Name: Biomolekulare Erkennung Einsatz der Interferometrische Reflectance Imaging Sensor (IRIS) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 4 s
Description: Erfahren Sie die biomolekulare Erkennung mit dem Interferometric Reflectance Imaging Sensor (IRIS). Diese kennzeichnungsfreie Methode ermöglicht die hochdurchsatzfähige Quantifizierung von Antikörperbindungen an Antigene auf Siliziumdioxid-Oberflächen.

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1. Untergrundvorbereitung <ol><li> Coat geschichtete Silizium-SiO 2-Substraten mit Selbst-Adsorption Copoly (DMA-NAS-MAPS): <ol><li> Copolymer-Synthese, chemische Struktur und Coating-Verfahren sind publiziert in: G. Pirri, F. Damin, M. Chiari, E. Bontempi, LE Depero. Charakterisierung eines polymeren Adsorbed Coating für DNA Microarray Slides Glas. Anal. Chem. 2004, 76, 1352-1358. </li><li> Kurz gesagt, bereiten Polymerlösung durch Zugabe von 100 mg des Polymers zu 5 ml deionisiertem Wasser (DI) und mit 5 ml 40% gesättigtem Ammoniumsulfat ((NH 4) 2 SO 4)-Lösung auf eine Endkonzentration von 0,92 M. zu erreichen </li><li> Tauchen Sie Chips in-Lösung für 30 min auf einem Schüttler und dann gründlich mit VE-Wasser. Dry gründlich mit Argon / N 2-Gas. </li><li> Bake-Chips bei 80 ° C für 15 min. </li></ol></li><li> Shop-Polymer-beschichtete Substrate / Chips in einer trockenen Umgebung (Vakuumexsikkator) für bis zu 3 Monaten bis Sonde Spotting Verfahren. </li></ol> 2. Vorbereitung der Probe Array: Antikörper, Antigene, ss / dsDNA, RNA, etc. <ol><li> Verdünnen Sie die Sonde (n) geeignete Konzentration in der gewünschten Puffer. Dieser Schritt kann erheblich variieren, aber ein typisches Experiment nutzt Antigen oder IgG in einer Konzentration von 0,5 mg / ml (Bereich von 0,1 -1 mg / mL) in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) bei pH ≈ 7,4. </li><li> Place Lösungen in einer 96 - oder 384-Well-Platte (oder Standard-Source-Platte für den Spotter verwendet wird) </li><li> Setup-Spotting-Parameter für die gewünschte gedruckt Array: Bestimmung der geeigneten Spotting-Parameter für die Oberfläche und Lösungen verwendet wird (Verweilzeiten, Annäherungsgeschwindigkeiten, etc.). Bestimmen Sie die Anzahl der Wiederholungen der einzelnen Bedingung pro Raster, die Grid-Layout, die Anzahl der zu replizieren Gitter, und die gewünschte Spotting Lage auf dem Chip. Legen Substrate und Quelle Platte an den entsprechenden Stellen, stellen Sie sicher, Abfall-und Vorratsflaschen sind bereit, und dem Druck beginnen laufen. </li><li> Nach Spotting fertig ist Platz Substrate in einer Umgebung mit hoher Feuchtigkeit über Nacht (4-18 Stunden), damit Immobilisierung und Deaktivierung durchgeführt werden soll. </li><li> Wash Substrate: legen Sie sie in den folgenden Lösungen für die drei Minuten für drei separate Wäschen: PBS mit 0,1% Tween (PBST), PBS und schließlich deionisiertem Wasser (DI). Je nach der Art des Experiments (wet vs trocken), trocken der Chip gründlich mit Argon Gas und beginnen Inkubation oder den Chip in einer Flusskammer und zu montieren. </li><li> Deaktivieren verbleibenden NHS-Gruppen auf Copolymer Oberfläche durch Eintauchen der Chips in einem 50 mM Lösung von Ethanolamin mit dem pH-Wert eingestellt auf 7,4 für 30 Minuten, während auf einem Schüttler Platte. Ein primäres Amin-haltige Verbindung wie Hydroxylamin oder Tris können ebenfalls verwendet werden, solange die vorbereitete Lösung ist sicher, mit Proteinen verwendet werden. Spülen Sie die Deaktivierung Lösung mit PBS dann VE-Wasser. </li><li> Optional Schritt (abhängig von der Oberflächenchemie zu beschäftigt): Block Oberfläche mit einer Lösung von BSA, Casein oder rehydriert Milch für 30 Minuten. Für das laufende polymeren Oberflächen-Chemie, die wir verwenden, haben wir diesen Schritt nicht ausführen, wie das Polymerrückgrat wirkt, um nicht-spezifische Protein-Bindung zu verhindern. </li></ol> 3. Datenerfassung und-Incubation Vorgehensweise: Endpoint-Format <ol><li> Machen Sie eine Lösung des Ziels von Interesse in der gewünschten Puffer. Hier wird es eine Lösung des entsprechenden Konzentration von Anti-BSA in PBS (: make 1-10 mL einer 10 ng / ml-Lösung von Anti-BSA in PBS ex) werden. Stellen Sie außerdem sicher, um eine äquivalente Menge an Puffer (ohne Ziel) für die negative Kontrolle Inkubationszeit haben. </li><li> Werfen Sie einen Silizium-Spiegel-Scan für die Normalisierung der alle nachfolgend erhobenen Daten. </li><li> Scan der vorbereiteten Probe Array mit dem IRIS-System vor der Inkubation Schritt, um die erste optische Höhe (Masse) an jedem Ort zu bestimmen. Dies wird für eine ordnungsgemäße Analyse von Veränderungen in der Masse auf der Oberfläche zu ermöglichen, dh der Grad der Bindung, nach der Inkubation. Hier werden einige Parameter für das laufende Experiment, wie