Name: Quantifizierung der heterogenen Verteilung der synaptischen Protein im Gehirn Maus mit Immunfluoreszenz (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: Erfahren Sie eine quantitative Methode zur Analyse synaptischer Proteinverteilungen im Mausgehirn mittels Immunfluoreszenz und konfokaler Mikroskopie. Das Verfahren nutzt Fluoreszenzverhältnisse statt absoluter Werte und ermöglicht so zuverlässige Aussagen über räumliche Heterogenität in verschiedenen Hirnregionen.

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Wir danken Irmgard Weiss für ausgezeichnete technische Unterstützung. Die Autoren erkennen Unterstützung durch Hermes Pofantis und Andoniya Petkova. Die Autoren danken auch das European Neuroscience Institute für die Nutzung der LSM800 und technische Hilfe, vor allem von Dr. Nils Halbsgut. Diese Arbeit wurde von der University Medical Center Göttingen finanziert. JSV erkennt Unterstützung durch die Mitte für Nanoscale Mikroskopie und molekulare Physiologie des Gehirns (CNMPB).

Dieses Protokoll beinhaltet keine Experimente an lebenden Tieren. Experimente mit von Tieren Gehirn Proben erhalten euthanizing stimmten mit den lokalen Tierschutz Behörden (Tierschutzkommission der Universitätsmedizin Göttingen) unter der Zulassungsnummer T 10/30.
Hinweis: Für dieses Protokoll wurden 3 Erwachsene männlichen C57BL/6 Mäusen verwendet.
1. die Probenvorbereitung
<ol><li>Bereiten Sie Fixiermittel und 0,1 M Phosphatpuffer (PB; siehe Tabelle 1).</li>
	<li>Befestigen Sie das Tier durch Transcardial Perfusion, wie Gage Et Al. beschrieben 28. Waschen Sie zuerst das Blut mit 0,9 % NaCl-Lösung, dann mit 30 mL 4 % Paraformaldehyd (PFA) durchspülen.</li>
	<li>Den Schädel mit einer Schere öffnen und das Gehirn mit einem Löffel mit stumpfen Kanten zu beschädigen das Gewebe vorsichtig zu isolieren.</li>
	<li>Füllen Sie eine 50 mL Reaktionsgefäß mit Fixativ und postfix das Gehirn bei 4 % PFA bei 4 ° C über Nacht.</li>
	<li>Entfernen Sie das Fixiermittel zu und waschen Sie das Gehirn in 50 mL 0,1 M PB auf einem Boston-Shaker für 30 min.</li>
	<li>Nach dem Waschen inkubieren Sie das Gehirn in ein 50 mL Reaktionsgefäß in 30 % Saccharose in 0,1 M PB für 48 h oder bis es in der Röhre bei 4 ° C für Cryoprotection sinkt.</li>
	<li>Das Cryoprotected Gehirn mit einer scharfen Klinge trimmen, legen Sie sie in ein Cryomold und Binde sie mit optimalen Arbeitstemperatur (OCT) Verbindung. Vermeiden Sie Luftblasen. Richten Sie das Gehirn und frieren Sie die Cryomold in den-80 ° C Gefrierschrank ein.</li>
	<li>Montieren Sie das gefrorene Gewebe für schneiden. Equilibrate das Gewebe auf die Cryomicrotome Temperatur für mindestens 15 Minuten vor dem Schneiden.</li>
	<li>Abschnitt des Gehirns in 25 µm Dicke koronalen Scheiben. Berühren Sie das Office-Anpassungstool sorgfältig mit einem Glas Haken ohne das Hirngewebe zu berühren. 3 angrenzende Scheiben pro Bohrloch in einer 24-well-Platte zu sammeln und aufbewahren in 0,1 M PB bei 4 ° C bis Färbung. Hinweis: Das Protokoll kann hier bis zu zwei Wochen lang angehalten werden. Längere Lagerzeiten können die Gewebe-Qualität beeinträchtigen und somit Einfluss auf den Ausgang des Experiments.</li>
</ol>(2) Immunfluoreszenz
<ol><li>Bereiten Sie Lösungen einschließlich der blockierenden Puffer, Antikörper Puffer, Wasch-Puffer 1 und waschen Puffer 2 (siehe Tabelle 1).</li>
	<li>Spülen Sie Scheiben einmal mit PB, überschüssige OCT zu entfernen.<ol>
<li>Entfernen Sie die Lösung mit einer Pipette aus Kunststoff, ohne in den Gehirnscheiben saugen. Fügen Sie 250 µL frische PB mit einer 1000 µL Pipette. Achtung: Scheiben sollte nicht austrocknen, also entfernen und Hinzufügen von Flüssigkeiten gut durch Brunnen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Entfernen Sie den PB mit einer Kunststoff-Pipette und 250 µL blocking-Puffer pro Bohrloch mit einer 1000 µL Pipette. 3 h bei Raumtemperatur (RT) auf den Shaker inkubieren.</li>
