Ablehnung des Fluorescence Resonance Hintergrund in und Spontane Raman Mikrospektroskopie

Das Ziel dieses Verfahrens besteht darin, ein vollständig optisches Gatter aufzubauen, das Raman-streulicht durchlässt, aber fluoreszente Signale unterdrückt. Dies wird erreicht, indem zunächst die Raman-Streuung angeregt und polarisiert wird. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, den Pumpstrahl zur Betätigung des Gatters vorzubereiten.

Drittens müssen die Pumpe, die Ram- und die Pulssignale so eingestellt werden, dass sie überlappen. Der letzte Schritt des Verfahrens besteht darin, zeitgated Spektren aufzuzeichnen. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die eine biochemische Quantifizierung und Klassifizierung durch Analyse der Ramansignale mit hohen Signal-zu-Rausch-Verhältnissen zeigen.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, wie der softwarebasierten Entfernung des Fluoreszenzhintergrunds, liegt darin, dass das durch die Fluoreszenz erzeugte Schrotrauschen signifikant reduziert wird. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen in den biologischen und biomedizinischen Bereichen zu beantworten, beispielsweise die nicht-invasive Charakterisierung der chemischen Zusammensetzung endogener Fluorophore in Bakterienzellen und Geweben, das Verständnis zellulärer Prozesse und Erkrankungen wie Krebs, vaskuläre oder neurodegenerative Erkrankungen mithilfe intrinsischer Marker. Die Methode könnte außerdem bei der Entwicklung neuer Sonden helfen, die sowohl als Fluoreszenz- als auch als RAM-Marker verwendet werden könnten, sowie bei der Herstellung nicht-invasiver medizinischer Sensoren für die Blutanalyse.

Obwohl diese Methode Einblicke in biologische Systeme für die biomedizinische Technik ermöglichen kann, ist sie auch auf andere Bereiche wie die Biofuel-Forschung oder die Telekommunikationsindustrie anwendbar. Biologische Proben werden typischerweise auf einer Deckglasnummer-eins-Dicke platziert, die in einer ATO-Fluorzelle befestigt ist.

Flüssige Proben, insbesondere solche, die für den Menschen toxisch sind, werden in eine kleine Glasflasche gegeben, deren Öffnung mit einem Deckglas verschlossen ist, das mittels Silikon-Epoxidharz befestigt wird. Die Flasche wird dann zum Messen auf eine sekundäre Stufe umgedreht, die auf dem Mikroskopständer montiert ist und über eine eigene unabhängige Fokussierung verfügt. Um zeitgegatterte Raman-Spektren aufzunehmen, muss zunächst der Anregungsstrahl ordnungsgemäß präpariert werden. Beginnen Sie mit dem Licht einer 2,4-Watt-abstimmbaren gepulsten GI-Saphir-Laserquelle. Jeder Puls im 80-Megahertz-Pulszug sollte eine Energie von 30 Nanojoule, eine zeitliche Breite von 140 Femtosekunden und ein Spektrum mit einem Zentrum bei 808 Nanometern sowie einer spektralen Bandbreite von etwa sechs Nanometern aufweisen. Um Rückreflexionen zu verhindern, die in den Laserresonator zurückgelangen könnten, sollte das Licht durch einen Faraday-Isolator geleitet werden. Platziert man eine λ/2-Platte vor dem Faraday-Isolator, kann die gesamte in das System eingespeiste Leistung kontinuierlich justiert werden.

Da sechs Nanometer eine zu breite Bandbreite sind, um die meisten Raman-Modi aufzulösen, wird der Strahl durch einen sehr engen Bandpassfilter geleitet. Leiten Sie ihn bei 808 Nanometern weiter. Verwenden Sie danach ein aromatisches Dublett, um das Licht auf einen fünf Millimeter langen Beta-Bariumborat-Kristall zu fokussieren.

Acht Kristalle zur Halbwellenlänge von 808 Nanometern auf 404 Nanometer. Platziere den Beta-Bariumborsäure-Kristall in einer Halterung mit Kipp- und Neigungsverstellung, die auf einer Translationsstufe montiert ist. Um die Effizienz der Wellenlängenumwandlung zu maximieren, muss der Kristall exakt symmetrisch zur Fokusebene des Dubletts angeordnet sein, und die Kristallachse muss mit der Polarisation des einfallenden Strahls ausgerichtet sein.