Belichtungszeit, Sichtfeld, prosperierenden konzentrieren, etc. eingestellt werden </li><li> Tauchen Chip (s) in vorbereitete Lösung für 1 Stunde auf einem Schüttler Platte. Die Inkubationszeit kann variieren stark je nach dem Grad der Erregung, die Konzentration der Ziel erkannt, die Transporteigenschaften der Flusskammer (wenn eine Echtzeit-Erkennung-Modus verwendet wird), die Affinitäten der Target-Sonden-Paar, etc . </li><li> Nach der Inkubationszeit, wiederholen Sie den Waschvorgang in Schritt 2.5 beschrieben) </li><li> Scan der gleichen Sonde Array mit dem IRIS-System und erhalten nach der Inkubation Bilder für Vorinkubation Vergleich. </li><li> Wiederholen Sie diesen Vorgang für verschiedene Inkubationsschritte wenn nötig, zum Beispiel in einem Sandwich-Assay-Format, wo ein sekundärer Antikörper verwendet wird. </li></ol> 4. Data Analysis <ol><li> Fit die gesammelten Bilder für jede IRIS-Scan (Reihenfolge der Intensität Bilder), mit dem Labor-entwickelten Software zur ProDuce ein Bild von der Sonde Array mit optischen Dicke Informationen. Eine schnelle qualitative Analyse der Bindung kann durch Subtraktion (eingetragene) Post-und Pre-Inkubation Bilder durchgeführt werden. Binding wird als eine Änderung in der Intensität an den Stellen, wo Masse Veränderungen beobachtet erscheinen. Für die quantitative Analyse ermitteln Massendichten jeder Stelle im Vergleich zum Hintergrund durch Mittelung optische Dicke Informationen für jedes Pixel in einem Spot-und einen Ring außerhalb des Ortes und machen einen direkten Vergleich dieser beiden Bereiche. </li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse: Abbildung 1 zeigt ein Beispiel schematische Darstellung des geschichteten Si-SiO 2 IRIS Substrat mit einem Vertreter Antikörper Array entdeckt. Jeder Antikörper Ensemble ist in replizieren mit Spezifität für ein anderes Epitop gezielt verschiedene Proteine ​​entdeckt. Zwei verschiedene ganze Viren und ein virales Protein als Beispiel Ziele vertreten. Negative Kontroll-Antikörper richten sich nach dem Test und kann nicht-spezifische und / oder Virus-spezifisch. Abbildung 2 zeigt die Bindung von humanem Serum Albumin (HSA)-spezifische Antikörper gegen eine Reihe von spotted HSA und Kaninchen IgG (Kontrolle) Flecken. Wie hier zu sehen, nach der Montage und Bestimmung der optischen Dicken für die Pre-und Post-Inkubation Bilder, kann einen Unterschied Bild für die Bindung Array erstellt qualitativ beurteilen verbindlich. Die quantitative Analyse zeigt, dass ein 2,05 und 0,13 Nanometer mittlere optische Höhenänderung für die HSA und Kaninchen-IgG-Spots wurde beobachtet, die für eine Anti-HSA Inkubation Konzentration von 500 ng / mL. Abbildung 3 zeigt ein IRIS Messung Fur Proteinbindung Abhängigkeit von Proteinkonzentration und dsDNA Oligomer Länge. Die obere Grafik zeigt absolute optische Höhenmessungen für die erste immobilisierten Oligomers Sonde Höhen-und Post-Inkubation Fur bindend. Steigende Konzentrationen von Pelz (50, 100, 200 nM) führte zu einer erhöhten Bindung an DNA-Sonden. Die Länge der Oligomere auch Auswirkungen Fur Bindung mit längeren Sequenzen was zu mehr bindend. Hier sind auf Fehler und Bars eine Standardabweichung vom Mittelwert. Die untere Kurve zeigt berechnet Fur-Protein-Dimer binden pro dsDNA Strang. Dimer-Bindung wurde deutlich bei einem Fur-Protein-Konzentration von 200 nM auf eine hohe Ebene der nicht-spezifische Bindung erhöht. <img src="/files/ftp_upload/2694/2694fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Schematische Darstellung eines Beispiels Sondenarray normalerweise in einem Experiment zur spezifischen Viren und viralen Komponenten in einem Multiplex-Mode mit dem IRIS-System erkannt werden. <img src="/files/ftp_upload/2694/2694fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Post-Inkubation Unterschied die Grafik für eine Bindung von humanen Serum-Albumin-spezifischen Antikörpern gegen gesichtet HSA mit diesem Label-free-System bei einer Konzentration von 500 ng / mL gesammelt. Das Biomaterial Massendichte für jeden Fleck wird durch Mittelung optische Dicke Informationen innerhalb einer Stelle und dann einen Vergleich mit dem Durchschnitt von einem Ring um den Ort, die den Hintergrund bestimmt. <img src="/files/ftp_upload/2694/2694fig3.jpg" alt="Abbildung 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 3"> Abbildung 3. Plot der Bindung von Daten für die Fur-Protein-Wechselwirkungen mit gefleckten doppelsträngige Oligomere mit einem bekannten Konsensus-Sequenz auf Oligomer Länge, Lage der Konsensus-Sequenz innerhalb des Oligomers und Fur-Protein-Konzentration. Informationen über die absolute Höhe der Fur-Protein gebunden, um jedes entdeckte Sequenz (oben) können verwendet werden, um die Zahl der Pelz-Dimere gebunden an jede Art von Oligomer (unten) zu schätzen.

