Visualisierung von Cortex Organisation und Dynamik in Mikroorganismen, mit Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, hochwertige Totalreflexions-, Fluoreszenz- oder TURF-Aufnahmen von mikroorganismen mit Zellwand zu erhalten. Dies wird erreicht, indem zunächst Deckgläser und Zellen vorbereitet werden. Der zweite Schritt besteht darin, die Mikroskopeinstellung präzise zu justieren, um eine optimale Bildqualität zu erzielen.

Danach werden die korrekten Ereignisse, Winkel und Bildgebungsbedingungen für die Aufnahme von Bildern oder Filmen ausgewählt. Der letzte Schritt ist die Nachbearbeitung der aufgenommenen Bilder. Letztendlich wird die Rasenmikroskopie verwendet, um die Dynamik der Proteinlokalisation an der Zellkortex zu untersuchen.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber überlegenen Metallen wie konventioneller oder konfokaler Mikroskopie liegt darin, dass der Bildkontrast in der Mikroskopie sehr hoch ist, was schnelle Aufnahmezeiten und geringe Lichtintensität ermöglicht. Daher kann diese Methode helfen, zentrale Fragen im Bereich der Membranforschung zu beantworten, wie beispielsweise die Mechanismen der lateralen Proteintrennung oder die Mobilität von Membranproteinen. Deckgläser für die Turf-Mikroskopie sollten vor der Verwendung von Staubpartikeln gereinigt werden.

Da Rasen empfindlich gegenüber Hintergrundsignalen ist, die von Staub auf einem schmutzigen Deckglas stammen, wird ein gereinigtes Deckglas mit geringerem Hintergrund benötigt, um das Verfahren zur Reinigung von Deckgläsern zu beginnen. Verwenden Sie eine Pinzette, um die Deckgläser in einen keramischen Halter mit Deckel zu legen.

Füllen Sie als Nächstes einen Glasbehälter mit einmolarer Natronlauge. Diese Natronlauge kann mehrfach wiederverwendet werden. Stellen Sie den Keramikhalter mit den Deckgläsern in die Natronlauge und inkubieren Sie die Deckgläser zwei Stunden lang unter langsamer kontinuierlicher Rotation.

Incubieren Sie nicht länger als acht Stunden, da dies zu undurchsichtigen Deckgläsern führt; waschen Sie die Deckgläser nach zwei Stunden zweimal mit destilliertem Wasser je fünf Minuten unter langsamer kontinuierlicher Rotation und lagern Sie die gereinigten Deckgläser im keramischen Halter in 100 % Ethanol. Um Bacillus subtilis-Zellen für die Rasenmikroskopie vorzubereiten, verdünnen Sie diese auf einen OD600 von 0,01 bis 0,05 in fünf Milliliter geeignetem Wachstumsmedium und kultivieren Sie sie bis in die exponentielle Phase. Bereiten Sie 1,25 % Aros in synthetischem Medium vor, indem Sie Aros-Pulver in einem 1,5-Milliliter-Kunststoffröhrchen bei 95 Grad Celsius auflösen und anschließend in einem Heizblock bei 72 Grad Celsius lagern.

Geben Sie einen kleinen Tropfen Aros in die Mitte eines Objektträgers und drücken Sie mit einem zweiten Objektträger nach mindestens zwei Minuten den Aros zu einer flachen Auflagefläche zusammen; trennen Sie anschließend vorsichtig die Objektträger. Zentrifugieren Sie 500 Mikroliter Bacillus subtilis-Zellen in einer Mikrozentrifuge bei 12.000 U/min für eine Minute. Entsorgen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 50 Mikrolitern Medium.

Geben Sie zwei bis vier Mikroliter Zellen in die Mitte des Aros-Pads. Entfernen Sie anschließend mit einer Pinzette eine gereinigte Deckglasplatte aus dem mit Ethanol gefüllten Behälter und trocknen Sie sie mit Druckluft. Legen Sie das Deckglas vorsichtig auf die Probe.

