Biomolekulare Erkennung Einsatz der Interferometrische Reflectance Imaging Sensor (IRIS)

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, die Bindung von Antikörpern an auf einer Oberfläche immobilisierte Antigene mithilfe einer empfindlichen, markerfreien Sensorschnittstelle namens Iris zu quantifizieren. Dies wird erreicht, indem zunächst ein Array aus Test- und Kontrollsonden auf einer chemisch funktionalisierten, einheitlichen Siliziumdioxidoberfläche präpariert wird, um gezielt Proteine aus der Lösung zu erfassen. Die immobilisierten Sonden können Antikörper oder Antigene, DNA oder RNA oder jede andere Art von Makromolekül sein, die mit den funktionalisierten, polymeren oder spezifischen Oberflächenchemien kompatibel ist.

Der präparierte Mikroarray wird anschließend mit einer Probe inkubiert, die die Proteine von Interesse enthält, wodurch eine Bindung unter vom Forscher festgelegten Bedingungen ermöglicht wird. Danach wird der gesamte Sensorarray bei verschiedenen Lichtwellenlängen abgebildet. Beim IRIS-System werden die reflektierten Intensitäten jedes Pixels mit speziell programmierten Algorithmen verarbeitet.

Um die Menge an Biomaterial zu quantifizieren, das an jede Test- oder Kontrollbedingung gebunden ist, werden Nachinkubationsergebnisse erhalten, die eine effektive Detektion und absolute Quantifizierung von Antikörpern in einer komplexen Mischung auf der Grundlage interferometrischer, markierungsfreier Messungen dieses Systems zeigen. Aufbauend auf mehr als einem Jahrzehnt Forschung und Entwicklung zu optischen Interferenz- und Harzkammergeräten, entwickeln wir diese neue Methode, die viele der störenden Probleme überwinden könnte, auf die wir bei unseren früheren markierungsfreien Biosensorsystemen gestoßen sind. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend, da die Schritte zur Datensammlung korrekte Normalisierungs- und Qualitätskontrollverfahren erfordern. Um eine genaue und wiederholbare Datenaufnahme sicherzustellen.

Um die Siliziumdioxid-Substrate mit selbstabsorbierenden Copo Dmma NAS-Karten zu beschichten, bereiten Sie zunächst die Polymerlösung vor, indem Sie 100 Milligramm des Polymers zu fünf Millilitern entionisiertem Wasser hinzufügen. Geben Sie anschließend fünf Milliliter einer 40 %igen gesättigten Ammoniumsulfat-Lösung hinzu, um eine endgültige Ammoniumsulfat-Konzentration von 0,92 molaren zu erreichen. Tauchen Sie die Chips nach der Inkubation 30 Minuten lang unter Schütteln in die Polymerlösung ein.

Spülen Sie die Chips gründlich mit entionisiertem Wasser, trocknen Sie die Chips mit Argon- oder Stickstoffgas und backen Sie sie anschließend bei 80 Grad Celsius für 15 Minuten. Lagern Sie die mit Polymer beschichteten Substrat-Chips bis zu zwei bis drei Monate lang in einer trockenen Umgebung, beispielsweise in einem Vakuum-Exsikkator, bis zur Proben-Auftragsprozedur zur Verdünnung jeder Probe. Bestimmen Sie zunächst das korrekte Volumen der Probe-Stammlösung und des Puffers, um die gewünschte Endkonzentration zu erreichen.

Ein typisches Experiment verwendet Antigen oder IgG in einer Konzentration von 0,5 Milligramm pro Milliliter in phosphatgepufferter Salzlösung in der berechneten Menge jeder Proben-Stammlösung in kleine Eppendorf-Röhrchen, die die gewünschte Menge PBS-Puffer enthalten, und mischt die Lösungen. Anschließend pipettieren Sie die Probenlösungen in eine 96-Well-Platte mit geringer Proteinbindung, die als Quellplatte für den Spotter verwendet wird. Danach legen Sie die Spotting-Parameter für das gedruckte Array fest, indem Sie die Anzahl der Wiederholungen jeder Bedingung pro Raster bestimmen.