<ol><li>Özkumur, E., Needham, J. W., Bergstein, D. A., Gonzalez, R., Cabodi, M., Gershoni, J. M., Goldberg, B. B., Ünlö, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+and+dynamic+detection+of+biomolecular+interactions+for+high-throughput+microarray+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Label-free and dynamic detection of biomolecular interactions for high-throughput microarray applications.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 7988-7992 (2008).</li>
<li>Özkumur, E., Ahn, S., Yalcin, A., Lopez, C. A., Cevik, E., Irani, R. J., DeLisi, C., Chiari, M., Ünlö, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+microarray+imaging+for+direct+detection+of+DNA+hybridization+and+single-nucleotide+mismatches%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+and+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">Label-free microarray imaging for direct detection of DNA hybridization and single-nucleotide mismatches.</a> Biosensors and Bioelectronics. 25, 1789-1795 (2010).</li>
<li>Özkumur, E., Lopez, C. A., Yalcin, A., Bergstein, D. A., Connor, J. H., Chiari, M., Ünlö, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectral+reflectance+imaging+for+a+multiplexed%2C+high-throughput%2C+label-free%2C+and+dynamic+biosensing+platform%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Journal+of+Selected+Topics+in+Quantum+Electronics%22%5BJournal%5D)">Spectral reflectance imaging for a multiplexed, high-throughput, label-free, and dynamic biosensing platform.</a> IEEE Journal of Selected Topics in Quantum Electronics. 16, 635-646 (2010).</li>
<li>Lopez, C. A., Daaboul, G. G., Vedula, R. S., Özkumur, E., Bergstein, D. A., Geisbert, T. W., Fawcett, H. E., Goldberg, B. B., Connor, J. H., Ünlö, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+multiplexed+virus+detection+using+spectral+reflectance+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+and+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">Label-free multiplexed virus detection using spectral reflectance imaging.</a> Biosensors and Bioelectronics. , (2011).</li>
</ol>

