Bestimmung von Molekülstrukturen von HIV Hüllglycoproteine ​​mit Cryo-Elektronen-Tomographie und automatisierte Sub-Tomogramm Averaging

Über 60 Millionen Menschen haben sich mit HIV infiziert, dem Virus, das Aids verursacht. HIV AIDS ist eine globale Gesundheitskrise, und obwohl intensive Forschungsanstrengungen ihnen dramatisch das Leben von Infizierten gekostet haben, bleibt ein echter Impfstoff schwer fassbar. Ein Schwerpunkt der HIV-Impfstoffforschung ist das Hüllglykoprotein, mit dem HIV in Zielzellen eindringt.

In diesem Video zeigen wir, wie wir Strukturen dieses wichtigen Proteins mit Hilfe eines bildgebenden Verfahrens namens Kryo-Elektronentomographie erhalten. Beginnend mit gereinigtem HIV zeigen wir Schritte zur Aufbereitung von gefrorenen Proben, Schritte zur Aufzeichnung elektronenmikroskopischer Bilder von diesen gefrorenen Proben und Schritte zur Umwandlung dieser Bilder in Strukturmodelle, die für die Entwicklung von HIV-Aids-Impfstoffen nützlich sein könnten. Ein einzigartiger Aspekt dessen, was wir in diesem Video präsentieren, ist, dass die Arbeit von Mitgliedern ihres Labors aus einem breiten Altersspektrum demonstriert wird, von Schülern der Mittel- und Oberstufe über College- und Masterstudenten bis hin zu Postdoktoranden und leitenden Wissenschaftlern.

Die Herstellung von vitrifizierten Virusproben, die für die Kryo-Elektronentomographie geeignet sind, erfolgt durch Verteilen einer wässrigen Suspension von Viren über kleine Löcher in einem Kohlenstofffilm, der von einem Kupfergitter gestützt wird, und anschließendes schnelles Einfrieren der Viren. Das Ziel dieses Schritts ist es, eine gefrorene Probe intakter Viren vorzubereiten, die in einem nahezu nativen Zustand gefangen wurden. Zu Beginn werden die Gitter in einer Glimmentladungseinheit platziert.

Dieses Gerät reinigt die Gitter, indem es sie ionisiertem Gas aussetzt. Jetzt, da die Gitter einsatzbereit sind, wird eine Suspension von Viren hergestellt, die mit kleinen Goldpartikeln vermischt sind. Diese Partikel sind für die Datenerfassung und -verarbeitung unerlässlich.

Als nächstes wird ein Tropfen Virussuspension auf das frisch plasmagereinigte Gitter gegeben. Das Gitter wird dann in einen Roboter geladen, der es mit Filterpapier abtupft, wodurch der Tropfen zu einem dünnen Flüssigkeitsfilm reduziert wird. Die Probe wird dann in flüssiges Ethan getaucht, das die Viren schnell mit einer Geschwindigkeit von mehr als 100.000 Kelvin pro Sekunde einfriert.

Das tiefgefrorene Gitter wird dann in eine Aufbewahrungsbox für den Transport zum Mikroskop überführt. Dies wird so lange wiederholt, bis die gewünschte Anzahl von Gittern eingefroren ist. Nachdem die Gitter der Virusproben fertig sind, besteht der nächste Schritt darin, sie in das Mikroskop zu laden.

Für die Bildgebung kann dies manuell oder mit Roboterunterstützung erfolgen. Wenn die Probengitter manuell geladen werden, sitzt der Benutzer an einer speziellen Station, an der die Proben unter flüssigem Stickstoff manipuliert werden können, die Proben werden in eine tragbare stickstoffgekühlte Kammer gelegt, die versiegelt, evakuiert und dann am Mikroskop befestigt wird. Neuere Mikroskope sind in der Lage, die Probenbeladung stärker zu automatisieren.

