Name: Die Quantifizierung der Aktivität von Cis-Regulatorische Elemente in der Maus Retina durch Explantation Elektroporation (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 38 s
Description: Lernen Sie die Quantifizierung cis-regulatorischer Elemente in der Mäuseretina durch Explant-Elektroporation. Diese Methode ermöglicht die Analyse von Genexpressionsmustern in Photorezeptoren.

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Die Autoren bedanken sich bei Karen Lawrence für ihre Hilfe danken, mit dem Abschnitt über Bau der Elektroporation Kammer.

<ol><li>Carroll, S. B., Grenier, J. K., Weatherbee, S. D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCarroll%2C+SB+%22From+DNA+to+diversity+%3A+molecular+genetics+and+the+evolution+of+animal+design%22">From DNA to diversity : molecular genetics and the evolution of animal design</a>. , 2nd edn, Blackwell Pub. (2005).</li>
<li>Davidson, E. H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDavidson%2C+EH+%22Genomic+regulatory+systems+%3A+development+and+evolution%22">Genomic regulatory systems : development and evolution</a>. , Academic Press. (2001).</li>
<li>Ptashne, M., Gann, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPtashne%2C+M+%22Genes+%26+signals%22">Genes & signals</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2002).</li>
<li>Blow, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-Seq+identification+of+weakly+conserved+heart+enhancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">ChIP-Seq identification of weakly conserved heart enhancers.</a> Nat Genet. 42, 806-810 (2010).</li>
<li>Visel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-seq+accurately+predicts+tissue-specific+activity+of+enhancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">ChIP-seq accurately predicts tissue-specific activity of enhancers.</a> Nature. 457, 854-858 (2009).</li>
<li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+and+RNA+interference+in+the+rodent+retina+in+vivo+and+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 16-22 (2004).</li>
<li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+expression+of+transgenes+introduced+by+in+vivo+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Controlled expression of transgenes introduced by in vivo electroporation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 1027-1032 (2007).</li>
<li>LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+and+improved+tools+for+in+utero+electroporation+studies+of+developing+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Cereb+Cortex%22%5BJournal%5D)">New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex.</a> Cereb Cortex. 19, 120-125 (2009).</li>
<li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+gene+function+in+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of gene function in the retina.</a> Methods Mol Biol. 423, 259-278 (2008).</li>
<li>Lee, J., Myers, C. A., Williams, N., Abdelaziz, M., Corbo, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+fine-tuning+of+photoreceptor+cis-regulatory+elements+through+affinity+modulation+of+transcription+factor+binding+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Quantitative fine-tuning of photoreceptor cis-regulatory elements through affinity modulation of transcription factor binding sites.</a> Gene Ther. 17, 1390-1399 (2010).</li>
<li>Carter-Dawson, L. D., LaVail, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rods+and+cones+in+the+mouse+retina.+II.+Autoradiographic+analysis+of+cell+generation+using+tritiated+thymidine%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Rods and cones in the mouse retina. II. Autoradiographic analysis of cell generation using tritiated thymidine.</a> J Comp Neurol. 188, 263-272 (1979).</li>
<li>Young, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+differentiation+in+the+retina+of+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Rec%22%5BJournal%5D)">Cell differentiation in the retina of the mouse.</a> Anat Rec. 212, 199-205 (1985).</li>
<li>Corbo, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRX+ChIP-seq+reveals+the+cis-regulatory+architecture+of+mouse+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">CRX ChIP-seq reveals the cis-regulatory architecture of mouse photoreceptors.</a> Genome Res. 20, 1512-1525 (2010).</li>
<li>Kim, D. S., Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+core+paired-type+and+POU+homeodomain-containing+transcription+factor+program+drives+retinal+bipolar+cell+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A core paired-type and POU homeodomain-containing transcription factor program drives retinal bipolar cell gene expression.</a> J Neurosci. 28, 7748-7764 (2008).</li>
<li>Karra, D., Dahm, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfection+techniques+for+neuronal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Transfection techniques for neuronal cells.</a> J Neurosci. 30, 6171-6177 (2010).</li>
<li>Onishi, A., Peng, G. H., Chen, S., Blackshaw, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pias3-dependent+SUMOylation+controls+mammalian+cone+photoreceptor+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Pias3-dependent SUMOylation controls mammalian cone photoreceptor differentiation.</a> Nat Neurosci. 13, 1059-1065 (2010).</li>
</ol>