Die IRIS-Plattform ist eine einfache und schnelle System für das Sammeln High-Throughput-Bindung von Daten in einem Mikroarray-Format zu verwenden. Durch kovalent immobilisiert verschiedenen funktionalen Protein-oder DNA-Sonden auf einer Oberfläche, Zielantigene / Biomarker / etc. kann aus der Lösung aufgenommen werden, wie in einem Immunoassay. Die Messung dieser Interaktionen über Sonde Bedingungen in einem Endpunkt oder Echtzeit-Format mit der IRIS-System ermöglicht hochempfindliche und quantitative Informationen für jede Interaktion gesammelt werden. Der Vertreter Experiment detaillierte hier ist nur ein Beispiel für die Arten von Wechselwirkungen, die mit dieser Technik untersucht werden können. Detektion von Transkriptionsfaktoren, virale Antigene, und ganze Viren zuvor und zeigte stellt nur ein paar Beispiele für die Arten von Analysen, die IRIS leicht umgehen kann.

<ol><li> Silizium-Wafer mit 500 nm von thermisch-grown Siliziumdioxid, Silicon Valley Microelectronics, kundenspezifischen Auftrag <li> Ammoniumsulfat-Pulver, Sigma-Aldrich Katze. # A5132 <li> Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) 10X bereit zu konzentrieren, Fisher Scientific Katze. # BP665-1 <li> Antikörper gegen das humane Serumalbumin (Anti-HSA), Sigma-Aldrich Katze. # A0433 <li> Humanes Serum Albumin (HSA), Sigma-Aldrich Katze. # A9511 <li> Argon oder Stickstoff (ultra-hohe Reinheit), Airgas Katze. # AR UHP300 oder # NI UHP300 <li> Petrischalen, 60 mm x 15 mm, Fisher Scientific Katze. # 0875713A <li> Scienceware ® Vakuum-Exsikkator, Sigma-Aldrich Katze. # Z119016 <li> Reaktionsgefäße, Fisher Scientific Katze. # 05-408-120 <li> 96-Well-Platten, geringe Zell-Bindung, Nalgene Nunc International Katze. # 145399 <li> BioOdyssey Calligrapher MiniArrayer, Bio-Rad <li> Tween-20, Sigma-Aldrich # P1379 <li> Ethanolamin, Sigma-Aldrich # 398136 <li> Hydroxylamin, Thermo Scientific Katze. # 26103 <li> Mehrzweck-Rotator, Thermo Scientific (Barnstead International), Modell # 2314, cat. # 2314Q <li> Retiga 2000R-Kamera, QImaging Katze. # 01-RET-2000R-FM-12 <li> ACULED Beleuchtungsquelle, PerkinElmer, kundenspezifischen Auftrag <li> Optische Komponenten (Linsen, Objektiven, Blenden-, Schienen-, Post, etc.), Thorlabs </ol>

biomolekulare erkennung einsatz der interferometrische reflectance imaging sensor (iris)

Biomolecular Detection employing the Interferometric Reflectance Imaging Sensor (IRIS)