Da die Effizienz der Wellenlängenumwandlung von der Polarisation abhängt, kann durch Einsetzen einer zweiten Halbwellenplatte nach dem Faraday-Isolator eine Kontrolle über die Menge des zum Probenobjekt geleiteten Lichts erreicht werden. Durch Drehen dieser Wellenplatte lässt sich die Intensität des zum Probenobjekt geleiteten Lichts unabhängig von der Intensität des Pumpstrahls einstellen. Das wellenlängenkonvertierte Licht wird anschließend durch ein zweites aromatisches Dublett wieder kollimiert, das so gewählt ist, dass der anregende Strahl groß genug ist, um die hintere Öffnung des Mikroskopobjektivs auszufüllen, und mittels zweier Lenkspiegel in ein inverses Mikroskop gelenkt.

Das Mikroskopobjektiv definiert die optische Achse, um den Anregungsstrahl an dieser Achse auszurichten. Platzieren Sie einen Spiegel in der Probenebene des Mikroskops. Anschließend werden die beiden Lenkspiegel iterativ justiert, während der rückgestreute Laserstrahl auf einer an den Abbildungsport des Mikroskops angeschlossenen CCD-Kamera beobachtet wird.

Unter der Annahme, dass das Bild auf der Kamera im Zentrum des mikroskopischen Sichtfelds liegt, befindet sich der Strahl auf der optischen Achse. Wenn der Fokuspunkt im Zentrum des Mikroskop-Chips liegt und sich bei einer Translation des Objektivs entlang der Z-Achse nichts ändert, tritt Ramanscattering des defokussierten Strahls auf, wenn die Probe in der Probenebene platziert und mit Laserlicht bestrahlt wird.

Ein unterhalb des Mikroskopobjektivs angebrachter Dichroitscher Filter trennt das wellenverschobene Ramanserien-Streulicht vom Anregungsstrahl und leitet das Ramanserien-Streulicht zum Seitenanschluss des Mikroskops. Das Mikroskop wurde modifiziert, um alle Linsen in diesem Strahlengang zu entfernen, sodass das Signallicht unbeeinträchtigt aus dem Mikroskop austritt, da der Signalstrahl, der aus dem Mikroskop austritt, größer ist als die lichte Öffnung der Linse.

Thompson-Polarisatoren, ein 0,47-fach verkleinerndes Teleskop, das aus zwei aromatischen Dubletts besteht, wird verwendet, um den Strahl zu verengen. Das Signallicht wird anschließend durch einen glandförmigen Thompson-Polarisator polarisiert, der im Laborsystem bezüglich der Vertikalen um null Grad ausgerichtet ist, und auf einen dichroitischen Spiegel gelenkt, wo es mit dem Pumpstrahl wieder zusammengeführt wird. Der Pumpstrahl wird in eine Verzögerungsleitung geschickt, die aus zwei zueinander im rechten Winkel stehenden Spiegeln besteht, die beide auf einer linearen Translationsstufe montiert sind und justiert werden können, um eine zeitliche Überlappung der Pump- und Signalpulse sicherzustellen.

Nach der Verzögerungsleitung wird der Strahl durch eine Halbwellenplatte und einen Polarisator geleitet, der im Laborsystem um 45 Grad gegenüber der Vertikalen ausgerichtet ist. Dies stellt sicher, dass der Pumpstrahl beim Erreichen des nichtlinearen Mediums den richtigen Polarisationszustand aufweist. Das Licht wird anschließend an zwei Lenkspiegeln reflektiert, wobei einer über piezoelektrische Steuerung verfügt und zur endgültigen Justage der Position des Pumpstrahls verwendet werden sollte, sodass dieser räumlich mit dem Signalstrahl überlappt.

