad ausgerichtet ist, und auf einen dichroitischen Spiegel gelenkt, wo es mit dem Pumpstrahl wieder zusammengeführt wird. Der Pumpstrahl wird in eine Verzögerungsleitung geschickt, die aus zwei zueinander im rechten Winkel stehenden Spiegeln besteht, die beide auf einer linearen Translationsstufe montiert sind und justiert werden können, um eine zeitliche Überlappung der Pump- und Signalpulse sicherzustellen.Nach der Verzögerungsleitung wird der Strahl durch eine Halbwellenplatte und einen Polarisator geleitet, der im Laborsystem um 45 Grad gegenüber der Vertikalen ausgerichtet ist. Dies stellt sicher, dass der Pumpstrahl beim Erreichen des nichtlinearen Mediums den richtigen Polarisationszustand aufweist. Das Licht wird anschließend an zwei Lenkspiegeln reflektiert, wobei einer über piezoelektrische Steuerung verfügt und zur endgültigen Justage der Position des Pumpstrahls verwendet werden sollte, sodass dieser räumlich mit dem Signalstrahl überlappt.Um diese Überlagerung zu erreichen, beobachten Sie die Pump- und Signalstrahlen an zwei Positionen, einer nahe und einer entfernten Position vom dichroitischen Spiegel, an dem die Strahlen kombiniert werden, indem Sie den ersten Lenkspiegel verwenden, um die beiden Strahlen am nahen Punkt zu überlagern, und den Piezospiegel, um die Strahlen am fernen Punkt zu überlagern; auf diese Weise kann der Pumpstrahl exakt kollinear mit den Signalstrahlen ausgerichtet werden. Anschließend sollte das Korrelations- und Sammelsystem so eingerichtet werden, dass das zeitgegatterte gesammelte Signal maximiert wird. Dazu werden die Pump- und Signalstrahlen zunächst durch einen Dichtefilter geleitet, der eine OD von sechs bei 404 Nanometern aufweist, um sicherzustellen, dass kein verbleibendes Anregungslicht das nichtlineare Medium anregt oder darin streut.Die Pump- und Signalstrahlen werden dann mit einem aromatischen Dublett in eine Quarzzelle mit einer Weglänge von einem Zentimeter fokussiert, die das nichtlineare Material enth&auml;lt; jedes nichtlineare Material mit einem ausreichend hohen nichtlinearen Index und einer ausreichend kurzen zeitlichen Antwort kann hierf&uuml;r verwendet werden. F&uuml;r diese Experimente verwenden wir Kohlendisulfid. Das Licht wird anschlie&szlig;end mit einem zweiten Dublett, dessen Brennweite identisch mit der des ersten ist, wieder kollimiert.Die Strahlen werden anschließend durch einen auf einer rotierenden Halterung montierten Glan-Thompson-Analysator und danach durch einen Satz von Absorptions- und Interferenzfiltern geleitet, die zusammen bei 808 Nanometern eine OD von 10 aufweisen. Schließlich wird das Signallicht mittels eines aromatischen Dubletts in eine 50-Mikrometer-Multimode-Lichtfaser fokussiert, wobei die Faser in einer Halterung montiert ist, die eine Verschiebung in X-, Y- und Z-Richtung ermöglicht. Die Faser wird dann mit einem kommerziellen abbildenden Spektrographen mit angeschlossener CCD-Kamera gekoppelt, um das Sammelsystem auszurichten und das gesammelte Signal zu maximieren, den Analysator auf null Grad einzustellen und eine Toluol-Testprobe in der Probenebene zu platzieren. Optimieren Sie das gesammelte Raman-Signal, indem Sie die X-, Y- und Z-Regler der Faserhalterung justieren, um eine korrekte räumliche und zeitliche Überlappung der Pump- und Signalstrahlen sicherzustellen. Platzieren Sie einen Spiegel in der Probenebene des Mikroskops.Entfernen Sie dann den 404-Nanometer-Filter aus dem System. Drehen Sie den Analysator auf 90 Grad, sodass der rückreflektierte 404-Nanometer-Strahl zum Spektrografen geleitet wird, wobei die Intensität so eingestellt ist, dass die Kamera nicht gesättigt wird. Drehen Sie nun bei ausgeschaltetem Pumpstrahl den Analysator, um das transmittierte 404-Nanometer-Signal zu minimieren.Schalten Sie dann den Pumpstrahl wieder ein und stellen Sie den Verzögerungsstapel langsam so ein, bis die Transmission des 404 Nanometer Lichts zu steigen beginnt. Anschließend optimieren Sie das Signal schrittweise, indem Sie den Verzögerungsstapel, den piezoelektrischen Spiegel sowie die X-, Y- und Z-Justierungen der Faser iterativ verstellen, da der rückreflektierte 404 Nanometer Strahl und das Raman-gestreute