	<li>Während der Inkubationszeit verdünnen Sie die primären Antikörper Antikörper Puffer in einem Reaktionsgefäß. Verwenden Sie 250 µL Antikörper Puffer pro Bohrloch und fügen Sie die entsprechende Menge des Antikörpers (siehe Tabelle 2) durch direkt in die Lösung mit einer 2 µL Pipette pipettieren. Mischen Sie die Lösung, indem Sie sanft nach oben und unten mehrmals pipettieren. Vortex kurz danach um die richtige Mischung zu gewährleisten. Hinweis: Um die Hintergrundfluoreszenz zu bestimmen, sollten Verfärbungen auch durchgeführt werden ohne Zugabe von den primären Antikörper. Dafür inkubieren Sie die Scheibe in Antikörperlösung ohne primäre Antikörper nach dem Protokoll.</li>
	<li>Entfernen Sie nach der Inkubationszeit den blockierenden Puffer mit einer Pipette aus Kunststoff zu und fügen Sie 250 µL Antikörperlösung mit primären Antikörper pro Bohrloch. Inkubieren Sie Scheiben mit primären Antikörper über Nacht bei 4 ° C in einen Shaker geben.</li>
	<li>Am nächsten Tag waschen Sie die Scheiben mit Waschpuffer 1 3 X für 10 min bei RT in einen Shaker geben.<ol>
<li>Entfernen Sie das Medium mit einer Kunststoff-Pipette und fügen Sie 300 µL Waschpuffer 1 pro Bohrloch. 10 min. Wiederholen Sie 3-Mal bei RT inkubieren.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Während die Waschschritte Verdünnen der Fluorophor-gekoppelten Sekundärantikörper in Antikörper-Puffer in einem Reaktionsgefäß. Verwenden Sie 250 µL Antikörper Puffer pro Bohrloch und fügen Sie die entsprechende Menge des Antikörpers (siehe Tabelle 2) durch direkt in die Lösung mit einer 2 µL Pipette pipettieren. Mischen Sie die Lösung, indem Sie sanft nach oben und unten mehrmals pipettieren. Vortex kurz danach um die richtige Mischung zu gewährleisten. Achtung: Da die Antikörper lichtempfindlich sind, müssen alle Schritte von diesem Zeitpunkt an im Dunkeln durchgeführt werden.</li>
	<li>Nach der Waschschritte, entfernen Sie das Waschen Puffer mit einer Pipette aus Kunststoff und fügen Sie 250 µL Antikörperlösung mit Sekundärantikörper pro Bohrloch. Inkubieren Sie die Scheiben mit Sekundärantikörper für 90 min bei RT in der Dunkelheit.</li>
	<li>Waschen Sie die Scheiben mit Waschpuffer 2 3 X für 10 min bei RT</li>
	<li>Während die Waschschritte verdünnen Sie 4 ', 6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) in 0,1 M PB in einer Konzentration von 1: 2000.</li>
	<li>Entfernen Sie waschen-Puffer 2 mit einer Pipette aus Kunststoff zu und fügen Sie 250 µL DAPI-Lösung pro Bohrloch. 5 min bei RT auf den Shaker inkubieren.</li>
	<li>Entfernen Sie die DAPI-Lösung mit einer Pipette aus Kunststoff und fügen Sie 500 µL 0.1 M PB pro Bohrloch mit einer 1000 µL Pipette.</li>
	<li>Montieren Sie Scheiben auf Objektträger.<ol>
<li>Legen Sie einen Objektträger unter das Stereoskop. Tropfen Sie mit einem feinen Pinsel drei separate 0,1 M PB auf der Folie. Legen Sie eine Scheibe pro Tropfen auf dem Objektträger.</li>
		<li>Verwenden Sie die feinen Pinsel zu glätten und die Scheiben auf den Objektträger zu orientieren.</li>
		<li>Wenn alle Scheiben richtig positioniert sind, überschüssige PB mit einem Tuch entfernen und die Folie vorsichtig abtrocknen. Achtung: Vermeiden Sie die Gehirnscheiben vollständig trocknen.</li>
		<li>Fügen Sie 80 µL Medium auf der Folie einbetten. Setzen Sie vorsichtig das Deckglas auf der Folie, dadurch die Gehirnscheiben einbetten.</li>
		<li>Die Folien in der Dunstabzugshaube für 1-2 Std. trocknen lassen (decken, um Lichteinfall zu vermeiden) und speichern sie in einer Mikroskop-Folie-Box bei 4 ° C. Hinweis: Das Protokoll kann hier angehalten werden.</li>
	</ol>
</li>
</ol>(3) Bildgebung
<ol><li>Nachdem das einbettende Medium vollständig ausgehärtet ist, legen Sie Objektträger unter confocal Mikroskop. Hinweis: Epifluoreszenz Mikroskopie in Kombination mit Dekonvolution Software sollten ähnliche Bildqualität liefern.</li>
	<li>Einstellungen Sie die Laser-durch erhöhen oder verringern die Laserstärke für jeden Kanal, so dass einige Pixel überbelichtet sind, um maximale Verteilung der Grauwerte zu gewährleisten.</li>