Um diese Überlagerung zu erreichen, beobachten Sie die Pump- und Signalstrahlen an zwei Positionen, einer nahe und einer entfernten Position vom dichroitischen Spiegel, an dem die Strahlen kombiniert werden, indem Sie den ersten Lenkspiegel verwenden, um die beiden Strahlen am nahen Punkt zu überlagern, und den Piezospiegel, um die Strahlen am fernen Punkt zu überlagern; auf diese Weise kann der Pumpstrahl exakt kollinear mit den Signalstrahlen ausgerichtet werden. Anschließend sollte das Korrelations- und Sammelsystem so eingerichtet werden, dass das zeitgegatterte gesammelte Signal maximiert wird. Dazu werden die Pump- und Signalstrahlen zunächst durch einen Dichtefilter geleitet, der eine OD von sechs bei 404 Nanometern aufweist, um sicherzustellen, dass kein verbleibendes Anregungslicht das nichtlineare Medium anregt oder darin streut.

Die Pump- und Signalstrahlen werden dann mit einem aromatischen Dublett in eine Quarzzelle mit einer Weglänge von einem Zentimeter fokussiert, die das nichtlineare Material enthält; jedes nichtlineare Material mit einem ausreichend hohen nichtlinearen Index und einer ausreichend kurzen zeitlichen Antwort kann hierfür verwendet werden. Für diese Experimente verwenden wir Kohlendisulfid. Das Licht wird anschließend mit einem zweiten Dublett, dessen Brennweite identisch mit der des ersten ist, wieder kollimiert.

Die Strahlen werden anschließend durch einen auf einer rotierenden Halterung montierten Glan-Thompson-Analysator und danach durch einen Satz von Absorptions- und Interferenzfiltern geleitet, die zusammen bei 808 Nanometern eine OD von 10 aufweisen. Schließlich wird das Signallicht mittels eines aromatischen Dubletts in eine 50-Mikrometer-Multimode-Lichtfaser fokussiert, wobei die Faser in einer Halterung montiert ist, die eine Verschiebung in X-, Y- und Z-Richtung ermöglicht. Die Faser wird dann mit einem kommerziellen abbildenden Spektrographen mit angeschlossener CCD-Kamera gekoppelt, um das Sammelsystem auszurichten und das gesammelte Signal zu maximieren, den Analysator auf null Grad einzustellen und eine Toluol-Testprobe in der Probenebene zu platzieren. Optimieren Sie das gesammelte Raman-Signal, indem Sie die X-, Y- und Z-Regler der Faserhalterung justieren, um eine korrekte räumliche und zeitliche Überlappung der Pump- und Signalstrahlen sicherzustellen. Platzieren Sie einen Spiegel in der Probenebene des Mikroskops.

Entfernen Sie dann den 404-Nanometer-Filter aus dem System. Drehen Sie den Analysator auf 90 Grad, sodass der rückreflektierte 404-Nanometer-Strahl zum Spektrografen geleitet wird, wobei die Intensität so eingestellt ist, dass die Kamera nicht gesättigt wird. Drehen Sie nun bei ausgeschaltetem Pumpstrahl den Analysator, um das transmittierte 404-Nanometer-Signal zu minimieren.

Schalten Sie dann den Pumpstrahl wieder ein und stellen Sie den Verzögerungsstapel langsam so ein, bis die Transmission des 404 Nanometer Lichts zu steigen beginnt. Anschließend optimieren Sie das Signal schrittweise, indem Sie den Verzögerungsstapel, den piezoelektrischen Spiegel sowie die X-, Y- und Z-Justierungen der Faser iterativ verstellen, da der rückreflektierte 404 Nanometer Strahl und das Raman-gestreute Licht möglicherweise leicht unterschiedliche Wege durch das System nehmen. Nehmen Sie abschließende Feinabstimmungen vor, indem Sie einen starken Raman-Streuer wie Toluol auf die Probenstufe geben, den Raman-Filter wieder einsetzen und die Ausrichtung durch leichte Veränderungen am Verzögerungsstapel, am piezoelektrischen Spiegel und an den X-, Y- und Z-Steuerungen der Faser optimieren, um das Raman-Signal zu maximieren.