Die empfindliche Messung von biomolekularen Wechselwirkungen hat den Einsatz in vielen Bereichen und Branchen wie Grundlagen der Biologie und Mikrobiologie, Umwelt / Landwirtschaft / Biodefense Überwachung, Nanobiotechnologie und vieles mehr. Für diagnostische Anwendungen, Monitoring (Erfassung) das Vorhandensein, Fehlen oder abnormale Expression gezielt Proteomik oder genomischen Biomarkern in Patientenproben gefunden werden verwendet, um Behandlungsansätze oder Therapie Wirksamkeit zu bestimmen. In der Forschung arena, sind Informationen über molekulare Affinitäten und Spezifitäten für voll Charakterisierung der untersuchten Systeme nützlich. Viele der aktuellen Systeme eingesetzt, um molekulare Konzentrationen oder Affinitäten zu bestimmen verlassen sich auf die Verwendung von Etiketten. Beispiele für diese Systeme umfassen Immunoassays wie die Enzyme Linked Immuno Assay (ELISA), Polymerase-Kettenreaktion (PCR)-Techniken,-Gel-Elektrophorese-Assays und Massenspektrometrie (MS). Im Allgemeinen sind diese Etiketten fluoreszierend, radiologischen oder kolorimetrischen in der Natur und sind direkt oder indirekt auf die molekulare Ziel von Interesse angebracht. Obwohl die Verwendung von Etiketten allgemein anerkannt und hat einige Vorteile, es gibt auch Nachteile, die Förderung der Entwicklung von neuen Label-freie Methoden zur Messung dieser Wechselwirkungen. Diese Nachteile gehören praktische Aspekte wie erhöhte Assay Kosten Reagenz Lebensdauer und Benutzerfreundlichkeit, die Lagerung und Sicherheit betrifft, verschwendet Zeit und Mühe bei der Etikettierung, und die Variabilität zwischen den verschiedenen Reagenzien aufgrund der Kennzeichnung Prozesse oder Etiketten selber. Auf einer wissenschaftlichen Grundlage, kann der Einsatz dieser Etiketten auch vorstellen Schwierigkeiten wie Bedenken mit Auswirkungen auf die Funktion des Proteins / Struktur durch die Anwesenheit des angeschlossenen Labels und die Unfähigkeit zur direkten Messung der Interaktionen in Echtzeit. Präsentiert hier ist die Verwendung eines neuen Label-freien optischen Biosensor, dass zugänglich Studien Microarray ist, bezeichnet der interferometrischen Reflectance Imaging Sensor (IRIS), zum Nachweis von Proteinen, DNA, antigenen Materials, ganze Krankheitserreger (Virionen) und anderes biologisches Material. Die IRIS-System wurde gezeigt, dass eine hohe Empfindlichkeit, Präzision und Reproduzierbarkeit bei verschiedenen biomolekularen Wechselwirkungen [1-3] haben. Die Vorteile sind Multiplex-Imaging-Fähigkeit, Echtzeit-und Endpunkt Messmöglichkeiten und andere High-Throughput-Attribute wie reduzierte Reagenzienverbrauch und eine Reduktion der Untersuchungszeit Zeiten. Darüber hinaus ist die IRIS-Plattform einfach zu bedienen, erfordert kostengünstige Geräte und nutzt Silizium-basierten Festphasenassays Komponenten macht es kompatibel mit vielen zeitgenössischen Oberflächenchemie Ansätze. Hier präsentieren wir die Verwendung des IRIS-Systems von der Vorbereitung der Sonden-Arrays zur Inkubation und Messung von Ziel-Bindung an der Analyse der Ergebnisse in einem Endpunkt-Format. Das Modell-System wird die Aufnahme des Ziels Antikörper, die spezifisch für humanes Serum Albumin (HSA) auf HSA-spotted Substrate sind.

Quantitative, High-Throughput-, Echtzeit-und Label-free biomolekularen Erkennung (DNA, Proteine, etc.) auf SiO<sub&gt; 2</sub&gt; Oberflächen kann mit Hilfe einer einfachen interferometrische Technik, die auf LED-Beleuchtung setzt, minimale optische Komponenten und eine Kamera sein. Die interferometrische Reflectance Imaging Sensor (IRIS) ist kostengünstig, einfach zu bedienen und zugänglich Formate Microarray.

Biomolekulare Erkennung Einsatz der Interferometrische Reflectance Imaging Sensor (IRIS)