	<li>Virtuelle Gewebe des gesamten Gehirns Slice für die verschiedenen Kanäle zu erwerben.<ol>
<li>In der imaging-Software (siehe Tabelle der Materialien), wählen Sie die Fliesen und die Gehirn-Scheibe mit der Fliese Region Setupmanuell abzugrenzen.</li>
		<li>Verteilen Sie Stützpunkte in der gesamten Region Fliese und stellen Sie den Fokus für die verschiedenen Stützpunkte durch drücken Bestätigen Fliese Regionen/Positionen...
</li>
		<li>Passen Sie die Einstellungen im Akquisitionsmodus entsprechend die gewünschte Auflösung und Größe des resultierenden Bildes und starten Sie den Scanvorgang.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Wenn der Scan abgeschlossen ist, verwenden Sie die Stitching -Funktion um das virtuelle Gewebe verarbeiten. Exportieren Sie die Datei als TIF mit der Funktion Bild exportieren.</li>
</ol>(4) Computer-basierte Analyse
<ol><li>Laden Sie alle einzelne Kanäle für ein Bild in Fidschi29 , indem Datei | Offene.</li>
	<li>Beschreiben Sie mit dem Freihand-Auswahl -Werkzeug eine Hemisphäre im DAPI-Kanal. Erstellen Sie eine Maske der Auswahl durch Klicken auf Bearbeiten | Auswahl | Maske erstellen.</li>
	<li>Bestimmen der mittleren Fluoreszenzintensität für die einzelnen Kanäle (Mover und Synaptophysin) indem Sie auf analysieren | Maßnahme. Hinweis: Sollten Sie die verschiedenen Kanäle zur Bestimmung der mittleren Fluoreszenz Intensitätswerte für jeden Kanal auswählen.</li>
	<li>Kopieren Sie die mittlere Fluoreszenzintensität für die einzelnen Kanäle in ein Arbeitsblatt.</li>
	<li>Bestimmen Sie die mittlere Fluoreszenzintensität für die einzelnen Kanäle auf einer Fläche von Interesse durch Abgrenzung der Gegend auch mit dem Freihand-Auswahl -Werkzeug. Verwenden Sie einen Maus-Gehirn-Atlas als Referenz.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Schritte 4.1-4.5 für alle Hemisphären und alle Bereiche von Interesse. Hinweis: Bestimmen die Werte für jede Hemisphäre separat, um später die Werte in einem Bereich von Interesse, dass in der Hemisphäre vergleichen (siehe Punkt 5.2).</li>
</ol>5. Datenverarbeitung
<ol><li>Für den Fall, dass die Hintergrundfluoreszenz hoch ist (siehe Diskussion), ein Hintergrundabzug kann erforderlich sein. Für das Bestimmen der mittleren Fluoreszenzintensität für den Slice verarbeitet ohne primären Antikörper gegen des Referenzproteins (hier: Synaptophysin) und subtrahieren Sie diesen Wert aus allen Werten für die Gehirnregionen und Hemisphären.</li>
	<li>Wenn die mittlere Fluoreszenz-Intensitäten für die einzelnen Kanäle für jede Hemisphäre und jedes Interessengebiet bestimmt wurden (siehe Tabelle 3), das Verhältnis von Mover zu Synaptophysin durch Dividieren den Wert für Mover durch den Wert für Synaptophysin (berechnen gelb in Tabelle 3). Führen Sie diese Aktion für jede Hemisphäre und jedes Interessengebiet getrennt.</li>
	<li>Teilen Sie das Verhältnis für ein Interessengebiet erhalten durch das Verhältnis für die entsprechenden Hemisphäre (Orange in Tabelle 3) erreicht wird, um das Verhältnis des Bereichs des Interesses an der Hemisphäre zu bestimmen.</li>
	<li>Um festzustellen, die relative Häufigkeit der Mover, übersetzen Sie das Verhältnis erwarb 5.2 in einen Prozentsatz durch die Bestimmung der Abweichung von 1 (rot in Tabelle 3). Ein Verhältnis von 1,25 würde daher eine relative Mover Fülle von 25 % über dem Durchschnitt, und ein Verhältnis von 0,75 würde ergeben eine relative Mover Fülle von 25 % unter dem Durchschnitt.</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Hier präsentiert die Methode zielt darauf ab die Verteilung eines Proteins des Interesses im Verhältnis zu der Fülle von einem Marker Protein mit einer bekannten Verteilung zu quantifizieren. Immunfluoreszenz-Färbung zeigen eine hohe Variabilität der Färbung Intensitäten zwischen verschiedenen Scheiben. Die Quantifizierung der hier beschriebene Ansatz umgeht dieses Problem durch das Verhältnis des Proteins des Interesses an den Durchschnitt in der Hemisphäre zu bestimmen. Daher verschiedenen befleckenden Intensitäten übe...