Das Raster legt die Anzahl der Replikatraster und den gewünschten Spottingort auf dem Chip fest. Platzieren Sie das Substrat und die Quellplatte im Spotter und überprüfen Sie anschließend die Abfall- und Versorgungsflaschen. Beginnen Sie den Drucklauf.

Nach dem Auftragen wird das Substrat über Nacht in eine Umgebung mit hoher Luftfeuchtigkeit gegeben, um den Immobilisierungs- und Deaktivierungsprozess nach der Inkubation ablaufen zu lassen. Waschen Sie die Substrate unter Schütteln, indem Sie den Chip zunächst dreimal einzeln jeweils drei Minuten lang in PBS mit 0,1 % Tween geben. Anschließend folgen drei Inkubationen zu je drei Minuten in PBS und danach in entionisiertem Wasser.

Wenn eine Trockenmessung durchgeführt wird, den Chip gründlich mit Argongas trocknen. Deaktivieren Sie die verbleibenden NHS-Gruppen auf der Copolymeroberfläche, indem Sie die Chips 30 Minuten lang in eine 50 Millimolarlösung von Ethanolamin mit auf 7,4 eingestelltem pH-Wert auf der Schüttelplatte tauchen. Spülen Sie das Ethanolamin vor Beginn des Inkubationsschritts gründlich mit PBS und anschließend mit entionisiertem Wasser ab.

Bereiten Sie eine Lösung der geeigneten Konzentration des Zielproteins in PBS für diese Demonstration vor. Für die negative Kontrollinkubation werden 500 Nanogramm pro Milliliter Anti-humanes Serumalbumin unter Zugabe eines äquivalenten Volumens Puffer ohne Zielprotein verwendet. Das Iris-System besteht aus einigen grundlegenden Elementen, wie einer Beleuchtungsquelle, optischen Komponenten zur korrekten Beleuchtung des Sensorsonden-Arrays, einer Kamera zur Aufzeichnung der reflektierten Lichtintensitäten und einer Probehalterung, auf der die Probe für die Messungen platziert wird.

Beginnen Sie mit einer Siliziumspiegelscan eines sauberen, unbeschichteten Siliziumchips, um alle danach erfassten Daten zu normalisieren, bevor der Scan durchgeführt wird. Bereiten Sie das Iris-System vor, indem Sie die Parameter für das Experiment anpassen. Dazu gehört die Messung des Histogramms der Lichtintensitäten, die die Kamera aufzeichnet, sowie die Einstellung der Belichtungszeit für optimale Intensitäten.

Nach dem Normalisierungsscannen laden Sie das vorbereitete Sondenarray in das Iris-System ein und führen Sie die Einrichtung wie zuvor durch. Stellen Sie den Fokus so ein, dass die Substratoberfläche korrekt abgebildet wird. Stellen Sie sicher, dass der Probenhalter waagerecht steht, indem Sie die aufgezeichneten Histogramme der reflektierten Lichtintensitäten überprüfen. Wählen Sie abschließend einen Dateinamen, unter dem die Daten gespeichert werden sollen.

Starten Sie die Software, um den Array zu scannen, wobei die Oberfläche mehrfach bei verschiedenen Wellenlängen beleuchtet und die gesammelten Bilder gemittelt werden. Der anfängliche optische Hochpunkt zur Referenzierung wird bestimmt, was eine korrekte Analyse der Massenänderungen auf der Oberfläche nach der Inkubation ermöglicht. Nach dem ersten Scan wird der Chip für eine Stunde auf einer Schüttelplatte in die vorbereitete Inkubationslösung getaucht. Die Inkubationsdauer kann je nach Grad der Besiedlung, der Konzentration des nachzuweisenden Targets und den Affinitäten des Target-Sonden-Paares erheblich variieren.

Nach der Inkubation den Waschschritt erneut wie zuvor durchführen. Das gleiche Protein-Array mit dem Iris-System scannen, um Nach-Inkubationsbilder für den Vergleich mit den Vor-Inkubationsbildern zu erhalten. Dieser Vorgang kann bei Bedarf für verschiedene Inkubationsschritte wiederholt werden.