Explantation Elektroporation ist eine einfache Möglichkeit zur Quantifizierung der cis-regulatorische Aktivität in den Entwicklungsländern Maus Netzhaut. Im Vergleich zu cis-regulatorische Analyse per Maus Transgenese, ist die Elektroporation viel billiger und erfordert nur neugeborenen Maus Welpen, DNA, Sezierbesteck und Elektroporation / Gewebekultur Ausrüstung. Es ist auch weit weniger zeitaufwendig: Ein Experiment erfordert nur ein paar Stunden Vorbereitungszeit, eine Kultur Zeitraum von etwa acht Tage, und ein paar Stunden am Ende des Experiments für die Bildgebung und Datenanalyse. Explantation Elektroporation ist auch überlegen Zellkultur-basierten cis-regulatorische Analyse, da tatsächliche Netzhautgewebe genutzt wird. Die Netzhaut entwickelt ganz normal in Explantation Kultur-und bildet drei verschiedene Zellschichten (äußere Körnerschicht, innere Körnerschicht und Ganglienzellschicht), obwohl Photorezeptoren äußeren Segmente aufwendigen scheitern. Ein weiterer Vorteil ist, dass Explantation Elektroporation ist in hohem Maße reproduzierbar. Das gleiche Konstrukte in verschiedenen Netzhaut elektroporiert, auch an verschiedenen Tagen, führt in der Regel den gleichen relativen Expression. Darüber hinaus, da die Elektroporation Plasmide gedacht werden, um episomal in den Zellkern gehalten werden und sind nicht in Chromosomen integriert, scheinen sie nicht zu unterliegen den gleichen Integrationsstelle Effekte, die cis-regulatorische Analyse in transgenen Mäusen durchgeführt verteufeln. Explantation Elektroporation hat mehrere Einschränkungen. Erstens können nur Zellen, die sich noch in den Zellzyklus effizient transduziert werden durch Elektroporation 15. Bei P0, Stäbe und andere später geboren retinalen Zelltypen (bipolar, Amakrinzellen, M ller Glia) die wichtigsten Zellpopulationen durch diese Methode gezielt. Elektroporation von Zapfen-Photorezeptoren durch P0 Elektroporation wurde vor 16 berichtet, aber die Effizienz scheint gering zu sein. Eine zweite Einschränkung ist, dass Explantation Kultur über zwei Wochen zu einer fortschreitenden Fehlbildung der Netzhaut und wird daher nicht empfohlen. Wenn Promoter Quantifizierung am späten Zeitpunkten erforderlich ist, jedoch eine in vivo Elektroporation 9 durchgeführt, kann durch Netzhaut-Dissektion gefolgt werden an der gewünschten Zeitpunkt, Flachbild-Montage des seziert Netzhaut und Quantifizierung, wie in Abschnitt 9 beschrieben. Eine dritte Einschränkung ist, dass dieser Test nur mäßig hohem Durchsatz ist. Im Gegensatz zu Zellkultur-basierte Assays, dass Hunderte von Konstrukten in einem einzigen Experiment testen können, benötigt die Technik in diesem Protokoll beschriebenen mindestens eine ganze Maus Netzhaut pro Konstrukt. So kann nur ein paar Dutzend Konstrukte vernünftigerweise an einem Tag elektroporiert werden. Eine weitere Einschränkung in Bezug auf die Quantifizierung der Promotoraktivität mit dem vorliegenden Ansatz ist, dass es ein Potential für &quot;Durchschlagen&quot; der DsRed-Fluoreszenz in den GFP-Kanal, vor allem wenn Assay sehr starke Promotoren. Der Grund dafür ist, dass das Emissionsspektrum teilweise mit der von GFP DsRed. Zur Umgehung dieses Problems sollten optimiert Emissionsfilter verwendet werden, minimieren die spektrale Überlappung zwischen DsRed und GFP werden. Wenn eine solche optimierte Filter-Sets nicht verfügbar sind, wäre eine weitere mögliche Lösung sein, um einen blau-verschoben fluoreszierenden Proteins (zB BFP oder CFP) statt der GFP zu verwenden.