Lassen Sie die Zellen mindestens zwei Minuten vor der Mikroskopie absinken. Für Langzeit-Aufnahmen versiegeln Sie die Ränder der Deckgläser mit der erhitzten Mischung aus Vaseline, Lanolin und Paraffin oder Val app. Um Saccharomyces visi-Zellen für die Turf-Mikroskopie vorzubereiten, verdünnen Sie eine Vorkultur und lassen Sie sie mindestens fünf Stunden in geeignetem Medium wachsen.

Um die exponentielle Phase zu erreichen, nehmen Sie einen Deckgläser aus dem mit Ethanol gefüllten Behälter und trocknen Sie ihn mit Druckluft mithilfe eines Pipettenspreizers. Geben Sie fünf Mikroliter Concanavalin A-Lösung (Con A) auf den Deckgläser und trocknen Sie diesen erneut mit Druckluft. Con A bindet an die Kohlenhydrate der Hefezellwand und immobilisiert die Hefezellen.

Als Nächstes übertragen Sie 4,5 µL einer Hefe-Zellsuspension auf eine Seite der Con, einem beschichteten Deckglas. Plazieren Sie das Deckglas vorsichtig mit der Probenfläche nach unten auf einem Objektträger, beginnend mit einer Kante, und lassen Sie es langsam abrollen. Dadurch wird die Bildung von Luftblasen vermieden.

Lassen Sie die Zellen mindestens zwei Minuten lang vor der Mikroskopie ruhen, und verschließen Sie die Ränder der Deckgläser mit Val-App für Langzeit-Aufnahmen. Alle in diesem Video gezeigten Experimente werden an einer angepassten TURB-Apparatur durchgeführt, die auf einem vollautomatischen IMEX-Stativ mit einem Olympus 100x 1,45 NA-Objektiv basiert. Als Lichtquellen dienen 75-Milliwatt-Dioden-gepumpte Festkörperlaser oder DPSS-Laser mit 488 Nanometern und 561 Nanometern.

Turf-Winkel und Fluoreszenz. Die Wiederherstellung nach Photobleaching oder die FRAP-Position kann über zwei Galvanometer sofort eingestellt werden. Ein drittes Galvanometer dient zum Umschalten zwischen Epi-, Fluoreszenz-, FRAP- und Turf-Modus.

Die Galvanometer, die direkt über die Live-Aufnahmesoftware gesteuert werden, ermöglichen eine einfache Messung der Lokalisationskinetik von Objekten, die in Rasenbildern verfolgt werden, die mit einer EM-CCD-Kamera und einer 2x-Vermehrungsoptik vor der Kamera aufgenommen werden. Die Aufnahme wird ebenfalls über die Live-Aufnahmesoftware gesteuert. Bevor Sie mit dem Laser arbeiten, setzen Sie die Laserschutzbrille auf, projizieren Sie den Laser im Rasenmodus an die Decke und kalibrieren Sie die Nullgrad-Position so, dass sich der Laser in einer geraden Linie befindet.

Stellen Sie mit dem Objektiv den Laserpunkt nach optimaler Justage auf minimale Größe scharf; das Laserprofil sollte einen gut definierten, annähernd runden Fleck bilden. Führen Sie vor jeder Sitzung eine Kalibrierung durch. Um eine optimale Bildqualität zu erzielen, ist die Ausrichtung des Turbomikroskops entscheidend für den Erfolg dieses Verfahrens.

Die korrekten Einfallswinkel und Parameter für die Bildaufnahme müssen sorgfältig für eine optimale Bildqualität eingestellt werden. Um die Bildaufnahme zu beginnen, lokalisieren Sie die Position der Zellen mithilfe der Hellfeldbeleuchtung. Rote LEDs eignen sich besonders gut, da sie keine nennenswerten phototoxischen Schäden verursachen.