Kommunikation zwischen den Nervenzellen geschieht an speziellen Kontaktstellen, die Synapsen genannt. Synapsen enthalten eine Vielzahl von verschiedenen Proteinen, die synaptische Übertragung zu orchestrieren. Einige dieser Proteine zeigen eine heterogene Verteilung im gesamten Nervensystem und sind nicht in jeder Synapse-1. Ein Beispiel für solche ein Protein ist Munc13, die Grundierung der synaptischen Vesikel beteiligt ist. Es gibt verschiedene Isoformen von Munc13, die das Gehirn2heterogen verteilt sind, und das Vorhandensein oder Fehlen von bestimmten Isoformen beeinflussen kann kurzfristige synaptische Plastizität und synaptischen Vesikel Dynamik3, 4 , 5. Daher ist es von entscheidender Bedeutung für das Vorhandensein von verschiedenen synaptischen Proteine in Hirnregionen identifizieren zu können.
Die Methoden der Wahl für die Quantifizierung der synaptischen Proteine - bis jetzt - sind Massenspektrometrie und Western Blot, anstatt Immunohistochemistry6,7,8,9. In einigen Fällen sind verschiedene Methoden zur Bewertung der Menge und die Lokalisierung von bestimmten Proteinen (d.h., Wilhelm Et Al. ergänzen 10). die Methode wir hier beschreiben ermöglicht die Lokalisierung und Quantifizierung von Proteinen ohne die Notwendigkeit der Verwendung biochemische Methode, einfach nur immunofluorescent Färbungen. Ein weiterer Vorteil hier ist, dass die Quantifizierung, über Flächen, die viel kleiner möglich ist und daher genauer als die durch andere Methoden erreicht. Man muss jedoch berücksichtigen, dass eine verlässliche Referenz-Protein benötigt wird, um die Verteilung des Proteins des Interesses zu beurteilen.
Fluoreszierende Färbung von Immunohistochemistry ermöglicht es uns, die routinemäßig die Lokalisierung der Proteine über Hirnareale sowie in verschiedenen neuronalen Kompartimenten identifizieren. Um die verschiedenen Fächer zu identifizieren, werden spezifische Marker verwendet. Antikörper gegen Wirbeltiere und Synaptophysin11 ist in der Regel lässt sich die synaptischen Vesikel zu kennzeichnen, während Antikörper gegen Fagott die aktive Zone einer präsynaptischen terminal12beschriften. Vesikuläre Transporter, z. B. die vesikuläre Glutamat-Transporter (vGluT) oder vesikuläre GABA-Transporter (vGAT), werden verwendet, um exzitatorischen13 und hemmenden14 präsynaptischen Klemmen bzw. beschriften. Auf der postsynaptischen Seite können Antikörper gegen das Protein Homer eingesetzt werden anlässlich der postsynaptischen Terminals und Antikörper gegen postsynaptischen Dichte Protein 95 (PSD95)15,16,17 oder Gephyrin18 , 19 , 20 können erregenden oder hemmenden postsynaptischen Terminals bzw. beschriften. Mithilfe von Antikörpern gegen ein Protein des Interesses und Markierungen wie oben beschrieben, kann man feststellen, die Lokalisierung von solchen Protein. Viele Studien bisher haben dies in einer qualitativen Weise21durchgeführt. Jedoch muss um die differenzierte Verteilung der ein bestimmtes synaptischen Protein zuverlässig zu bestimmen, nicht nur seine Anwesenheit oder Abwesenheit, sondern auch die relative Konzentration festgestellt werden. Die Heterogenität der Größe und Dichte der Synapsen ist es wichtig, ein Verhältnis zwischen dem synaptischen Marker und das Protein des Interesses zu etablieren. Andernfalls werden Synapse-reiche Regionen wie die nicht-pyramidale Schichten des Hippocampus und der molekularen Schicht des Kleinhirns zeigen eine hohe Dichte an synaptischen Proteine, nur aufgrund der höheren Dichte der Synapsen aber nicht aufgrund einer starken Präsenz von diesem Protein in Jede Synapse (z.B. Wallrafen und Dresbach1). Auf der anderen Seite zeigen Proteine in die neuronale Soma (z.B., TGN3822) in der Regel starken Präsenz im Hippokampus pyramidale Zellschicht oder hippocampal oder zerebelläre Granulat Zellschicht aufgrund der hohen Konzentration von neuronalen Zellkörpern in diesen Bereichen. Daher diese nicht-homogene Verteilung der Strukturen, in diesem Fall Synapsen, kann auf eine falsche Einschätzung der Verteilung des Proteins des Interesses selbst führen. Darüber hinaus gibt es eine intrinsische Veränderlichkeit in der Färbung Intensitäten über Proben in immunhistochemischen Färbungen. Das hier beschriebene Protokoll berücksichtigt dies und vermeidet solche Vorurteile, wie auch andere Einschränkungen, die durch immunhistochemischen Methoden entstehen.
In unserer letzten studieren, haben wir diese Methode um zu beschreiben, die differentielle Expression der Mover (auch genannt TPRGL23 SVAP3024) über 16 verschiedene Gehirn Bereiche1verwendet. Mover ist ein Wirbeltier-spezifischen synaptischen Protein, finden Sie im Verein zu synaptischen Vesikel und beeinflusst die Neurotransmitter-Freisetzung25,26,27. Wir haben den Mover-Ausdruck auf die Fülle der synaptischen Vesikel verwandt, durch Färbung für Synaptophysin als synaptischen Vesikel Referenz Marker. Hohes Maß an Mover fanden wir vor allem in der septal Kerne, die ventrale Troponema und der Amygdala. Im Hippocampus fanden wir eine heterogene Verteilung der Mover, mit einem hohen in den Schichten Intra-hippocampal Berechnung und niedrigen Niveau in Eingang und Ausgang Schichten zugeordnet.