<table border="1"><tbody><tr><th> Name des Reagenzes </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th><th> Kommentare (optional) </th></tr><tr><td> Elektroporation Gericht, MicroSlide 453 </td><td> BTX Harvard Apparatus </td><td> 45-0105 </td><td> Siehe Protokoll Abschnitt 1 für Änderungen </td></tr><tr><td> 100% Silikon Aquarium Zement </td><td> Perfecto Fertigung </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Plastic Mikroröhrchen Rack </td><td> Fisher Scientific </td><td> 05-541 </td><td> Nur das Gestell Griff verwendet werden </td></tr><tr><td> Dremel </td><td></td><td></td><td> Zum Schneiden der Griff aus dem Kunststoffrohr-Rack </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 11965 </td><td></td></tr><tr><td> F12 </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 11765 </td><td></td></tr><tr><td> L-Glu/pen/strep </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 10378-016 </td><td> 100X-Konzentration </td></tr><tr><td> Insulin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> I-6634 </td><td> Für 1000X Aktien, zu 5mg/ml in 5mM HCl und Filter-sterilisiert resuspendieren </td></tr><tr><td> FBS </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 26140-079 </td><td></td></tr><tr><td> ECM 830 Square-wave Elektroporator </td><td> BTX Harvard Apparatus </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Nuclepore Filter </td><td> Whatman </td><td> 110606 </td><td> 25mm, 0,2 um </td></tr><tr><td> Gewebekultur-Inkubator </td><td></td><td></td><td> 37 ° C, 5% CO 2 </td></tr><tr><td> Deckgläser # 1.5 </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12-544E </td><td> 0,16 mm dick </td></tr><tr><td> Fluoreszierende Verbindung Mikroskop mit Kamera ausgestattet </td><td></td><td></td><td> Kamera sollte einfarbig (zB ORCA-ER-Kamera von Hamamatsu) werden </td></tr><tr><td> EGFP / DsRed-Filter-Set für zusammengesetzte Mikroskop </td><td> Chroma Technology Corp </td><td> 86007 </td><td> Dieser Filter gesetzt minimiert Übersprechen zwischen den roten und grünen chanenels </td></tr><tr><td> ImageJ Software </td><td> NIH </td><td></td><td> <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a> </td></tr></tbody></table>

die quantifizierung der aktivität von cis-regulatorische elemente in der maus retina durch explantation elektroporation

Quantifying the Activity of cis-Regulatory Elements in the Mouse Retina by Explant Electroporation

