Die Quantifizierung der Aktivität von Cis-Regulatorische Elemente in der Maus Retina durch Explantation Elektroporation

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Netzhautimplantate von Mäusen mit fluoreszierenden transkriptionellen Reportern elektrozu reinigen und ihre Expressionsniveaus zu quantifizieren. Dies wird erreicht, indem zunächst neonatales Netzhautgewebe von Mäusen durch Dissektion isoliert wird. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, die Netzhaut mit fluoreszierenden DNA-Reporterkonstrukten zu elektronisieren.

Der dritte Schritt des Eingriffs besteht darin, die elektroporierten Netzhäute acht Tage lang als Implantate zu kultivieren. Der letzte Schritt des Verfahrens besteht darin, den retinalen Explan zu ernten und die Expressionsniveaus der fluoreszierenden Reporter zu quantifizieren. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die die relativen Expressionsniveaus verschiedener Promotorreporterkonstrukte in der sich entwickelnden Mausnetzhaut durch x explan-Elektroporation mit anschließender quantitativer Datenanalyse zeigen.

Mein Name ist Joe Corbo und ich bin Fakultätsmitglied in der Abteilung für Pathologie und Immunologie an der Washington University School of Medicine in St. Louis. Und heute werden wir ein Videoprotokoll vorstellen, das die Technik der X-Explan-Elektroporation in die Netzhaut von Neugeborenen demonstriert, um die Aktivität von Photorezeptor-spezifischen CYS-Regulationselementen zu quantifizieren, und dieses Protokoll wird von einer Doktorandin aus meinem Labor, Cindy Montana, demonstriert. Sterilisieren Sie zuerst die Elektroporationskammer und alle Instrumente mit 70%igem Ethanol zur Vorbereitung der Augenentnahme.

Desinfizieren Sie sowohl Handschuhe als auch Labortisch mit Ethanol und halten Sie während des gesamten Eingriffs sterile Bedingungen aufrecht. Als nächstes pipettieren Sie in einer Gewebekulturhaube sechs Milliliter Seziermedium in eine sterile 60-Millimeter-Petrischalen und drei Milliliter Medium in zwei sterile 35-Millimeter-Schalen. Desinfizieren Sie an der Arbeitsplatte den Kopf und Hals eines neugeborenen Mauswelpen mit 70 % Ethanol.

Nachdem Sie den Kopf schnell mit einer Schere geköpft haben, geben Sie den Kopf in eine sterile 100-Millimeter-Schale, schneiden Sie die Kopfhaut mit einer kleinen Schere ab, um die Augen unter einem Präpariermikroskop freizulegen. Schöpfen Sie das Auge mit einer gebogenen Pinzette vorsichtig aus der Augenhöhle und legen Sie es dann in eine 35-Millimeter-Schale, die sich zum Sezieren eignet. Mittel. Fahren Sie fort, die Augen so zu sammeln, dass drei bis vier Augen pro Aliquot der zu elektroporierenden DNA vorhanden sind, und halten Sie die Augen und das Seziermedium bei Raumtemperatur, bis sie fertig sind.

Desinfizieren Sie sowohl eine Rasierklinge als auch die Verpackung einer sterilen Transferpipette aus Kunststoff mit 70 % Ethanol und schneiden Sie dann mit der Rasierklinge die Spitze der Pipette hoch genug ab, damit ein ganzes Auge pipettiert werden kann. Mit der verbreiterten Pipette übertragen Sie ein Auge von der 35-Millimeter-Schale in die 60-Millimeter-Schale unter einem Präpariermikroskop mit hoher Leistung. Verwenden Sie eine feine Pinzette, um Gewebe wie extraokulare Muskeln und Fett von der Augenoberfläche zu entfernen.

Entfernen Sie dann den Sehnerv, indem Sie ihn an der Basis abklemmen. Um die Netzhaut zu isolieren, stechen Sie ein kleines Loch in die Sklera am Limbus, die Sklera und das pigmentierte Epithel der Netzhaut erscheinen im Verhältnis zum Netzhautgewebe, das Matt Gray ist, glänzend. Führen Sie einen Zacken von beiden Pinzettenpaaren in das Loch ein und reißen Sie die Sklera und das RPE vorsichtig auf.

Achten Sie darauf, das Objektiv an Ort und Stelle zu lassen. Schieben Sie die präparierte Netzhaut mit der verbreiterten Pipette in die zweite 35-Millimeter-Schale mit dem Medium. Sammeln Sie alle Netzhäute und lagern Sie sie in einem 37 Grad Celsius heißen Gewebekultur-Inkubator.

