Micro-Mechanische Charakterisierung von Lungengewebe mit Atomic Force Microscopy

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, die lokale mechanische Umgebung des Lungenparenchyms auf einer räumlichen Skala zu charakterisieren, die für residente Zellen relevant ist, indem die lokalen elastischen Eigenschaften von frischem, spiegelndem Lungengewebe mittels Rasterkraftmikroskopie und Mikroindentation direkt gemessen werden. Dies wird erreicht, indem das mit Agarro aufgeblähte Lungengewebe der Maus mit einem Rasiermesser oder einer Skalpellklinge geschnitten wird, um Lungenparenchymstreifen von fünf mal fünf Millimetern Länge und Breite und 400 Mikrometern Dicke herzustellen. Als nächstes werden unfixierte Lungengewebestreifen mit Immunfärbung behandelt, die interessante Bereiche für eine FM-Mikroindentation identifizieren.

Anschließend wird eine FM-Mikroindentation an Gewebestreifen in PBS bei Raumtemperatur durchgeführt. Um die lokalen elastischen Eigenschaften des frischen Lungengewebes direkt zu messen, werden Ergebnisse erhalten. Diese zeigen auffällige Unterschiede im Bereich und in der Verteilung der Gewebesteifigkeit im normalen und fibrotischen Lungenparenchym und große räumliche Unterschiede in der Steifigkeit, insbesondere innerhalb der fibrotischen Lungenprobe.

Basierend auf Steifigkeitskarten, die aus erzwungenen Verschiebungskurven extrahiert wurden, die mit einer FM-Mikroeindrückung erhalten wurden. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Messungen wie der Gewebestreifendehnung besteht darin, dass sie eine beispiellose räumliche Auflösung bietet und eine einzigartige Perspektive auf die mikroskalige Variation der Gewebesteifigkeit bietet. Dieses Maß kann helfen, wichtige Fragen zu beantworten, z. B. wie die Steifigkeit innerhalb des Gewebes räumlich variiert und welches Ausmaß und welche räumliche Skala die Steifigkeitsänderungen bei der Krankheit haben.

Prozesse, die zu einem Gewebeumbau führen: Um Streifen aus Lungengewebe vorzubereiten, beginnen Sie mit der Stabilisierung der Lungenstruktur für den Schnitt durch Aufblasen isolierter Mauslungen. Intratracheal mit 50 Millilitern pro Kilogramm Körpergewicht warmer, in PBS hergestellter Gel mit niedrigem Gelpunkt binden Sie die Luftröhre ab und kühlen Sie die aufgeblähte Lunge in einem PBS-Bad bei vier Grad Celsius für 60 Minuten. Die Aros werden in den Lufträumen gelieren und versteifen, um die Lungenstruktur sanft zu stabilisieren. Schneiden Sie während dieses Intervalls mit einem Rasiermesser oder Skalpell das mit Aros stabilisierte Lungengewebe der Maus in Streifen von etwa fünf mal fünf Millimetern Länge und Breite und einer Dicke von 400 Mikrometern.

Waschen Sie dann die Streifen fünf Minuten lang in PBS bei 37 Grad Celsius, um Reste von Aros zu entfernen und große Atemwege und Gefäße auszuschließen. Schneiden Sie Streifen aus subpleuralen Regionen, die von den Hauptstammbronchien entfernt sind, wenn Atemwege und große Gefäße abgebildet werden sollen, schneiden Sie Streifen aus Lungengewebe weiter proximal zu den Hauptstammbronchien, um interessante Bereiche für eine FM-Mikroindentation zu isolieren. Visualisieren Sie das Gewebe durch Gesichtskontrastmikroskopie oder Immunfärbung und visualisieren Sie es durch Fluoreszenzmikroskopie.

