Visualisierung von Cortex Organisation und Dynamik in Mikroorganismen, mit Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, qualitativ hochwertige Totalreflexions-, Fluoreszenz- oder Rasenbilder von zellwandtragenden Mikroorganismen zu erhalten. Dies wird erreicht, indem zunächst Deckgläser und Zellen vorbereitet werden. Der zweite Schritt besteht darin, das Mikroskop-Setup für eine optimale Bildqualität präzise auszurichten.

Als Nächstes werden die richtigen Vorfälle, Winkel und Bildgebungsbedingungen für die Aufnahme von Bildern oder Filmen ausgewählt. Der letzte Schritt ist die Nachbearbeitung der aufgenommenen Bilder. Letztendlich wird die Rasenmikroskopie eingesetzt, um die Dynamik der Proteinlokalisierung in der Zellrinde zu untersuchen.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber Metallen wie herkömmlichen oder konfokalen Metallen für die Mikroskopie besteht darin, dass der Bildkontrast in der Mikroskopie sehr hoch ist, was schnelle Zeiten und wenig Licht ermöglicht. Damit kann diese Methode dazu beitragen, zentrale Fragen im Bereich der Membranforschung zu beantworten, wie z.B. die Mechanismen der lateralen Proteinsegregation oder die Mobilität von Membranproteinen. Deckgläser für die Rasenmikroskopie sollten vor der Verwendung von Staubpartikeln gereinigt werden.

Denn Rasen reagiert empfindlich auf Hintergrundsignale, die von Staub auf einem verschmutzten Deckglas ausgehen. Ein gereinigter Deckglas mit weniger Hintergrund ist erforderlich, um mit der Reinigung von Deckgläsern zu beginnen. Legen Sie die Deckgläser mit einer Pinzette in einen Keramikhalter mit Deckel.

Füllen Sie als Nächstes einen Glasbehälter mit einem molaren Natriumhydroxid. Diese Natronlauge kann mehrfach wiederverwendet werden. Setzen Sie den Keramikhalter mit den Deckgläsern in das Natriumhydroxid ein und inkubieren Sie die Deckgläser zwei Stunden lang unter langsamer, kontinuierlicher Rotation.

Nicht länger als acht Stunden inkubieren, da dadurch nach zwei Stunden undurchsichtige Deckgläser entstehen, Waschen Sie die Deckgläser zweimal für jeweils fünf Minuten unter langsamer, kontinuierlicher Drehung mit destilliertem Wasser, lagern Sie die gereinigten Deckgläser in dem mit 100%igem Ethanol bedeckten Keramikhalter. Um die feinsten Zellen des Bazillus für die Rasenmikroskopie vorzubereiten, verdünnen Sie sie auf einen OD 600 von 0,01 bis 0,05 in fünf Millilitern geeigneter Wachstumsmedien und wachsen bis zur exponentiellen Phase. Bereiten Sie 1,25 %Aros in synthetischem Medium zu, lösen Sie Aros-Pulver in einer 1,5-Milliliter-Kunststofftube bei 95 Grad Celsius auf und lagern Sie es dann in einem Heizblock bei 72 Grad Celsius.

Geben Sie einen kleinen Tropfen Aros in die Mitte einer Folie und drücken Sie mit einer zweiten Folie die Aros nach mindestens zwei Minuten zu einem flachen Polster, trennen Sie die Folien vorsichtig. Schleudern Sie 500 Mikroliter der feinsten Zellen des Bazillus in einer Mikrozentrifuge bei 12.000 U/min für eine Minute. Überstand entsorgen und Pellet in 50 Mikroliter Medium resuspendieren.

Geben Sie zwei bis vier Mikroliter Zellen in die Mitte des Aros-Pads. Entfernen Sie anschließend mit einer Pinzette einen gereinigten Deckglas aus dem mit Ethanol gefüllten Behälter und trocknen Sie ihn mit Druckluft. Legen Sie den Deckglas vorsichtig auf die Probe.