Jetzt ist das System bereit, Spektren aufzuzeichnen. Dazu müssen zunächst mehrere Hintergrundkurven aufgenommen werden, um Systemartefakte zu korrigieren. Zuerst mit dem Analysator auf null Grad eingestellt, dem Anregungsstrahl eingeschaltet und dem Pumpstrahl ausgeschaltet.

Erhalten Sie ein ungated Spektrum, stellen Sie dann den Analysator auf 90 Grad ein und nehmen Sie ein Hintergrundspektrum auf, das das Streulicht darstellt, das durch die Polarisatoren durchsickert. Danach, bei weiterhin auf 90 Grad stehendem Analysator, schalten Sie den Raman-Strahl aus und den Pumpstrahl ein. Nehmen Sie ein zweites Hintergrundspektrum auf, das die Menge an Pumplicht darstellt, die durch die dichroitischen Filter durchsickert.

Schließlich, mit allen Lasern ausgeschaltet, ein Basisspektrum im Dunkeln aufnehmen, das das Dunkelstromniveau von Kamera und Elektronik widerspiegelt. Danach alle Strahlen einschalten und ein zeitgegates Spektrum aufnehmen. Um das tatsächliche Spektrum des allein durch das Tor gelangenden Lichts zu erhalten, müssen die beiden Hintergrundspektren und das Dunkelspektrum von diesem gegateten Spektrum subtrahiert werden.

Hier sehen wir ein schematisches Diagramm des Wellungssystems. Der Strahlengang des Pumpstrahls ist als durchgezogene rote Linie dargestellt, während der SHG-Strahlengang als durchgezogene dunkelblaue Linie gezeigt wird. Der Pfad, bei dem Ramen- und Fluoreszenzstrahlung überlappen, ist grün dargestellt.

Während der Pfad, bei dem die Fluoreszenz vorübergehend herausgefiltert wurde, gelb dargestellt ist. Hier sehen wir die rohen Spektren von Coumarin, das in Immersionsöl gelöst ist. Die rote Kurve zeigt das Spektrum, das aufgenommen wurde, während das Tor geöffnet gehalten wurde, während die schwarze Kurve das Spektrum zeigt, das bei ausgerichtetem Analysator für minimale Transmission und mit angelegtem Pumpstrahl aufgenommen wurde.

Die blaue Kurve zeigt das Spektrum, das mit dem Analysegerät für minimale Transmission ausgerichtet und ohne angelegten Pumpstrahl aufgenommen wurde, und die grüne Kurve zeigt das Spektrum, das nur mit angelegtem Pumpstrahl aufgenommen wurde. Alle Spektren wurden mit einem 11-Punkt-3.-Ordnung-KY-Gole-Filter geglättet. Die gestrichelten magentafarbenen Linien markieren den spektralen Bereich, der im folgenden Diagramm dargestellt ist.

Hier sehen wir Spektren von Coumarin, das in Immersionsöl gelöst ist, nach Subtraktion des Fluoreszenz-Grundrauschens. Die rote Kurve zeigt das Spektrum mit geöffnetem Gate, und die blaue Kurve zeigt das gegatete Spektrum. Das gegatete Spektrum zeigt deutlich die überlagerten Hochfrequenz-Peaks, die typisch für Öle sind.

Während des Durchführens dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, dass der Laser zunächst über ausreichend Pulsenenergie verfügen muss, um das ga anzutreiben, und dass das System eine exzellente räumliche und zeitliche Überlappung der beiden Pulse erfordert. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen und das beigefügte Protokoll gelesen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man den Laserstrahl in einen Anregungs- und einen Kurvenstrahl aufteilt, und wie man diese beiden Strahlen sowohl räumlich als auch zeitlich überlappt.

So nehmen Sie ein Raman-Signal mithilfe eines Spektrografen und der Parameter C, c, D auf und wie Sie das Raman-Signal visualisieren und analysieren. Beachten Sie, dass die Arbeit mit Lasern äußerst gefährlich sein kann, und Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von Laserschutzbrillen sollten stets beachtet werden, wenn dieses Verfahren durchgeführt wird. Zusätzliche Sicherheitsregeln gelten für die Verwendung des nichtlinearen Materials und für die Verwendung Ihrer spezifischen Probe.