Hier werden in einem Titan Cryos Mikroskop gefrorene Proben vom Benutzer an das Mikroskop abgegeben und dann robotergestützt mit den im Mikroskop geladenen Probengittern geladen. Jedes Raster kann vom Benutzer untersucht werden, bevor mit der Bildgebung begonnen werden kann. Die Mikroskopparameter werden für jeden Bereich auf dem Probenraster eingerichtet, der interessante Merkmale aufweist.

In diesem Fall handelt es sich um HIV-Viren. Bei der Definition jedes neuen Bereichs speichert der Mikroskopcomputer die bereichsspezifischen Bildgebungsparameter. Wenn der Benutzer alle Positionen von Interesse definiert hat, besucht der Computer jede Position automatisch erneut und sammelt einen Datensatz.

Jeder Datensatz wird gesammelt, indem das Probengitter in Bezug auf den Elektronenstrahl gekippt wird, wobei sichergestellt wird, dass der Strahl an der gleichen Stelle auf dem Gitter fokussiert bleibt. Bei der Datenerfassung in der Elektronenmikroskopie mussten die Benutzer traditionell am Mikroskop sitzen und physisch mit dem Gerät interagieren. Diese Art der Interaktion mit dem Mikroskop wird hier während eines Besuchs von Präsident Obama in einer Geheimdienstfabrik gezeigt.

Jüngste Fortschritte bei den Computerschnittstellen für Mikroskope ermöglichen es den Anwendern nun, die Datenerfassung in Echtzeit von einem entfernten Computer im Labor oder anderswo aus zu überwachen und anzupassen. Um die Formen der Hülle sichtbar zu machen, müssen die Informationen aus Hunderten von Einzelbildern gemittelt werden, um das Signal zu verstärken. Dies ist ein rechenintensiver Prozess, der hier mit Hilfe eines Clusters von Computern namens Bio Wolf durchgeführt wird.

Am NIH wurden leistungsstarke Methoden entwickelt, um einzelne Volumina zu extrahieren und die Informationen mithilfe von Algorithmen zu mitteln, die bei hohen Geräuschpegeln arbeiten können. Die Dichtekarten, die sowohl von nativen Viren als auch von Viren mit komplexen bis biologisch wichtigen Molekülen erhalten wurden, bieten eine reichhaltige Datenbank mit Informationen über die Strukturbiologie von HIV. Die Dichtekarten werden im molekularen Detail lebendig, wenn die Daten mit Informationen aus der Röntgenkristallographie der einzelnen Untereinheiten kombiniert werden, aus denen sich der Hüllglykoprotein-Spike zusammensetzt.

Die Daten, die aus diesen Tomos stammen, können sehr dicht und schwierig zu interpret. 3D Software für die Unterhaltungsindustrie kann zur Visualisierung der 3D-Modelle verwendet werden, indem Farben, Texturen und Beleuchtung hinzugefügt werden, wodurch sie leichter zu analysieren sind. Zu den häufig verwendeten Visualisierungssoftware gehören Mirror, 3D Studio Max und Maya.

Wir haben gerade Schritt für Schritt gezeigt, wie man molekulare Modelle für die Struktur der Hülle erhalten kann. Glykoprotein, ausgehend von gereinigtem HIV. Mit dieser Methode haben wir auch Strukturen für das Hüllglykoprotein im Komplex mit einer Vielzahl von Molekülen bestimmt, die das Virus binden und verwerten können.

Hier zeigen wir ein Beispiel für die Struktur des Hüllglykoproteins im Komplex mit einem Antikörper namens B12. Zu verstehen, warum einige Moleküle das Virus binden und nutzen können und andere dies nicht tun, ist für ein rationales Impfstoffdesign sehr wichtig. Die Bestimmung der molekularen Strukturen von Hüllglykoproteinen von HIV oder anderen Viren wie Influenza und Ebola ist der Schlüssel zum Verständnis des Eintritts und der Nutzung von Viren.

Wie Sie gesehen haben, entwickelt sich die Kryo-Elektronentomographie jetzt zu einem leistungsfähigen Werkzeug, um dieses Ziel zu erreichen.