Licht möglicherweise leicht unterschiedliche Wege durch das System nehmen. Nehmen Sie abschließende Feinabstimmungen vor, indem Sie einen starken Raman-Streuer wie Toluol auf die Probenstufe geben, den Raman-Filter wieder einsetzen und die Ausrichtung durch leichte Veränderungen am Verzögerungsstapel, am piezoelektrischen Spiegel und an den X-, Y- und Z-Steuerungen der Faser optimieren, um das Raman-Signal zu maximieren.Jetzt ist das System bereit, Spektren aufzuzeichnen. Dazu müssen zunächst mehrere Hintergrundkurven aufgenommen werden, um Systemartefakte zu korrigieren. Zuerst mit dem Analysator auf null Grad eingestellt, dem Anregungsstrahl eingeschaltet und dem Pumpstrahl ausgeschaltet.Erhalten Sie ein ungated Spektrum, stellen Sie dann den Analysator auf 90 Grad ein und nehmen Sie ein Hintergrundspektrum auf, das das Streulicht darstellt, das durch die Polarisatoren durchsickert. Danach, bei weiterhin auf 90 Grad stehendem Analysator, schalten Sie den Raman-Strahl aus und den Pumpstrahl ein. Nehmen Sie ein zweites Hintergrundspektrum auf, das die Menge an Pumplicht darstellt, die durch die dichroitischen Filter durchsickert.Schließlich, mit allen Lasern ausgeschaltet, ein Basisspektrum im Dunkeln aufnehmen, das das Dunkelstromniveau von Kamera und Elektronik widerspiegelt. Danach alle Strahlen einschalten und ein zeitgegates Spektrum aufnehmen. Um das tatsächliche Spektrum des allein durch das Tor gelangenden Lichts zu erhalten, müssen die beiden Hintergrundspektren und das Dunkelspektrum von diesem gegateten Spektrum subtrahiert werden.Hier sehen wir ein schematisches Diagramm des Wellungssystems. Der Strahlengang des Pumpstrahls ist als durchgezogene rote Linie dargestellt, während der SHG-Strahlengang als durchgezogene dunkelblaue Linie gezeigt wird. Der Pfad, bei dem Ramen- und Fluoreszenzstrahlung überlappen, ist grün dargestellt.Während der Pfad, bei dem die Fluoreszenz vorübergehend herausgefiltert wurde, gelb dargestellt ist. Hier sehen wir die rohen Spektren von Coumarin, das in Immersionsöl gelöst ist. Die rote Kurve zeigt das Spektrum, das aufgenommen wurde, während das Tor geöffnet gehalten wurde, während die schwarze Kurve das Spektrum zeigt, das bei ausgerichtetem Analysator für minimale Transmission und mit angelegtem Pumpstrahl aufgenommen wurde.Die blaue Kurve zeigt das Spektrum, das mit dem Analysegerät für minimale Transmission ausgerichtet und ohne angelegten Pumpstrahl aufgenommen wurde, und die grüne Kurve zeigt das Spektrum, das nur mit angelegtem Pumpstrahl aufgenommen wurde. Alle Spektren wurden mit einem 11-Punkt-3.-Ordnung-KY-Gole-Filter geglättet. Die gestrichelten magentafarbenen Linien markieren den spektralen Bereich, der im folgenden Diagramm dargestellt ist.Hier sehen wir Spektren von Coumarin, das in Immersionsöl gelöst ist, nach Subtraktion des Fluoreszenz-Grundrauschens. Die rote Kurve zeigt das Spektrum mit geöffnetem Gate, und die blaue Kurve zeigt das gegatete Spektrum. Das gegatete Spektrum zeigt deutlich die überlagerten Hochfrequenz-Peaks, die typisch für Öle sind.Während des Durchführens dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, dass der Laser zunächst über ausreichend Pulsenenergie verfügen muss, um das ga anzutreiben, und dass das System eine exzellente räumliche und zeitliche Überlappung der beiden Pulse erfordert. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen und das beigefügte Protokoll gelesen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man den Laserstrahl in einen Anregungs- und einen Kurvenstrahl aufteilt, und wie man diese beiden Strahlen sowohl räumlich als auch zeitlich überlappt.So nehmen Sie ein Raman-Signal mithilfe eines Spektrografen und der Parameter C, c, D auf und wie Sie das Raman-Signal visualisieren und analysieren. Beachten Sie, dass die Arbeit mit Lasern äußerst gefährlich sein kann, und Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von Laserschutzbrillen sollten stets beachtet werden, wenn dieses Verfahren durchgeführt wird. Zusätzliche Sicherheitsregeln gelten für die Verwendung des nichtlinearen Materials und für die Verwendung Ihrer spezifischen Probe.

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