Wechseln Sie zur Laserbeleuchtung und wählen Sie geeignete Laser und Filterkombinationen aus, um die gewünschten Fluorophore anzuregen. Stellen Sie sicher, dass der Winkel unterhalb des kritischen Winkels liegt. Andernfalls werden Signale von GFP-Fusionsproteinen nicht detektiert. Suchen Sie den oberen Bereich der Zelle, also die Seite der Zelle, die der Deckglasunterlage zugewandt ist.

Erhöhen Sie den Einfallswinkel des Laserstrahls schrittweise, bis die Signale verschwinden, und verringern Sie den Winkel dann langsam, bis die Fluoreszenz an der Zelloberfläche wieder erscheint. Stellen Sie den Z-Fokus erneut für eine optimale Position an der Oberfläche ein. Akzeptable TIRF-Winkel erzeugen keinen unscharfen Halo an der Zellkante, wie an diesem Beispiel eines Hefeproteins veranschaulicht.

PMA mit einem GFP, abgebildet mit abnehmenden Einfallswinkeln von oben links nach unten rechts. Die Bilder zeigen einen plötzlichen Signalverlust am kritischen Winkel sowie eine fortschreitende Abnahme der strukturellen Informationen und des Signal-Rausch-Verhältnisses. Passen Sie die Laserintensitäten und die Kameraverstärkung an, um den Dynamikbereich zu maximieren. Typischerweise sind E-M-C-C-D-Kameras optimal, um sehr schwache Signale bei hohem Signal-Rausch-Verhältnis zu detektieren.

Die Rasenmikroskopie ist sehr empfindlich gegenüber geringen Höhenunterschieden. Unterschiede der Deckgläser führen dazu, dass nur wenige Zellen gleichzeitig scharf abgebildet werden können. Dieses Bild einer dichten Suspension fluoreszierender Kügelchen ist ein Beispiel für ein ungleichmäßiges Sichtfeld, bei dem nur ein Teil des Sichtfelds scharf ist.

Daher kann der Erfassungsbereich bei kleinen Zellen häufig auf einen Teilbereich reduziert werden, der das gewünschte Objekt enthält. Bei Doppelfärbungs-TURF-Experimenten muss die Übersprechen von Fluorophoren für RFP-GFP-Paare minimiert werden. Verwenden Sie separate Emissionsfilter, da RFP durch 488-Nanometer-Licht nur schwach angeregt wird.

Ein typischer Arbeitsablauf, um Übersprechen und Doppelfarben-Aufnahmen zu vermeiden, wird hier gezeigt. Nach der Aufnahme der Zellen mit separaten Filtern werden die Bilder mithilfe fluoreszierender Kügelchen entfaltet und ausgerichtet, bevor sie zusammengeführt werden. Ein kritischer Parameter, der die Bildqualität beeinflusst, ist die Justierung des Lasers und ein sauberes Objektiv. Nach der Justierung des Lasers und Fokussierung auf die für die Aufnahme verwendete Z-Position sollte die Probe entfernt und das Objektiv vollständig von Öl gereinigt werden.

Restöl führt zur Beugung des Laserlichts und zu Streuungen im Strahlprofil. Die Rasenmikroskopie kann verwendet werden, um die Verteilung von Aktin-Homologen und Zellwandenzymen in bakteriellen Zellen sichtbar zu machen. In diesem repräsentativen Ergebnis wurden Bacillus subtilis-Zellen, die GFP-Fusionen des Aktin-Homologs Mbl oder der Transpeptidase PbpH exprimieren, mittels Rasen- und herkömmlicher Epi-Fluoreszenzmikroskopie abgebildet.

Die hier gezeigten Bilder stellen Durchschnittsprojektionen einer Zeitspanne dar, um den von beweglichen MBL-Flecken erfassten Bereich anzuzeigen, der mit verschiedenen Bildgebungsmodi überwacht wurde. Die blaue Umrandung im Überlagerungsbild zeigt die Zellgrenze an, die aus einem Hellfeldbild visualisiert wurde.