Transkriptionsfaktoren innerhalb der zellulären Gen-Netzwerke Kontrolle der raum-zeitlichen Muster und Ebenen des Ausdrucks ihrer Zielgene durch Bindung an cis-regulatorischen Elemente (Cres), kurz (~ 300-600 bp) erstreckt sich von genomischer DNA, die sich stromaufwärts liegen kann, stromabwärts oder innerhalb die Introns der Gene, die sie kontrollieren. Cres (dh, Enhancer / Promotoren) bestehen typischerweise aus mehreren gruppierten Bindungsstellen für beide Transkriptionsaktivatoren und Repressoren 1-3. Sie dienen als logische Integratoren von Transkriptions-Eingang gibt eine einheitliche Ausgabe in Form von raumzeitlich präzise und quantitativ exakt Promotoraktivität. Die meisten Studien von Säugetier-cis-Regelung bis dato auf Maus Transgenese als Mittel zur Untersuchung der Enhancer-Funktion von Cres 4-5 verlassen. Diese Technik ist zeitaufwendig, kostenintensiv und wegen der Insertionsstelle Effekte weitgehend nicht quantitativ. Auf der anderen Seite, haben quantitative Tests für Säugetier-CRE-Funktion in Gewebekultur-Systemen (zB Dual-Luciferase-Assays) entwickelt worden, aber die in-vivo-Relevanz dieser Ergebnisse ist oft ungewiss. Die Elektroporation bietet eine hervorragende Alternative zu herkömmlichen Maus Transgenese in dem Sinn, dass sowohl raum-zeitliche und quantitative Bewertung der cis-regulatorische Aktivität in lebenden Säugetiergewebe. Diese Technik ist besonders nützlich bei der Analyse von cis-Regelung in das zentrale Nervensystem, vor allem in der Hirnrinde und der Netzhaut 6-8. Während Maus Netzhaut Elektroporation, sowohl in vivo und ex vivo, entwickelt worden ist und ausgiebig von Matsuda und Cepko 6-7,9 beschrieben, haben wir kürzlich einen einfachen Ansatz, um die Aktivität der Photorezeptor-spezifischen CREs in elektroporiert Maus Netzhaut 10 quantifizieren entwickelt. Da die Menge an DNA, die in der Netzhaut durch Elektroporation eingebracht wird, kann von Experiment zu Experiment variieren, ist es notwendig, eine Zusammenarbeit elektroporiert &quot;loading control &#39;in allen Experimenten sind. In dieser Hinsicht ist die Technik sehr ähnlich wie die Dual-Luciferase-Assay verwendet, um die Promotoraktivität in kultivierten Zellen zu quantifizieren. Wenn Testen Photorezeptor cis-regulatorische Aktivität, ist die Elektroporation in der Regel in neugeborenen Mäusen (postnatalen Tag 0, P0), die zum Zeitpunkt der Spitze Stab Produktion 11-12 wird durchgeführt. Sobald retinalen Zelltypen werden post-mitotischen, ist die Elektroporation viel weniger effizient. Angesichts der hohen Rate der Stange Geburt in neugeborene Mäuse und die Tatsache, dass Stäbe mehr als 70% der Zellen in der adulten Maus Netzhaut bilden, sind die Mehrzahl der Zellen, die bei P0 elektroporiert sind Stäbe. Aus diesem Grund sind Stäbchen-Photorezeptoren der einfachste Netzhaut Zelltyp über Elektroporation zu studieren. Die Technik, die wir hier beschreiben, ist in erster Linie sinnvoll für die Quantifizierung der Aktivität von Photorezeptoren Cres.

Dieses Protokoll beschreibt eine einfache und kostengünstige Möglichkeit, um die Aktivität von cis-regulatorischen Elemente (dh Enhancer / Promotoren) in lebenden Maus Netzhaut via Explantation Elektroporation zu quantifizieren. DNA-Präparation, Netzhaut-Dissektion, die Elektroporation, Netzhaut-Explantat-Kultur, und nach der Fixierung Analyse und Quantifizierung beschrieben.

Die Quantifizierung der Aktivität von Cis-Regulatorische Elemente in der Maus Retina durch Explantation Elektroporation