Die empfindliche Messung biomolekularer Interaktionen findet in vielen Bereichen und Industrien Anwendung, wie etwa in der Grundlagenbiologie und Mikrobiologie, ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, die Bindung von Antikörpern an auf einer Oberfläche immobilisierte Antigene mithilfe einer empfindlichen, markerfreien Sensorschnittstelle namens Iris zu quantifizieren. Dies wird erreicht, indem zunächst ein Array aus Test- und Kontrollsonden auf einer chemisch funktionalisierten, einheitlichen Siliziumdioxidoberfläche präpariert wird, um gezielt Proteine aus der Lösung zu erfassen. Die immobilisierten Sonden können Antikörper oder Antigene, DNA oder RNA oder jede andere Art von Makromolekül sein, die mit den funktionalisierten, polymeren oder spezifischen Oberflächenchemien kompatibel ist.Der präparierte Mikroarray wird anschließend mit einer Probe inkubiert, die die Proteine von Interesse enthält, wodurch eine Bindung unter vom Forscher festgelegten Bedingungen ermöglicht wird. Danach wird der gesamte Sensorarray bei verschiedenen Lichtwellenlängen abgebildet. Beim IRIS-System werden die reflektierten Intensitäten jedes Pixels mit speziell programmierten Algorithmen verarbeitet.Um die Menge an Biomaterial zu quantifizieren, das an jede Test- oder Kontrollbedingung gebunden ist, werden Nachinkubationsergebnisse erhalten, die eine effektive Detektion und absolute Quantifizierung von Antikörpern in einer komplexen Mischung auf der Grundlage interferometrischer, markierungsfreier Messungen dieses Systems zeigen. Aufbauend auf mehr als einem Jahrzehnt Forschung und Entwicklung zu optischen Interferenz- und Harzkammergeräten, entwickeln wir diese neue Methode, die viele der störenden Probleme überwinden könnte, auf die wir bei unseren früheren markierungsfreien Biosensorsystemen gestoßen sind. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend, da die Schritte zur Datensammlung korrekte Normalisierungs- und Qualitätskontrollverfahren erfordern. Um eine genaue und wiederholbare Datenaufnahme sicherzustellen.Um die Siliziumdioxid-Substrate mit selbstabsorbierenden Copo Dmma NAS-Karten zu beschichten, bereiten Sie zunächst die Polymerlösung vor, indem Sie 100 Milligramm des Polymers zu fünf Millilitern entionisiertem Wasser hinzufügen. Geben Sie anschließend fünf Milliliter einer 40 %igen gesättigten Ammoniumsulfat-Lösung hinzu, um eine endgültige Ammoniumsulfat-Konzentration von 0,92 molaren zu erreichen. Tauchen Sie die Chips nach der Inkubation 30 Minuten lang unter Schütteln in die Polymerlösung ein.Spülen Sie die Chips gründlich mit entionisiertem Wasser, trocknen Sie die Chips mit Argon- oder Stickstoffgas und backen Sie sie anschließend bei 80 Grad Celsius für 15 Minuten. Lagern Sie die mit Polymer beschichteten Substrat-Chips bis zu zwei bis drei Monate lang in einer trockenen Umgebung, beispielsweise in einem Vakuum-Exsikkator, bis zur Proben-Auftragsprozedur zur Verdünnung jeder Probe. Bestimmen Sie zunächst das korrekte Volumen der Probe-Stammlösung und des Puffers, um die gewünschte Endkonzentration zu erreichen.Ein typisches Experiment verwendet Antigen oder IgG in einer Konzentration von 0,5 Milligramm pro Milliliter in phosphatgepufferter Salzlösung in der berechneten Menge jeder Proben-Stammlösung in kleine Eppendorf-Röhrchen, die die gewünschte Menge PBS-Puffer enthalten, und mischt die Lösungen. Anschließend pipettieren Sie die Probenlösungen in eine 96-Well-Platte mit geringer Proteinbindung, die als Quellplatte für den Spotter verwendet wird. Danach legen Sie die Spotting-Parameter für das gedruckte Array fest, indem Sie die Anzahl der Wiederholungen jeder Bedingung pro Raster bestimmen.Das Raster legt die Anzahl der Replikatraster und den gewünschten Spottingort auf dem Chip fest. Platzieren Sie das Substrat und die Quellplatte im Spotter und überprüfen Sie anschließend die Abfall- und Versorgungsflaschen. Beginnen Sie den Drucklauf.Nach dem Auftragen wird das Substrat über Nacht in eine Umgebung mit hoher Luftfeuchtigkeit gegeben, um den Immobilisierungs- und Deaktivierungsprozess nach der Inkubation ablaufen zu lassen. Waschen Sie die Substrate unter Schütteln, indem Sie den Chip zunächst dreimal einzeln jeweils drei Minuten lang in PBS mit 0,1 % Tween geben. Anschließend folgen drei Inkubationen zu je drei Minuten in PBS und danach in entionisiertem Wasser.Wenn eine Trockenmessung durchgeführt wird, den Chip gründlich mit Argongas trocknen. Deaktivieren Sie die verbleibenden NHS-Gruppen auf der Copolymeroberfläche, indem Sie die Chips 30 Minuten lang in eine 50 Millimolarlösung von Ethanolamin mit auf 7,4 eingestelltem pH-Wert auf der Schüttelplatte tauchen. Spülen Sie das Ethanolamin vor Beginn des Inkubationsschritts gründlich mit PBS und anschließend mit entionisiertem Wasser ab.Bereiten Sie eine Lösung der geeigneten Konzentration des Zielproteins in PBS für diese Demonstration vor. Für die negative Kontrollinkubation werden 500 Nanogramm pro Milliliter Anti-humanes Serumalbumin unter Zugabe eines äquivalenten Volumens Puffer ohne Zielprotein verwendet. Das Iris-System besteht aus einigen grundlegenden Elementen, wie einer Beleuchtungsquelle, optischen Komponenten zur korrekten Beleuchtung des Sensorsonden-Arrays, einer Kamera zur Aufzeichnung der reflektierten Lichtintensitäten und einer Probehalterung, auf der die Probe für die Messungen platziert wird.Beginnen Sie mit einer Siliziumspiegelscan eines