Name: Visualisierung von Cortex Organisation und Dynamik in Mikroorganismen, mit Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-01T12:03:00.000+00:00
Duration: 14 min 14 s
Description: Erfahren Sie, wie TIRF-Mikroskopie zur Visualisierung von Proteindynamiken an der Zellcortex von Mikroorganismen eingesetzt wird. Diese Methode ermöglicht hochauflösende Bildgebung mit hohem Kontrast und zeitlicher Auflösung.

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Diese Arbeit wurde von der Max-Planck-Gesellschaft finanziert.

<ol><li>Axelrod, D., Thompson, N. L., Burghardt, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Total+internal+inflection+fluorescent+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">Total internal inflection fluorescent microscopy.</a> J. Microsc. 129, 19-28 (1983).</li>
<li>Axelrod, D., Omann, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Combinatorial microscopy.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 944-952 (2006).</li>
<li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+imaging+of+surface+fluorescence+with+very+high+aperture+microscope+objectives%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Opt%22%5BJournal%5D)">Selective imaging of surface fluorescence with very high aperture microscope objectives.</a> J. Biomed. Opt. 6, 6-13 (2001).</li>
<li>Dominguez-Escobar, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Processive+movement+of+MreB-associated+cell+wall+biosynthetic+complexes+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Processive movement of MreB-associated cell wall biosynthetic complexes in bacteria.</a> Science. 333, 225-228 (2011).</li>
<li>Sparkes, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bleach+it%2C+switch+it%2C+bounce+it%2C+pull+it%3A+using+lasers+to+reveal+plant+cell+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Bot%22%5BJournal%5D)">Bleach it, switch it, bounce it, pull it: using lasers to reveal plant cell dynamics.</a> J. Exp. Bot. 62, 1-7 (2011).</li>
<li>Uchida, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Total+synthesis+and+absolute+configuration+of+avenolide%2C+extracellular+factor+in+Streptomyces+avermitilis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Antibiot.+%28Tokyo%29%22%5BJournal%5D)">Total synthesis and absolute configuration of avenolide, extracellular factor in Streptomyces avermitilis.</a> J. Antibiot. (Tokyo). , (2011).</li>
<li>Yu, H., Wedlich-Soldner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+actin+dynamics%3A+Generating+randomness+by+formin%28g%29+and+moving%5BTitle%5D)+AND+%22Bioarchitecture%22%5BJournal%5D)">Cortical actin dynamics: Generating randomness by formin(g) and moving.</a> Bioarchitecture. 1, 165-168 (2011).</li>
<li>Yu, J. H., Crevenna, A. H., Bettenbuhl, M., Freisinger, T., Wedlich-Soldner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+actin+dynamics+driven+by+formins+and+myosin+V%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">Cortical actin dynamics driven by formins and myosin V.</a> J. Cell. Sci. 124, 1533-1541 (2011).</li>
<li>Berchtold, D., Walther, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TORC2+plasma+membrane+localization+is+essential+for+cell+viability+and+restricted+to+a+distinct+domain%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">TORC2 plasma membrane localization is essential for cell viability and restricted to a distinct domain.</a> Mol. Biol. Cell. 20, 1565-1575 (2009).</li>
<li>Vizcay-Barrena, G., Webb, S. E., Martin-Fernandez, M. L., Wilson, Z. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+and+single-molecule+imaging+of+plant+fluorescent+proteins+using+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy+%28TIRFM%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Bot%22%5BJournal%5D)">Subcellular and single-molecule imaging of plant fluorescent proteins using total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM).</a> J. Exp. Bot. 62, 5419-5428 (2011).</li>
</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