<table><tbody><tr><td>1,5 mL Reaktionsgefäße</td><td>Eppendorf</td><td>30120094</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Reaktionsgefäße</td><td>Greiner Bio-One</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>Multiwell 24 Well</td><td>Fisher Scientific</td><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 087721H</td><td></td></tr><tr><td>Kunststoffpipette (Einweg)</td><td>Sarstedt</td><td>861,176</td><td></td></tr><tr><td>1000 mL Pipette</td><td>Rainin</td><td>&nbsp; </td><td></td>17014382</tr><tr><td>2 ml Pipette</td><td>Eppendorf</td><td>3123000012</td><td></td></tr><tr><td>Vortex Genius 3&nbsp;</td><td>IKA</td><td>3340001</td><td></td></tr><tr><td>Menzel Objektträger</td><td>Fisher Scientific</td><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 10144633CF</td><td></td></tr><tr><td>Stereoskop</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LSM800</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Konfokalmikroskop</td></tr><tr><td>Einfriermikrotom</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS (10X)</td><td>Roche</td><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; </td><td></td>11666789001</tr><tr><td>PFA</td><td>Sigma</td><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; P6148-1kg</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>BioFroxx</td><td>1394KG001</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>neoFroxx</td><td>1104KG001</td><td></td></tr><tr><td>Gewebe Tek</td><td>Sakura &nbsp;</td><td>4583</td><td>OCT</td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>BioFroxx</td><td>5155KG001</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Merck</td><td>1,063,460,500</td><td></td></tr><tr><td>normales Ziegenserum</td><td>Merck Millipore</td><td>S26-100ML</td><td></td></tr><tr><td>normales Eselserum</td><td>Merck</td><td>S30-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Merck</td><td>1,086,031,000</td><td></td></tr><tr><td>Kaninchen Anti-Mover</td><td>Synaptic Systems</td><td>RRID: AB_10804285</td><td></td></tr><tr><td>Meerschweinchen Anti-Synaptophysin Synaptische</td><td>Systeme</td><td>RRID: AB_1210382</td><td></td></tr><tr><td>Esel Anti-Kaninchen AF647</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>RRID: AB_2492288</td><td></td></tr><tr><td>Ziege Anti-Maus AF488</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>RRID: AB_2337438</td><td></td></tr><tr><td>Mowiol4-88</td><td>Calbiochem</td><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; </td><td></td>475904</tr><tr><td>ZEN2 blue Software</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Mikroskopie-Software</td></tr><tr><td>FIJI</td><td>ImageJ</td><td></td><td>Analysesoftware</td></tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