sauberen, unbeschichteten Siliziumchips, um alle danach erfassten Daten zu normalisieren, bevor der Scan durchgeführt wird. Bereiten Sie das Iris-System vor, indem Sie die Parameter für das Experiment anpassen. Dazu gehört die Messung des Histogramms der Lichtintensitäten, die die Kamera aufzeichnet, sowie die Einstellung der Belichtungszeit für optimale Intensitäten.Nach dem Normalisierungsscannen laden Sie das vorbereitete Sondenarray in das Iris-System ein und führen Sie die Einrichtung wie zuvor durch. Stellen Sie den Fokus so ein, dass die Substratoberfläche korrekt abgebildet wird. Stellen Sie sicher, dass der Probenhalter waagerecht steht, indem Sie die aufgezeichneten Histogramme der reflektierten Lichtintensitäten überprüfen. Wählen Sie abschließend einen Dateinamen, unter dem die Daten gespeichert werden sollen.Starten Sie die Software, um den Array zu scannen, wobei die Oberfläche mehrfach bei verschiedenen Wellenlängen beleuchtet und die gesammelten Bilder gemittelt werden. Der anfängliche optische Hochpunkt zur Referenzierung wird bestimmt, was eine korrekte Analyse der Massenänderungen auf der Oberfläche nach der Inkubation ermöglicht. Nach dem ersten Scan wird der Chip für eine Stunde auf einer Schüttelplatte in die vorbereitete Inkubationslösung getaucht. Die Inkubationsdauer kann je nach Grad der Besiedlung, der Konzentration des nachzuweisenden Targets und den Affinitäten des Target-Sonden-Paares erheblich variieren.Nach der Inkubation den Waschschritt erneut wie zuvor durchführen. Das gleiche Protein-Array mit dem Iris-System scannen, um Nach-Inkubationsbilder für den Vergleich mit den Vor-Inkubationsbildern zu erhalten. Dieser Vorgang kann bei Bedarf für verschiedene Inkubationsschritte wiederholt werden.Beispielsweise kann bei einem Sandwich-Assay-Format, bei dem ein sekundärer Antikörper verwendet wird, das gesammelte Bild für jeden Iris-Scan mithilfe einer kommerziell erhältlichen Software angepasst werden, um ein Bild der Sonde mit optischer Dickenbildung zu erzeugen. Eine schnelle qualitative Analyse der Bindung kann durch Subtraktion der Bilder nach und vor der Inkubation durchgeführt werden. Bindung zeigt sich als Intensitätsänderung an den Stellen, an denen Massenänderungen beobachtet wurden.Zur quantitativen Analyse bestimmen Sie die Massendichten jedes Flecks im Vergleich zum Hintergrund, indem Sie die optische Dicke für jedes Pixel innerhalb eines Flecks sowie für einen außerhalb des Flecks liegenden Ringbereich mitteln. Nehmen Sie anschließend einen direkten Vergleich dieser beiden hier dargestellten Bereiche vor. Als Beispiel dient ein Schema des geschichteten Silizium-Siliziumdioxid-Iris-Substrats, das mit einem repräsentativen Antikörper-Array bepunktet ist.Jedes Antikörper-Ensemble wird in Replikaten mit Spezifität für ein anderes Epitop aufgetragen, das ein unterschiedliches Protein anvisiert. Als Beispiel dienen zwei verschiedene ganze Viren und ein virales Protein als Zielstrukturen. Die negativen Kontrollantikörper hängen vom Assay ab und können unspezifisch und/oder virus-spezifisch sein.Hier ist ein Beispiel für qualitative Ergebnisse der Bindung spezifischer Antikörper gegen humanes Serumalbumin an ein Array mit aufgetragenen HSA- und Kaninchen-IgG-Kontrollpunkten, wie hier dargestellt. Nach der Anpassung und Bestimmung der optischen Dicke der Bilder vor und nach der Inkubation kann ein Differenzbild des Bindungsarrays erstellt werden, um die Bindung schnell beurteilen zu können. Eine genauere quantitative Analyse zeigt, dass eine mittlere Änderung der optischen Höhe von 2,05 bzw. 0,13 Nanometern für die HSA- und Kaninchen-IgG-Punkte beobachtet wurde, jeweils bei einer Anti-HSA-Inkubationskonzentration von 500 Nanogramm pro Milliliter.Dieses Balkendiagramm stellt ein Beispiel für die quantitativen Daten dar, die Iris-Messungen liefern können. In diesem Beispiel wird die Abhängigkeit der Bindung von Furchenproteinen von der Protein-Konzentration und der Länge des doppelsträngigen All-Ligaments dargestellt. Dieses Balkendiagramm zeigt die absoluten optischen Höhenmessungen für die anfänglichen immobilisierten All-Ligament-Trägerhöhen sowie nach der Inkubation zur Bindung an.Zunehmende Konzentrationen des Fur-Proteins auf 5, 100 und 200 Nanomolar führten zu einer stärkeren Bindung an DNA-Sonden. Hier ist die berechnete Bindung von Fur-Protein-Dimeren pro doppelsträngigem DNA-Ligament dargestellt. Die Dimerbindung war bei einer Fur-Protein-Konzentration von 200 Nanomolar signifikant erhöht, was auf ein hohes Maß an unspezifischen Wechselwirkungen mit allen Ligamenten oder einen anderen Bindungsmechanismus des Fur-Proteins, wie beispielsweise die Aggregation mehrerer Dimere, hindeutet.Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, mit sauberen, einheitlichen Substraten zu beginnen, die die geeignete Oxidschichtdicke aufweisen, und die Proben sauber zu halten, indem sie sorgfältig mit einer Pinzette gehandhabt werden. Ebenso entscheidend ist die Verwendung von Reagenzien, die ordnungsgemäß gelagert wurden und deren Funktionalität bekannt ist. Nach Anschauung dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie biomolekulare Wechselwirkungen in einem markierungsfreien Format gemessen werden können, indem funktionelle Sondenarrays auf einer Siliziumdioxidoberfläche hergestellt werden, sowie wie Daten mittels des interferometrischen Reflexionsabbildungssensors oder IRIS erfasst und analysiert werden.