Transkriptionsfaktoren innerhalb zellulärer Gennetzwerke steuern das räumlich-zeitliche Muster sowie das Expressionsniveau ihrer Zielgene, indem sie an ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, fluoreszierende transkriptionelle Reporter in murinen Netzhautimplantaten mittels Elektroporation zu übertragen und deren Expressionslevel zu quantifizieren. Dies wird erreicht, indem zuerst neugeborenes murines Netzhautgewebe durch Dissektion isoliert wird. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, die Netzhaut mit fluoreszierenden DNA-Reporterkonstrukten zu elektroporieren.Der dritte Schritt des Verfahrens besteht darin, die elektroporierten Netzhäute acht Tage lang als Implantate zu kultivieren. Der letzte Schritt des Verfahrens ist die Gewinnung des retinalen Explantats und die Quantifizierung der Expressionslevel der fluoreszierenden Reporter. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die die relativen Expressionslevel verschiedener Promotor-Reporter-Konstrukte in der sich entwickelnden Mausnetzhaut mittels x-Explant-Elektroporation gefolgt von einer quantitativen Datenanalyse zeigen.Mein Name ist Joe Corbo und ich bin Mitglied der Fakultät der Abteilung für Pathologie und Immunologie an der Medizinischen Fakultät der Washington University in St. Louis. Heute werden wir ein Video-Protokoll präsentieren, das die Technik der X-explan-Elektroporation in neugeborene Mausretinen demonstriert, um die Aktivität von photorezeptorspezifischen CYS-regulatorischen Elementen zu quantifizieren. Dieses Protokoll wird von einer Doktorandin aus meinem Labor, Cindy Montana, vorgeführt. Desinfizieren Sie zunächst die Elektroporationskammer und alle Instrumente mit 70 %igem Ethanol, um die Augensammlung vorzubereiten.Desinfizieren Sie sowohl die Handschuhe als auch die Laboroberfläche mit Ethanol und halten Sie während des gesamten Verfahrens sterile Bedingungen ein. Geben Sie anschließend in einer Zellkulturhaube sechs Milliliter Dissektionsmedium in eine sterile 60-Millimeter-Petri-Schale und jeweils drei Milliliter Medium in zwei sterile 35-Millimeter-Schalen. Zurück an der Laborbank desinfizieren Sie den Kopf und den Hals eines neugeborenen Mäusewelpen mit 70 %igem Ethanol.Nachdem der Kopf mit einer Schere schnell abgetrennt wurde, überführen Sie den Kopf in eine sterile 100-Millimeter-Schale und entfernen mit einer kleinen Schere die Kopfhaut, um die Augen unter einem Stereomikroskop freizulegen. Heben Sie mit einer gebogenen Pinzette vorsichtig das Auge aus der Augenhöhle und legen Sie es in eine 35-Millimeter-Schale, die Dissection.Medium enthält. Sammeln Sie weiterhin Augen, sodass drei bis vier Augen pro Aliquot DNA vorliegen, die elektroporiert werden sollen, und bewahren Sie die Augen sowie das Dissektionsmedium bei Raumtemperatur auf, bis die Sammlung abgeschlossen ist.Desinfizieren Sie sowohl eine Rasierklinge als auch die Verpackung einer sterilen Plastik-Transferpipette mit 70 % Ethanol und schneiden Sie dann mit der Rasierklinge die Spitze der Pipette so weit oben ab, dass ein gesamtes Auge aufgenommen werden kann. Übertragen Sie mithilfe der verbreiterten Pipette ein Auge von der 35-Millimeter-Schale in die 60-Millimeter-Schale unter einem Auflichtmikroskop bei hoher Vergr&ouml;&szlig;erung. Entfernen Sie mit feinen Pinzetten jegliches Gewebe wie Augenmuskeln und Fett vom Augenoberfl&auml;che.Entfernen Sie dann den Sehnerv, indem Sie ihn an der Basis abquetschen. Um die Netzhaut zu isolieren, stechen Sie ein kleines Loch in die Sklera am Limbus; die Sklera und das retinale Pigmentepithel erscheinen glänzend im Vergleich zum Netzhautgewebe, das mattgrau ist. Führen Sie eine Zange von beiden Pinzettenpaaren in das Loch ein und reißen Sie vorsichtig die Sklera und das RPE auf.Stellen Sie sicher, dass die Linse an Ort und Stelle bleibt. Verwenden Sie die erweiterte Pipette, um die präparierte Netzhaut in