quantifizierung der heterogenen verteilung der synaptischen protein im gehirn maus mit immunfluoreszenz

Quantifying the Heterogeneous Distribution of a Synaptic Protein in the Mouse Brain Using Immunofluorescence

Die Anwesenheit, Abwesenheit oder Ebenen der spezifischen synaptischen Proteine können synaptische Übertragung stark beeinflussen. Neben der Erläuterung der Funktion eines Proteins, ist es wichtig, auch die Verteilung bestimmen. Hier beschreiben wir ein Protokoll mit Immunfluoreszenz, konfokale Mikroskopie und Computer-basierte Analyse zur Bestimmung der Verteilung der synaptischen Protein Mover (auch TPRGL oder SVAP30 genannt). Wir vergleichen die Verteilung der Mover mit derjenigen der synaptischen Vesikel Protein Synaptophysin, wodurch Bestimmung der Verteilung der Mover in einer quantitativen Weise im Verhältnis zu der Fülle der synaptischen Vesikel. Insbesondere könnte möglicherweise diese Methode implementiert werden, um Vergleich der Verteilung von Proteinen mit verschiedenen Antikörpern oder Mikroskope oder über verschiedene Studien zu ermöglichen. Unsere Methode umgeht die inhärente Variabilität der immunofluorescent Verfärbungen durch nachgeben ein Verhältnis eher als absolute Fluoreszenz Ebenen. Darüber hinaus ermöglicht die Methode, die wir beschreiben die Forscher die Verteilung eines Proteins auf verschiedenen Ebenen zu analysieren: aus ganzen Gehirnscheiben in Gehirnregionen zu verschiedenen Teilregionen in einem Hirnareal, wie die verschiedenen Schichten des Hippocampus oder sensorische Cortex. Mover ist ein Wirbeltier-spezifische Protein, das synaptischen Vesikel zugeordnet ist. Mit dieser Methode zeigen wir, dass Mover Hirnareale mit hohem in der ventralen Troponema, septal Kerne und die Amygdala, und auch innerhalb einzelner Hirnareale, wie die verschiedenen Schichten des Hippocampus heterogen verteilt ist.

Vertreter, die Muster der verschiedenen Markern Färbung ist in Abbildung 1ersichtlich. Das Muster ist abhängig von der Verteilung des Proteins. Beispiele für fünf Rostro-caudale Ebenen sind in Spalten (A)-(E). Eine repräsentative DAPI-Färbung zeigt sich in der ersten Reihe: DAPI hält sich an die DNA einer Zelle und somit Kerne gefärbt sind. Daraus resultiert eine punktförmige Muster. Regionen mit einer hohen Zelldichte sind h...

Hier beschreiben wir einen quantitativen Ansatz zur Bestimmung der Verteilung der synaptischen Protein im Verhältnis zu einer Marker Protein mit Immunfluoreszenz-Färbung, konfokalen Mikroskopie und Computer-basierte Analyse.

Quantifizierung der heterogenen Verteilung der synaptischen Protein im Gehirn Maus mit Immunfluoreszenz

The presence, absence, or levels of specific synaptic proteins can severely influence synaptic transmission. In addition to elucidating the function of a ...