Lassen Sie die Zellen vor der Mikroskopie mindestens zwei Minuten lang ruhen. Für die Langzeitbildgebung versiegeln Sie die Ränder des Deckglases mit der erhitzten Mischung aus Vaseline, Lanolin und Paraffin oder Val App. Um Saccharomyces visi-Zellen für die Rasenmikroskopie vorzubereiten, verdünnen Sie eine Vorkultur und züchten Sie sie mindestens fünf Stunden lang in geeigneten Medien.

In die Exponentialphase nehmen Sie einen Deckglas aus dem mit Ethanol gefüllten Behälter und trocknen Sie ihn mit Druckluft und einer Pipette auf. Fünf Mikroliter, Conval und eine oder andere Lösung auf dem Deckel. Schieben und trocknen mit Druckluft Klimaanlage A bindet an Kohlenhydrate der Hefezellwand und immobilisiert die Hefezellen.

Übertragen Sie als nächstes 4,5 Mikroliter einer Hefezellsuspension auf eine Seite des Kegels, einen beschichteten Deckglas. Legen Sie das Deckglas vorsichtig mit der Seite nach unten auf einen Objektträger, beginnend mit einer Kante und lassen Sie die Tropfen langsam fallen. Dadurch wird die Bildung von Luftblasen vermieden.

Lassen Sie die Zellen mindestens zwei Minuten lang absetzen, bevor Sie die Ränder des Deckglases mit der Val App für die Langzeitbildgebung versiegeln. Alle Experimente, die in diesem Video gezeigt werden, werden auf einem maßgeschneiderten Rasenaufbau durchgeführt, der auf einem vollautomatischen IMEX-Stand mit einem Olympus 100 x 1,45 NA-Objektiv basiert. Als Lichtquellen kommen 75 Milliwatt Dioden-, Pumped-Solid-State- oder DPSS-Laser mit 488 Nanometern und 561 Nanometern zum Einsatz.

Rasenwinkel und Fluoreszenz. Die Wiederherstellung nach dem Photobleaching oder der Frat Position kann über zwei Galvanometer sofort eingestellt werden. Ein drittes Galvanometer dient zur Umschaltung zwischen Epi, Fluoreszenz, Frep und Rasen.

Die Galvanometer, die direkt von der Live-Erfassungssoftware aus gesteuert werden, ermöglichen eine einfache Messung der Lokalisierungskinetik für Objekte, die in Rasenbildern verfolgt werden, die mit einer EM-CCD-Kamera und einem Objektiv mit zweifacher Vergrößerung vor der Kamera erfasst werden. Die Erfassung wird ebenfalls von der Live-Erfassungssoftware gesteuert. Setzen Sie vor der Arbeit mit dem Laser eine Laserschutzbrille auf, projizieren Sie den Laser im Rasenmodus an die Decke und kalibrieren Sie die Null-Grad-Position so, dass sich der Laser in einer geraden Linie befindet.

Mit dem Objektiv den Laserspot nach optimaler Einstellung auf eine minimale Größe fokussieren, sollte das Laserprofil einen gut definierten Spot mit einer ungefähr runden Form bilden. Führen Sie die Kalibrierung vor jeder Sitzung durch. Um eine optimale Bildqualität zu erzielen, ist die Ausrichtung des Rasenmikroskops entscheidend für den Erfolg dieses Verfahrens.

Der richtige Einfall, die richtigen Winkel und Parameter für die Bildaufnahme müssen sorgfältig eingestellt werden, um eine optimale Bildqualität zu erzielen. Um mit der Bildaufnahme zu beginnen, identifizieren Sie die Position der Zellen mithilfe der Hellfeldbeleuchtung. Rote LEDs sind besonders gut, da sie keine nennenswerten Lichtschäden verursachen.