Bis zur Elektroporation in einer Gewebekulturhaube für jedes zu elektroporierende DNA-Eloqua wird eine sterile 35-Millimeter-Schale mit Dissektionsmedium und eine zweite Schale mit Kulturmedium gefüllt. Mit einer Pipette P 200 die Kammern in der Elektroporationsschale mit sterilem XPB S3 dreimal auswaschen. Füllen Sie die Kammern mit den 60-Mikroliter-DNA-Aliquoten und füllen Sie alle unbenutzten Kammern mit 60 Mikrolitern eines XPBS.

Schließen Sie die Elektroden an die Elektroporationsschale an und geben Sie die entsprechenden Einstellungen an der Elektro ein. Fassen Sie die Netzhaut mit einer feinen Pinzette an der Linse und übertragen Sie sie in die Elektroporationskammern. Platzierung von bis zu vier Netzhäuten in jeder Kammer.

Ordnen Sie die Netzhaut so an, dass die Linse an der Metallstange anlehnt, die an der positiven Elektrode befestigt ist. Wischen Sie die Pinzette zwischen den einzelnen Kammern ab, um eine Verschleppung der DNA von einer Kammer in die nächste zu vermeiden. Sobald alle Netzhäute ausgerichtet sind, drücken Sie Start auf dem Elektro.

Auf dem Metallstab, der an der negativen Elektrode befestigt ist, sollten sich winzige Bläschen bilden. Trennen Sie die Elektroden und schalten Sie den Elektro mit einer Pinzette aus. Bewegen Sie die Netzhaut vorsichtig von den Kammerwänden weg.

Übertragen Sie die Netzhäute aus den Kammern in die 35-Millimeter-Schalen mit dem Seziermedium. Übertragen Sie die Netzhaut mit einer sterilen Transferpipette aus dem Seziermedium in die 35-Millimeter-Schalen mit dem Nährmedium. Beschriften Sie die Vertiefungen einer sterilen Kulturplatte mit sechs Vertiefungen und füllen Sie jede Vertiefung mit drei Millilitern Kultur. Mittel.

Verwenden Sie eine sterile Pinzette, um Watman-Nukleofilter auf dem Medium in jeder Vertiefung zu schweben, wobei die glänzende Seite der Filter nach oben zeigt. Übertragen Sie mit Hilfe eines Präparierfernrohrs eine einzelne Netzhaut mit sterilem Transfer der Pipette mit der Linsenseite nach unten auf den Filter. Wenn die Netzhaut mit der Linsenseite nach oben landet, ziehen Sie sie wieder nach oben in die Pipette und versuchen Sie es erneut.

Legen Sie nicht mehr als vier Netzhäute in jede Vertiefung und bewahren Sie sie in separaten Tröpfchen auf. Sobald die Netzhäute in die Vertiefungen eingesetzt wurden, stellen Sie die Kulturplatte in einen 37 Grad Celsius heißen Gewebekultur-Inkubator und wachsen Sie für die gewünschte Zeit. Normalerweise acht Tage gesehen: Hier ist eine erfolgreiche Elektroporation führt zur Expression des DNA-Konstrukts über ein Viertel bis ein Drittel der Netzhautoberfläche.

Die Fluoreszenzniveaus werden quantifiziert, indem gleichmäßig elektroporierte Regionen, die das CRE-Konstrukt exprimieren, mit Regionen außerhalb der Netzhaut verglichen und dann normalisiert werden, um die GFP-Expression zu kontrollieren. Insbesondere Stäbchen-Photorezeptoren werden effizient transduziert. Hier sind die Ergebnisse einer Elektroporation, bei der zwei stäbchenspezifische Promotoren die Expression von GFP und DS-Rot in der äußeren Kernschicht steuern.

Durch die Überlagerung der beiden Expressionsmuster mit der hier in Blau gezeigten DPI-Färbung wird die Photorezeptor-spezifische Expression deutlich. Weder in der Interclear-Schicht noch in der Ganglienzellschicht wird eine Expression beobachtet. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie eine gute Vorstellung davon haben, wie Sie Elektro und Kultur von Maus-Netzhautexplantaten analysieren, um die Aktivität der regulatorischen Elemente der Netzhautzyste zu quantifizieren.

Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.