Hier beschreiben wir ein Protokoll, das Immunfluoreszenz, konfokale Mikroskopie und computergestützte Analysen verwendet, um die Verteilung von synaptischem Protein relativ zu einem Referenzprotein zu bestimmen. Unsere Methode umgeht die inhärente Variabilität von Immunfluoreszenzfärbungen, indem sie ein Verhältnis anstelle von absoluten Fluoreszenzspiegeln verwendet. Zusätzlich können Sie mit dieser Methode die Heterogenität der Proteinverteilung auf verschiedenen Ebenen analysieren.Von ganzen Hirnscheiben über Hirnregionen bis hin zu sogar Subregionen wie den verschiedenen Schichten des Hippocampus. Diese Technik kann angepasst werden, um die Proteinverteilung in anderen Geweben als dem Gehirn und anderen Modellsystemen als Mäusen zu bestimmen. Beginnen Sie mit dem Waschen zuvor isoliertund fixiert Maus Gehirn, wie in der Handschrift beschrieben.Dann übertragen Sie das Gehirn auf ein 15 Milliliter Reaktionsrohr mit 30%Saccharose 0,1 Molar PB. Um Kryo schützen das Gehirn inkubieren es bei 4 Grad Celsius für 48 Stunden oder bis es sinkt. Danach verwenden Sie eine scharfe Klinge, um das kryogeschützte Gehirn je nach Interessenbereich zu trimmen. Dann legen Sie das Gehirn in eine Kryoform und fügen Sie optimale Schnitttemperatur Compound, um es zu verankern, um sicherzustellen, Blasen zu vermeiden und das Gehirn richtig zu orientieren, um eine koronare Ebene des Schneidens zu haben.Legen Sie die Kryoform in den minus 80 Grad Celsius Gefrierschrank, bis sie fest gefroren ist. Montieren Sie das gefrorene Gewebe auf dem Kryomikrotom und warten Sie mindestens 15 Minuten, bevor Sie es auf die Mikrotome-Temperatur ausdematrieren. Beginnen Sie, das Gehirn in 25 Mikrometer dicke koronale Scheiben zu schneiden.Verwenden Sie einen Glashaken an das OCT der ersten Scheibe sorgfältig, ohne das Gehirngewebe zu berühren. Das OCT klebt am Glashaken. Verwenden Sie den Glashaken, um die Gehirnscheibe in den ersten Brunnen zu übertragen.Sammeln Sie drei benachbarte Scheiben pro Brunnen in einer 24 Brunnenplatte gefüllt mit 0,1 Mol PB. Die Scheiben bei vier Grad Celsius bis zur Färbung bis zu zwei Wochen aufbewahren. Um die Scheiben für die Immunfärbung vorzubereiten, verwenden Sie eine Kunststoffpipette, um die PB-Lösung aus einem Brunnen zu entfernen, ohne in die Gehirnscheiben zu ziehen. Verwenden Sie dann eine 1000 Mikroliter Pipette, um 250 Mikroliter frisches PB hinzuzufügen, um sie von überschüssigem OCT zu waschen.Wiederholen Sie diese Wäsche für jeden Brunnen zu der Zeit, um das Austrocknen der Scheiben zu vermeiden. Verwenden Sie dann eine Kunststoffpipetten, um die PB-Lösung aus dem ersten Brunnen zu entfernen. Verwenden Sie eine 1000 Mikroliter Pipette, um 250 Mikroliter Sperrpuffer pro Brunnen wieder gut funktionieren.Inkubieren Sie die Platte bei Raumtemperatur auf einem Shaker für drei Stunden. Während der Inkubation 250 Mikroliter Antikörperpuffer pro Brunnen in ein Reaktionsrohr geben. Verwenden Sie dann eine 2-Mikroliter-Pipette, um die entsprechende Menge an Antikörpern, die sie direkt in die Lösung einfügt, und lassen Sie sie mehrmals vorsichtig nach oben und unten, um sie zu mischen.Dann wirbeln sie diesen verdünnten Antikörper zu einer unsicheren richtigen Mischung. Gut arbeiten, indem sie den Sperrpuffer mit einer Kunststoffpipette gut entfernen und 250 Mikroliter Primärantikörperlösung pro Brunnen hinzufügen. Inkubieren Sie die Platte auf einem Shaker bei vier Grad Celsius über Nacht.Am nächsten Tag entfernen Sie die Antikörperlösung mit einer Kunststoffpipette. Waschen Sie die Scheiben mit 300 Mikroliter Waschpuffer eins pro Brunnen drei mal zehn Minuten jeweils auf einem Shaker bei Raumtemperatur waschen. Während des Waschens, arbeiten im Dunkeln, verdünnen Sie den Fluor für ein paar Sekunden Antikörper in einem Reaktionsrohr in der gleichen Weise wie zuvor mit dem primären Antikörper getan.Nach dem Waschen den Waschpuffer mit einer Kunststoffpipte entfernen und 250 Mikroliter Sekundärantikörperlösung pro Brunnen hinzufügen. Inkubieren Sie im Dunkeln bei Raumtemperatur für 90 Minuten. Nach der inkubationszeit ende Zeit entfernen Sie die Antikörperlösung mit einer Kunststoffpipette.Waschen Sie die Abschnitte dreimal mit Waschpuffer zwei auf die gleiche Weise wie mit Waschpuffer eins. Während dieser Wäsche dAPI Fleck in 0,1 Molaren PB verdünnen, um