TIRF-Mikroskopie ist die Technik der Wahl, um Bild peripheren Proteinen. Die geringe Eindringtiefe der abklingenden Feldes minimiert von außerhalb des Fokus Licht, das zu einem sehr guten Signal-Rausch-Verhältnis führt und ermöglicht die Datenerfassung mit hoher Frame-Raten, oder Abbildung von sehr schwach exprimierte Proteine. Die Kombination aus hohem Kontrast und hoher Bildraten TIRF-Mikroskopie macht ein perfektes Werkzeug für die Abbildung raum-zeitliche Dynamik von kortikal lokalisierte Proteine. Interessanterweis...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Werkzeugs / Reagenz </td><td> Typ </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td></tr><tr><td> Orbitalschüttler </td><td> Werkzeug </td><td> Uniequip </td><td> UniTwist 3-D Wippschüttler </td></tr><tr><td> TIRF-Mikroskop </td><td> Bis </td><td></td><td> Individuelle Einrichtung </td></tr><tr><td> Verpackung aus Glas </td><td> Werkzeug </td><td> Vitlab </td><td> 340-232880353 </td></tr><tr><td> Keramische Färbebank </td><td> Werkzeug </td><td> Thomas Sci. </td><td> 8542E40 </td></tr><tr><td> Concanavalin A </td><td> Reagens </td><td> Sigma </td><td> L7647 </td></tr><tr><td> Deckgläser # 1 (18 x 18 mm) </td><td> Mikroskop </td><td> Menzel Gläser </td><td> BB018018A1 </td></tr><tr><td> Mikropräparate </td><td> Mikroskop </td><td> Menzel Gläser </td><td> AA00000102E </td></tr><tr><td> Immersionsöl </td><td> Mikroskop </td><td> Zeiss </td><td> Immersol 518F </td></tr><tr><td> Agarose </td><td> Reagens </td><td> Invitrogen </td><td> 16500-500 </td></tr><tr><td> FluoSpheres </td><td> Reagens </td><td> Invitrogen </td><td> F8795 </td></tr></tbody></table>

visualisierung von cortex organisation und dynamik in mikroorganismen, mit total internal reflection fluorescence microscopy

Visualization of Cortex Organization and Dynamics in Microorganisms, using Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

TIRF-Mikroskopie hat sich als leistungsfähige Imaging-Technologie, um raum-zeitliche Dynamik der fluoreszierenden Moleküle in vitro zu untersuchen und in lebenden Zellen 1 entstanden. Die optische Erscheinung der Totalreflexion auftritt, wenn Licht von einem Medium mit hohem Brechungsindex zu einem Medium mit niedrigem Brechungsindex unter einem Winkel größer als eine charakteristische kritische Winkel (dh näher an parallelen wobei mit der Grenze). Obwohl alle Licht wird unter solchen Bedingungen widerspiegelt, wird eine abklingende Welle erzeugt, breitet sich über und entlang der Grenze, die mit Abstand exponentiell abklingt, und dringt nur Bereiche, die Probe 100-200 nm in der Nähe der Schnittstelle 2 sind. Neben der Bereitstellung überlegener axiale Auflösung, erstellt der reduzierten Anregung aus dem Fokus Fluorophore ein sehr hohes Signal-Rausch-Verhältnis und minimiert schädliche Auswirkungen von Photobleaching 2,3. Als Weitfeld-Technik, TIRF erlaubt auch schnellere Bild acErwerb als die meisten Scan-basierte konfokale Setups. Auf den ersten Blick scheint die geringe Eindringtiefe der TIRF für unvereinbar mit Bildgebung von Zellen von Bakterien und Pilzen, die häufig mit dicken Zellwänden umgeben sind. Im Gegenteil haben wir festgestellt, dass die Zellwände von Hefe-und Bakterienzellen tatsächlich verbessern die Nutzbarkeit von TIRF und erhöhen die Reichweite von beobachtbaren Strukturen 4-8. Viele zelluläre Prozesse können somit direkt von TIRF werden in kleine, einzellige Mikroorganismen, die häufig bieten starke genetische Manipulation Techniken abgerufen. Dies ermöglicht uns, In-vivo-Experimente Biochemie, wo Kinetik von Protein-Interaktionen und Aktivitäten, die direkt in lebenden Zellen beurteilt werden durchführen können. Wir beschreiben hier die einzelnen Schritte erforderlich, um qualitativ hochwertige Bilder für TIRF Saccharomyces cerevisiae oder Bacillus subtilis-Zellen zu erhalten. Wir weisen darauf hin verschiedene Probleme, die kann affect TIRF Visualisierung von fluoreszierenden Sonden in Zellen und illustrieren das Verfahren mit mehreren Anwendungsbeispielen. Schließlich zeigen wir, wie TIRF Bilder weiter verbessert werden kann mit etablierten Techniken Bildrestaurierung.

Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF)-Mikroskopie ist eine leistungsfähige Methode, um Strukturen in der Nähe der Zelloberfläche bei hohem Kontrast und zeitlicher Auflösung zu beobachten. Wir zeigen, wie TIRF eingesetzt werden können, um Protein-Dynamik in der Rinde der Zellwand-geschlossenen Zellen von Bakterien und Pilzen zu studieren.

Visualisierung von Cortex Organisation und Dynamik in Mikroorganismen, mit Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

Die TIRF-Mikroskopie hat sich als leistungsstarke Bildgebungstechnologie zur Untersuchung der räumlich-zeitlichen Dynamik fluoreszierender Moleküle in vitro und in lebenden Zellen etabliert1. ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, hochwertige Totalreflexions-, Fluoreszenz- oder TURF-Aufnahmen von mikroorganismen mit Zellwand zu erhalten. Dies wird erreicht, indem zunächst Deckgläser und Zellen vorbereitet werden. Der zweite Schritt besteht darin, die Mikroskopeinstellung präzise zu justieren, um eine optimale Bildqualität zu erzielen. Danach werden die korrekten Ereignisse, Winkel und Bildgebungsbedingungen für die Aufnahme von Bildern oder Filmen ausgewählt. Der letzte Schritt ist die Nachbearbeitung der aufgenommenen Bilder. Letztendlich wird die Rasenmikroskopie verwendet, um die Dynamik der Proteinlokalisation an der Zellkortex zu untersuchen.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber überlegenen Metallen wie konventioneller oder konfokaler Mikroskopie liegt darin, dass der Bildkontrast in der Mikroskopie sehr hoch ist, was schnelle Aufnahmezeiten und geringe Lichtintensität ermöglicht. Daher kann diese Methode helfen, zentrale Fragen im Bereich der Membranforschung zu beantworten, wie beispielsweise die Mechanismen der lateralen Proteintrennung oder die Mobilität von Membranproteinen. Deckgläser für die Turf-Mikroskopie sollten vor der Verwendung vo

visualization-cortex-organization-dynamics-microorganisms-using-total

Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Hier zeigen wir die Protokolle für die Durchführung von Einzelmolekül-Fluoreszenz-Mikroskopie an lebenden Bakterienzellen, damit funktionale molekulare Komplexe detektiert werden, verfolgt und quantifiziert.

Visualizing Einzelne molekulare Komplexe In Vivo Verwenden der erweiterten Fluoreszenzmikroskopie

Dieses Video beschreibt TIRF, eine auf Totalreflexionsmikroskopie basierende Technik zur Visualisierung der Polymerisationsdynamik von Aktin und Mikrotubuli. Die Methode ermöglicht die hochauflösende Abbildung der Kopplungsdynamik von Aktin und Mikrotubuli in Echtzeit, was für das Verständnis zellulärer Wechselwirkungen unerlässlich ist.

TIRF-Mikroskopie zur Visualisierung der Kopplungsdynamik von Aktin und Mikrotubuli

Quelle: Daniele, F., et. al TIRFM und pH-sensitive GFP-Sonden zur Bewertung der Vesikeldynamik von Neurotransmittern in SH-SY5Y Neuroblastomzellen: Zellbildgebung und Datenanalyse. J. Vis. exp. (2015). Dieses Video zeigt die Bildgebung von humanen Neuroblastomzellen mit einem Totalreflexionsfluoreszenzmikroskop (TIRF), um mit Fluorophoren markierte synaptische Vesikel sichtbar zu machen. Die Zellen werden zunächst im Epifluoreszenzmodus fokussiert. Anschließend werden Anpassungen vorgenommen,...