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Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll zur Untersuchung von DNA-Protein-Wechselwirkungen unter Verwendung eines Streptavidin-basierten Biolayer-Interferometrie-Systems (BLI). Es werden die wesentlichen Schritte und Überlegungen zur Verwendung grundlegender oder fortgeschrittener Bindungskinetik zur Bestimmung der Gleichgewichtsbindungsaffinität (KD) der Wechselwirkung beschrieben.

Analyse von DNA-Protein-Wechselwirkungen mit Streptavidin-basierter Biolayer-Interferometrie

In dieser Arbeit stellen wir ein Protokoll vor, das die optische photothermale Infrarot-Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (OPTIR-FISH), auch bekannt als Mid-Infrared Photothermal-FISH (MIP-FISH), verwendet, um einzelne Zellen zu identifizieren und ihren Stoffwechsel zu verstehen. Diese Methodik kann für verschiedene Anwendungen eingesetzt werden, einschließlich der Kartierung des Zellstoffwechsels mit Einzelzellauflösung.

Optische photothermale Infrarot-Fluoreszenz-In-situ-Hybridisierung (OPTIR-FISH)

Erfahren Sie die biomolekulare Erkennung mit dem Interferometric Reflectance Imaging Sensor (IRIS). Diese kennzeichnungsfreie Methode ermöglicht die hochdurchsatzfähige Quantifizierung von Antikörperbindungen an Antigene auf Siliziumdioxid-Oberflächen.

Biomolekulare Erkennung Einsatz der Interferometrische Reflectance Imaging Sensor (IRIS)

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