eine Eins bis 2000 Konzentration zu erreichen. Nach dem Entfernen des Waschpuffers von der Platte 250 Mikroliter DAPI-Lösung hinzufügen und bei Raumtemperatur auf dem Shaker für 5 Minuten inkubieren.Nach dem Entfernen der DAPI-Lösung mit einer Kunststoffpipette verwenden Sie eine 1000 Mikroliter Pipette, um 500 Mikroliter 0,1 Mol PB pro Brunnen hinzuzufügen. Platzieren Sie ein Mikroskopdia unter einem Stereoskop. Verwenden Sie eine feine Bürste, um drei separate Tropfen von 0,1 Molaren PB auf die Folie hinzuzufügen.Platzieren Sie mit dem Pinsel eine Scheibe pro Tropfen auf der Folie, und glätten Sie dann die Scheiben und richten Sie sie aus. Nachdem alle Scheiben richtig positioniert sind, verwenden Sie ein Papiergewebe, um überschüssigeS PB zu entfernen und sorgfältig zu trocknen, ohne die Scheiben vollständig zu trocknen. Dann fügen Sie 80 Mikroliter Einbettmedium auf die Folie und bedecken Sie es sorgfältig mit einem Abdeckungsschlupf, um die Gehirnscheiben einzubetten.Bedecken Sie die Dias, um Lichteinwirkung zu vermeiden, und lassen Sie sie ein bis zwei Stunden in der Dunstabzugshaube trocknen und lagern Sie sie dann in einer Mikroskop-Diabox bei vier Grad Celsius, bis sie für die konfokale Mikroskopie bereit sind. Nach dem Erwerb virtueller Gewebe des gesamten Gehirns Slice für verschiedene Kanäle, wie im Manuskript beschrieben laden Sie alle einzelnen Kanäle oder ein Bild in FIJI durch Klicken auf Datei und dann öffnen. Verwenden Sie dann das Werkzeug zur freien Handauswahl, um eine Hemisphäre im DAPI-Kanal zu ableiten.Klicken Sie auf Bearbeiten, dann auswahl, und erstellen Sie dann eine Maske, um eine Maske des ausgewählten Bereichs zu erstellen. Klicken Sie dann auf Analysieren und messen Sie dann Partikel, um die mittlere Fluoreszenzintensität für einzelne Kanäle zu bestimmen. Achten Sie darauf, einzelne Kanäle auszuwählen, um die mittleren Fluoreszenzintensitätswerte für jeden Kanal zu bestimmen.Danach kopieren Sie die mittlere Fluoreszenzintensität für die einzelnen Kanäle in eine Kalkulationstabelle. Um die mittlere Fluoreszenzintensität für die einzelnen Kanäle in einem Interessenbereich zu bestimmen, wird der Bereich mit dem Freihandauswahlwerkzeug abgrenzt. Nach der Färbung mit DAPI, die Kerne Gehirnabschnitte flecken haben ein Punktiat-Muster und Regionen mit hoher Zelldichte sind heller als Regionen mit geringer Zelldichte.Die Färbung mit Mover-Antikörpern zeigte eine heterogene Verteilung mit hellen Hot-Spot-Bereichen und Dimmerbereichen im gesamten Gehirn, wo synaptophysin eine homogenere Verteilung offenbarte. Eine Überlagerung von Bildern zeigte die differenzierte Verteilung der roten Fluoreszenz, die auf Mover-Protein hindeutet, verglichen mit grüner Fluoreszenz, die Synaptophysin anzeigt. Nach der Quantifizierungsanalyse wurden mittlere Fluoreszenzintensitätswerte für verschiedene Kanäle über die Hemisphären und über die Interessengebiete sowohl für Mover als auch für Synaptophysin ermittelt.Die Verhältnisse der Moverfluoreszenzwerte zu synaptophysin fluoreszenzwerten zeigen die heterogene Verteilung von Mover mit Bereichen mit hohen und niedrigen Mover-Spiegeln im Vergleich zu Synaptischen Vesikeln. Relative Mover Fülle das Verhältnis in einem Bereich von Interesse im Vergleich zu dem über die Hemisphäre und in einem Prozentsatz übersetzt zeigte, wie viel Mover in einem Bereich von Interesse im Verhältnis zum Durchschnitt vorhanden ist. Relative Mover Fülle wurde für verschiedene Schichten in den Unterfeldern des Hippocampus bestimmt.Die drei Interessengebiete werden quantifiziert, indem das Verhältnis in den jeweiligen Schichten mit dem Verhältnis der entsprechenden Hemisphäre verglichen wird. Dieses Verfahren kann einfach angepasst und mit verschiedenen bildgebenden Verfahren wie der Superauflösungsmikroskopie kombiniert werden, um zusätzlich die subzelluläre Verteilung des proteins von Interesse zu bestimmen. Diese Technik kann auch auf verschiedene Modellsysteme wie gentechnisch veränderte oder mit Drogen behandelte Tiere angewendet werden.Dies kann einen vergleichenden Ansatz über verschiedene Versuchsbedingungen oder sogar Arten hinweg ermöglichen.

quantifying-heterogeneous-distribution-synaptic-protein-mouse-brain

Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

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