Die wöchentlich exprimierte Transpeptidase PBPH lokalisiert in kortikalen Flecken, die mittels Epifluoreszenz kaum sichtbar sind, aber mittels TURF klar zu unterscheiden sind. Die verminderte Durchdringung ist am besten für das P-B-P-H-G-F-P-Signal an den durch die Pfeile markierten Septen zu beobachten, das in der Epifluoreszenz als Linien, in der TURF-Aufnahme jedoch als Punkte erscheint. Dieser nächste Satz von Bildern zeigt einen Vergleich zwischen Epifluoreszenz- und TURF-Beleuchtung der TOR-Komplexkomponente Bit 61 in Saccharomyces visi.

Dieses Protein wird schwach exprimiert und bildet kleine kortikale Flecken mit nur wenigen Protein-Kopien pro Fleck. Bei der Epi-Fluoreszenz sind nur wenige Flecken über dem starken Hintergrund sichtbar, während die Flecken im TURF mit einem sehr guten Signal-Rausch-Verhältnis abgebildet werden können. Eine zusätzliche Verbesserung des Bildkontrasts kann durch verschiedene Bildverarbeitungsschritte erreicht werden, wie beispielsweise die Subtraktion von gaußschen oder mediangeglätteten Bildern, während die lokale Hintergrundsubtraktion Rauschen entfernt und hochintensive Strukturen schärft.

Dies geschieht oft auf Kosten feiner Strukturen und einer übermäßigen Verstärkung von Hochintensitätsbereichen. Wie durch den Pfeil angezeigt, ist ein besseres Verfahren die 2D-Dekonvolution, die mit kostenlosen oder kommerziell verfügbaren Softwarepaketen durchgeführt werden kann. Die Erhöhung des Kontrasts nach der Dekonvolution wird durch diesen Zeitrafferfilm von GFP RAs zwei veranschaulicht, der abwechselnd rohe und dekonvolvierte Bildausschnitte zeigt.

Da GFP RAs zwei ein schnell bewegliches Protein ist, sind schnelle Akquisitionszeiten wichtig, um sein dynamisches Verhalten aufzulösen. Die Bildverarbeitung ist besonders wichtig für Kolokalisationsanalysen, wie in diesem zeitraffenden Doppel-Farben-Film von Hefe-Proteinen, FET 3G FP und PMA one RFP, veranschaulicht wird.

Die ersten 10 Bilder stellen Rohaufnahmen dar, und die übrigen Bilder sind verarbeitete Aufnahmen. Um eine Analyse zu ermöglichen, ist es entscheidend, den Kontrast zu maximieren und die unscharfen Rohaufnahmen schärfer darzustellen. Turb und Frap bieten eine leistungsfähige Kombination zur Untersuchung der Dynamik kortikaler Proteine. Die Anwendung dieser Technik in B-subtilis-Zellen, die G-F-P-M-B-L exprimieren, schloss Treadmilling als Mechanismus für die beobachtete Beweglichkeit von MBL-haltigen Flecken aus.

Der Chm-Graph des sich bewegenden Bereichs und das Intensitätsprofil entlang des Chm-Graphen, das durch die gepunktete Linie angegeben ist, werden in ähnlicher Weise wie Turf-FRAP des Hefe-Plasmamembrans dargestellt. Ein TPAs-PMA-Versuch zeigte die langsamen Umordnungen von Proteinen der Hefe-Plasmamembran auf, die sich nach ihrer Entwicklung in netzartige Domänen verteilen, welche die gesamte Zelloberfläche bedecken. Diese Technik ebnete den Weg für Forschungen im Bereich der Bakterienzellbiologie, um den Mechanismus der Zellwandbiosynthese in BA subtilis zu untersuchen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Turf-Bilder von Mikroorganismen wie Hefe und Bakterien aufnimmt, und wie diese Technik bei der Untersuchung dynamischer Eigenschaften kortikaler Proteine helfen kann.