Wechseln Sie zur Laserbeleuchtung und wählen Sie geeignete Laser und Filterkombinationen aus, um die Fluorophore der Wahl anzuregen, stellen Sie sicher, dass der Rasenwinkel unkritisch ist. Andernfalls werden Signale, die von GFP-Fusionsproteinen ausgehen, nicht detektiert. Suchen Sie den oberen Bereich der Zelle, d. h. die Seite der Zelle, die dem Deckglas zugewandt ist.

Erhöhen Sie allmählich den Einfallswinkel des Laserstrahls, bis die Signale verschwinden, und verringern Sie dann langsam den Winkel bis zu dem Punkt, an dem die Fluoreszenz an der Zelloberfläche wieder auftritt. Stellen Sie den Z-Fokus erneut ein, um eine optimale Position an der Oberfläche zu erreichen. Akzeptable Rasenwinkel erzeugen keinen verschwommenen Halo am Rand der Zelle, wie dieses Beispiel für Hefeprotein zeigt.

PMA one GFP aufgenommen mit abnehmenden Einfallswinkeln von links oben nach rechts unten. Die Bilder zeigen einen plötzlichen Signalverlust im kritischen Winkel und eine fortschreitende Abnahme der strukturellen Informationen und des Signal-Rausch-Verhältnisses, passen die Laserintensitäten und die Kameraverstärkung an, um den Dynamikbereich zu maximieren. In der Regel sind E-M-C-C-D-Kameras optimal, um sehr geringe Signale bei hohen Signal-Rausch-Verhältnissen zu erkennen.

Die Rasenmikroskopie ist sehr empfindlich gegenüber geringer Höhe. Unterschiede des Deckglases führen dazu, dass nur wenige Zellen gleichzeitig abgebildet werden können. Dieses Bild einer dichten Suspension aus fluoreszierenden Kügelchen ist ein Beispiel für ein ungleichmäßiges Sichtfeld, bei dem nur ein Teil des Sichtfelds scharf ist.

Daher kann bei kleinen Zellen die Akquisitionsregion oft auf eine Unterregion reduziert werden, die das Objekt der Wahl enthält. Bei Experimenten mit doppeltem Farbrasen muss das Durchbluten von Fluorophoren für R-F-P-G-F-P-Paare minimiert werden. Verwenden Sie separate Emissionsfilter, da RFP wöchentlich durch 488-Nanometer-Licht angeregt wird.

Hier wird ein typischer Arbeitsablauf zur Vermeidung von Durchscheinen und doppelfarbiger Bildgebung gezeigt. Nach der Abbildung der Zellen mit separaten Filtersätzen werden die Bilder dezentralisiert und mit fluoreszierenden Kügelchen ausgerichtet, bevor sie zusammengeführt werden. Für die Analyse ist ein kritischer Parameter, der die Bildqualität beeinflusst, die Laserausrichtung und ein sauberes Objektiv. Nachdem Sie den Laser ausgerichtet und auf die Z-Position fokussiert haben, die für die Rasenbildgebung verwendet wird, entnehmen Sie die Probe und reinigen Sie das Objektiv von jeglichem Öl.

Ölreste führen zu einer Beugung des Laserlichts und zu Flecken im Strahlprofil. Mit der Rasenmikroskopie kann die Verteilung von Aktin-Homologen und Zellwandenzymen in Bakterienzellen sichtbar gemacht werden. In diesem repräsentativen Ergebnis wurden Bacillus subtles-Zellen, die GFP-Fusionen des Aktin-Hoog-MBL oder der Transpeptidase PBPH exprimieren, mittels Turf und regulärer Epi-Fluoreszenz abgebildet.

Die Bilder hier stellen durchschnittliche Projektionen einer Zeitreihe dar, um den von Motile abgedeckten Bereich anzuzeigen. MBL-Patches, die mit verschiedenen Imaging-Modi überwacht werden. Der blaue Umriss im Overlay-Bild zeigt die Zellengrenze, die aus einem Hellfeldbild visualisiert wird.