Beispielsweise kann bei einem Sandwich-Assay-Format, bei dem ein sekundärer Antikörper verwendet wird, das gesammelte Bild für jeden Iris-Scan mithilfe einer kommerziell erhältlichen Software angepasst werden, um ein Bild der Sonde mit optischer Dickenbildung zu erzeugen. Eine schnelle qualitative Analyse der Bindung kann durch Subtraktion der Bilder nach und vor der Inkubation durchgeführt werden. Bindung zeigt sich als Intensitätsänderung an den Stellen, an denen Massenänderungen beobachtet wurden.

Zur quantitativen Analyse bestimmen Sie die Massendichten jedes Flecks im Vergleich zum Hintergrund, indem Sie die optische Dicke für jedes Pixel innerhalb eines Flecks sowie für einen außerhalb des Flecks liegenden Ringbereich mitteln. Nehmen Sie anschließend einen direkten Vergleich dieser beiden hier dargestellten Bereiche vor. Als Beispiel dient ein Schema des geschichteten Silizium-Siliziumdioxid-Iris-Substrats, das mit einem repräsentativen Antikörper-Array bepunktet ist.

Jedes Antikörper-Ensemble wird in Replikaten mit Spezifität für ein anderes Epitop aufgetragen, das ein unterschiedliches Protein anvisiert. Als Beispiel dienen zwei verschiedene ganze Viren und ein virales Protein als Zielstrukturen. Die negativen Kontrollantikörper hängen vom Assay ab und können unspezifisch und/oder virus-spezifisch sein.

Hier ist ein Beispiel für qualitative Ergebnisse der Bindung spezifischer Antikörper gegen humanes Serumalbumin an ein Array mit aufgetragenen HSA- und Kaninchen-IgG-Kontrollpunkten, wie hier dargestellt. Nach der Anpassung und Bestimmung der optischen Dicke der Bilder vor und nach der Inkubation kann ein Differenzbild des Bindungsarrays erstellt werden, um die Bindung schnell beurteilen zu können. Eine genauere quantitative Analyse zeigt, dass eine mittlere Änderung der optischen Höhe von 2,05 bzw. 0,13 Nanometern für die HSA- und Kaninchen-IgG-Punkte beobachtet wurde, jeweils bei einer Anti-HSA-Inkubationskonzentration von 500 Nanogramm pro Milliliter.

Dieses Balkendiagramm stellt ein Beispiel für die quantitativen Daten dar, die Iris-Messungen liefern können. In diesem Beispiel wird die Abhängigkeit der Bindung von Furchenproteinen von der Protein-Konzentration und der Länge des doppelsträngigen All-Ligaments dargestellt. Dieses Balkendiagramm zeigt die absoluten optischen Höhenmessungen für die anfänglichen immobilisierten All-Ligament-Trägerhöhen sowie nach der Inkubation zur Bindung an.

Zunehmende Konzentrationen des Fur-Proteins auf 5, 100 und 200 Nanomolar führten zu einer stärkeren Bindung an DNA-Sonden. Hier ist die berechnete Bindung von Fur-Protein-Dimeren pro doppelsträngigem DNA-Ligament dargestellt. Die Dimerbindung war bei einer Fur-Protein-Konzentration von 200 Nanomolar signifikant erhöht, was auf ein hohes Maß an unspezifischen Wechselwirkungen mit allen Ligamenten oder einen anderen Bindungsmechanismus des Fur-Proteins, wie beispielsweise die Aggregation mehrerer Dimere, hindeutet.

Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, mit sauberen, einheitlichen Substraten zu beginnen, die die geeignete Oxidschichtdicke aufweisen, und die Proben sauber zu halten, indem sie sorgfältig mit einer Pinzette gehandhabt werden. Ebenso entscheidend ist die Verwendung von Reagenzien, die ordnungsgemäß gelagert wurden und deren Funktionalität bekannt ist. Nach Anschauung dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie biomolekulare Wechselwirkungen in einem markierungsfreien Format gemessen werden können, indem funktionelle Sondenarrays auf einer Siliziumdioxidoberfläche hergestellt werden, sowie wie Daten mittels des interferometrischen Reflexionsabbildungssensors oder IRIS erfasst und analysiert werden.