Zellbildgebung mittels Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie

Quelle: Winkle, C. C., et al. Unter Verwendung kombinierter Methoden zur Definition der Rolle der Plasmamembranabgabe während der Axonverzweigung und der neuronalen Morphogenese. J. Vis. Exp. (2016)Dieses Video zeigt die Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie (TIRF) zur Visualisierung exozytärer Ereignisse in kortikalen Neuronen. Ein pH-empfindlicher Marker für grün fluoreszierendes Protein (GFP) fluoresziert bei der Vesikelfusion, wobei die selektive TIRF-Anregung die membranproximale Exozytose...

Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie zur Visualisierung exozytärer Ereignisse 

Um die Strömungsgeschwindigkeiten und die Richtungsabhängigkeit von filamentösem Aktin an der immunologischen T-Zell-Synapse zu untersuchen, wird die hochauflösende Bildgebung lebender Zellen mit Totalreflexionsfluoreszenz kombiniert und mit räumlich-zeitlicher Bildkorrelationsspektroskopie quantifiziert.

Kortikalen Aktin Fluss in T-Zellen durch Raum-zeitliche Bildkorrelationsspektroskopie von Structured Illumination Microscopy Daten Quantifizierte

Eine erweiterte Mikroskop, die es ermöglichen schnelle und hochauflösende werden Bildgebung des isolierten Plasmamembran sowohl die umliegenden intrazelluläre Volumen präsentiert. Die Integration von spinning-Disk und Gesamtbetrag interne Reflexion Fluoreszenzmikroskopie in einer Aufspannung ermöglicht live-imaging-Experimente bei hohen Erfassungsraten bis zu 3,5 s pro Bildstapel.

Visualisierung von Adhäsion Bildung in den Zellen durch erweiterte Spinning-Disk-Total Internal Reflection-Fluoreszenz-Mikroskopie

Dieses Protokoll ist eine Anleitung zur Implementierung der Interferenzreflexionsmikroskopie auf einem Standardfluoreszenzmikroskop für etikettenfreie, kontrastreiche Hochgeschwindigkeitsaufnahmen von Mikrotubuli mit In-vitro-Oberflächen-Assays.

Implementierung der Interferenzreflexionsmikroskopie für etikettenfreie High-Speed-Bildgebung von Mikrotubuli

Hier wird ein TIRF-Mikroskopie-basierter  In-vitro-Rekonstitutionsassay vorgestellt, um gleichzeitig die Dynamik zweier Mikrotubulipopulationen zu quantifizieren und zu vergleichen. Es wird ein Verfahren beschrieben, um gleichzeitig die kollektive Aktivität mehrerer Mikrotubuli-assoziierter Proteine auf vernetzten Mikrotubulibündeln und einzelnen Mikrotubuli zu betrachten.

Simultane Visualisierung der Dynamik von vernetzten und einzelnen Mikrotubuli in vitro mittels TIRF-Mikroskopie

Wir stellen ein Protokoll zur Implementierung der Interferenzreflexionsmikroskopie und der Total-Interreflexions-Fluoreszenzmikroskopie für die gleichzeitige Abbildung von dynamischen Mikrotubuli und fluoreszenzmarkierten Mikrotubuli-assoziierten Proteinen vor.

Simultane Interferenzreflexion und Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie zur Abbildung dynamischer Mikrotubuli und assoziierter Proteine

Dieses Protokoll ist ein Leitfaden für die Visualisierung von dynamischem Aktin und Mikrotubuli unter Verwendung eines in vitro TIRF-Mikroskopie-Assays ( Total Internal Fluorescence).

Visualisierung der Dynamik der Kopplungsdynamik von Aktin und Mikrotubuli in vitro durch Total-Internal-Reflection-Fluoreszenz-Mikroskopie (TIRF)

Erfahren Sie, wie TIRF-Mikroskopie zur Visualisierung von Proteindynamiken an der Zellcortex von Mikroorganismen eingesetzt wird. Diese Methode ermöglicht hochauflösende Bildgebung mit hohem Kontrast und zeitlicher Auflösung.

Visualisierung von Cortex Organisation und Dynamik in Mikroorganismen, mit Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

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