Die wöchentlich exprimierte Transpeptidase PBPH lokalisiert an kortikalen Flecken, die durch Epi-Fluoreszenz kaum sichtbar sind, aber durch Rasen deutlich unterschieden werden können. Die verminderte Durchdringung lässt sich am besten für das P-B-P-H-G-F-P-Signal an den durch die Pfeile angezeigten SEPTA beobachten, die in der Epi-Fluoreszenz als Linien, im Rasen jedoch als Punkte erscheinen. Die nächste Reihe von Bildern zeigt einen Vergleich zwischen Epi-Fluoreszenz und Rasenbeleuchtung der TOR-Komplexkomponente Bit 61 in Saccharomyces visi.

Dieses Protein wird wöchentlich exprimiert und bildet kleine kortikale Flecken mit nur wenigen Proteinkopien pro Pflaster. Bei der Epi-Fluoreszenz sind nur wenige Flecken über dem starken Hintergrund sichtbar, während Flecken mit einem sehr guten Signal-Rausch-Verhältnis im Rasen abgebildet werden können. Eine zusätzliche Verbesserung des Bildkontrasts kann durch verschiedene Bildverarbeitungsschritte erzielt werden, wie z. B. die Subtraktion von Gaußschen oder median unscharfen Bildern, während die lokale Hintergrundsubtraktion Rauschen entfernt und Strukturen mit hoher Intensität schärft.

Dies geht oft auf Kosten eines Verlusts von Feinstrukturen und einer übertriebenen Verstärkung von Bereichen mit hoher Intensität. Wie der Pfeil andeutet, ist die 2D-Dekonvolution ein überlegenes Verfahren, das mit kostenlosen oder im Handel erhältlichen Softwarepaketen durchgeführt werden kann. Die Erhöhung des Kontrasts nach der Dekonvolution wird durch diesen Zeitrafferfilm von GFP RAs zwei veranschaulicht, der abwechselnd rohe und deentwickelte Rasenbilder zeigt.

Da GFP RAs zwei ein sich schnell bewegendes Protein ist, sind schnelle Erfassungszeiten wichtig, um die Lösung zu lösen. Sein dynamisches Verhalten. Die Bildverarbeitung ist besonders wichtig für Kolokalisationsanalysen, wie in diesem Zeitraffer-Doppelfarbfilm von Hefeproteinen, FET 3G FP und PMA one RFP dargestellt.

Die ersten 10 Frames stellen RAW-Bilder dar und die restlichen Frames sind dezentralisierte Bilder. Um die Analyse zu ermöglichen, ist es wichtig, den Kontrast zu maximieren und die verschwommenen RAW-Bilder zu schärfen. Rasen und Frap bieten eine leistungsstarke Kombination, um die Dynamik kortikaler Proteine zu untersuchen. Die Anwendung dieser Technik bei den subtilsten B-Zellen, die G-F-P-M-B-L exprimieren, schloss Treadmilling als Mechanismus für die beobachtete Motilität von MBL-haltigen Pflastern aus.

Der chm-Graph des sich bewegenden Flecks und das Intensitätsprofil entlang des chm-Graphen, der durch die gestrichelte Linie angedeutet ist, sind in ähnlicher Weise als Rasenfrap der Hefeplasmamembran dargestellt. Eine TPA-PMA-Studie zeigte die langsamen Umlagerungen von Hefe-Plasmamembranproteinen, die sich nach ihrer Entwicklung in netzwerkartige Domänen verteilen, die die gesamte Zelloberfläche bedecken. Diese Technik ebnete den Weg für Forschungen auf dem Gebiet der Zellbiologie von Bakterien, um den Mechanismus der Zellwandsynthese bei BA subtilis zu erforschen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Rasenbilder von Mikroorganismen wie Hefen und Bakterien aufnimmt und wie diese Technik bei der Untersuchung der dynamischen Eigenschaften kortikaler Proteine helfen kann.