die zweite 35-Millimeter-Schale mit Medium zu überführen. Sammeln Sie alle Netzhäute und lagern Sie sie in einem Gewebekultur-Inkubator bei 37 Grad Celsius.Bis zur Elektroporation, die in einer Zellkulturfume arbeitet, für jede zu elektroporierende DNA-Eloqua, füllen Sie eine sterile 35-Millimeter-Schale mit Dissektionsmedium und eine zweite Schale mit Kulturmedium. Spülen Sie mit einer P200-Pipette die Kammern in der Elektroporationschale dreimal mit steriler 1×PBS aus. Füllen Sie die Kammern mit den 60-Mikroliter-DNA-Aliquoten und füllen Sie alle ungenutzten Kammern mit jeweils 60 Mikrolitern 1×PBS.Verbinden Sie die Elektroden mit der Elektroporationsplatte und geben Sie die geeigneten Einstellungen am Elektrogerät ein. Greifen Sie die Netzhäute mit feiner Pinzette an der Linse und überführen Sie sie in die Elektroporationskammern. Platzieren Sie bis zu vier Netzhäute in jeder Kammer.Ordnen Sie die Netzhäute so an, dass die Linse gegen den Metallstab gelehnt ist, der an der positiven Elektrode befestigt ist. Wischen Sie die Pinzette nach jeder Kammer ab, um eine Übertragung von DNA von einer Kammer zur nächsten zu vermeiden. Sobald alle Netzhäute ausgerichtet sind, drücken Sie auf Start am Elektrogerät.Winzige Bläschen sollten sich an dem Metallstab bilden, der an der negativen Elektrode befestigt ist. Trennen Sie die Elektroden und schalten Sie das Gerät mit einer Pinzette aus. Bewegen Sie die Netzhäute vorsichtig von den Kammerwänden weg.Überführen Sie die Netzhäute aus den Kammer in die 35-Millimeter-Schalen, die das Dissektionsmedium enthalten. Überführen Sie mithilfe einer sterilen Transferpipette die Netzhäute aus dem Dissektionsmedium in die 35-Millimeter-Schalen, die Kulturmedium enthalten. Beschriften Sie die Vertiefungen einer sterilen sechswelligen Kulturplatte und füllen Sie jede Vertiefung mit drei Milliliter Kulturmedium.Verwenden Sie sterile Pinzette, um runde Watman-Nukleofilter auf der Oberfläche des Mediums in jedem Brunnen schwimmen zu lassen, wobei die glänzende Seite der Filter nach oben zeigt. Mit Hilfe eines Stereomikroskops übertragen Sie eine einzelne Netzhaut mit einer sterilen Transferpipette auf den Filter, wobei die Linsenseite nach unten zeigt. Falls die Netzhaut mit der Linsenseite nach oben landet, saugen Sie sie wieder in die Pipette auf und versuchen Sie es erneut.Legen Sie nicht mehr als vier Netzhäute in jede Vertiefung und halten Sie sie in separaten Tropfen. Sobald die Netzhäute in die Vertiefungen gelegt wurden, bringen Sie die Kulturplatte in einen Gewebekultur-Inkubator bei 37 Grad Celsius und kultivieren Sie sie für die gewünschte Dauer. Üblicherweise nach acht Tagen zeigt sich hier ein erfolgreicher Elektroporationsresultat in der Expression des DNA-Konstrukts über ein Viertel bis ein Drittel der Netzhautoberfläche.Die Fluoreszenzniveaus werden quantifiziert, indem uniform elektroporierte Bereiche, die den CRE-Konstrukt ausdrücken, mit Bereichen außerhalb der Netzhaut verglichen und anschließend auf die Kontroll-Expression von GFP normalisiert werden. Insbesondere Stäbchenphotorezeptoren werden effizient transduziert, wie gezeigt. Hier sind die Ergebnisse einer Elektroporation, bei der zwei auf Stäbchen spezifische Promotoren die Expression von GFP und DS-rot in der äußeren nukleären Schicht steuern.Durch die Überlagerung der beiden Expressionsmuster mit der hier in Blau dargestellten DPI-Färbung wird die photorezeptorspezifische Expression deutlich. Es wird keine Expression in der intermediären Schicht oder in der Ganglienzellschicht beobachtet. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie eine gute Vorstellung davon haben, wie man Elektroden präpariert und Maus-Retina-Explantate kultiviert, um die Aktivität retinaler Zysten-regulatorischer Elemente zu quantifizieren.Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.

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