Bitte beachten Sie den schriftlichen Teil dieses Protokolls für das Verfahren. Unmittelbar vor einer FM-Charakterisierung befestigen Sie die Gewebestreifen an Poly-L-Lysin-beschichteten 15-Millimeter-Deckgläsern, indem Sie das Deckglas von unterhalb des schwimmenden Gewebes anheben und sicherstellen, dass sich der Gewebestreifen gleichmäßig auf der Deckglasoberfläche verteilt. Falls erforderlich, sandwichen Sie den Streifen mit einem zweiten, sauberen, unbeschichteten Deckglas und üben Sie leichten Druck aus, um die Befestigung des Gewebes an dem mit Poly-L-Lysin beschichteten Deckglas zu erleichtern.

Kalibrieren Sie das A FM-System gemäß den Anweisungen des Herstellers unmittelbar vor jeder Runde von Mikroindentationsexperimenten. Bestimmen Sie dazu zwei kritische Parameter. Die Cantilever-Federkonstante unter Verwendung der thermischen Fluktuationsmethode in Luft und die Cantilever-Auslenkungsempfindlichkeit, ein Parameter, der verwendet wird, um das Ausgangssignal der Fotodiode auf den tatsächlichen Cantilever-Auslenkungsabstand zu skalieren.

Kalibrieren Sie die Ablenkempfindlichkeit, indem Sie eine standardmäßige erzwungene Verschiebungskurve in PBS auf einem sauberen Glasobjektträger erhalten. Berechnen Sie dann die Steigung der erzwungenen Verschiebungskurve in der Messung der erzwungenen Verschiebungskurve. Die A-FM-Spitze wird an einer einzigen Stelle in Richtung der Probenoberfläche verlängert und von ihr zurückgezogen, wobei die Auslenkung des Cantilever-Deltas D in Abhängigkeit vom Spitzenverschiebungsdelta überwacht wird. Z.It Es wird empfohlen, einen Siliziumnitrid-Dreiecks-Cantilever-Ausleger mit einer kugelförmigen Bo-Silikat-Spitze mit einem Durchmesser von fünf Mikrometern unter Verwendung einer FM-Sonde mit einer Federkonstante von 0,06 Newton pro Meter zu verwenden.

Wir haben weiche Materialien mechanisch charakterisiert, wobei die Spanne 100 bis 50.000 Pascal umfasst. Wischen Sie die Unterseite des Probendeckglases mit Seidenpapier ab und befestigen Sie es dann mit Vakuumfett an einem Standardglasobjektträger. Montieren Sie den Objektträger auf dem Probentisch A FM und bedecken Sie das Gewebe mit 500 Mikrolitern PBS bei Raumtemperatur.

Platzieren Sie dann den FM-Scankopf über der Probe. Stellen Sie den Probentisch des Mikroskops so ein, dass das Mikroskop für die Okularbetrachtung eingestellt wird, um die A FM-Spitze in der Mitte des Sichtfelds auszurichten. Verschieben Sie den A-FM-Probentisch, um einen interessanten Bereich auf dem Gewebe auszuwählen.

Wechseln Sie dann zur CCD-Kamerabetrachtung, um wie gewünscht Phasenkontrastbilder und/oder Fluoreszenzbilder des Gewebes aufzunehmen. Bewegen Sie die A FM-Spitze langsam nach unten, bis sie genau mit der Probe in Kontakt kommt. Eine FM-Mikroindentationscharakterisierung von weichen Proben erfordert kleine Eindringtiefen, um große lokale Dehnungen zu vermeiden, die das Hertz-Modell ungültig machen, das für die Berechnung des Elastizitätsmoduls verwendet wird, um große Dehnungen zu vermeiden, führen Sie die Eindringung im Trigger-Modus durch, indem die maximale Auslenkung des Cantilevers auf 500 Nanometer eingestellt wird.

Diese Durchbiegungsgrenze begrenzt die maximale Eindringkraft auf weniger als 30 Nanonewton. Die Eindringgeschwindigkeit sollte so gewählt werden, dass sie langsam genug ist, um die elastischen und nicht viskoelastischen Eigenschaften der weichen Probe zu untersuchen. Wählen Sie einen Geschwindigkeitsbereich von zwei bis 20 Mikrometern pro Sekunde für Lungengewebe für eine einzelne Messung aus einem interessierenden Bereich.

Verschieben Sie den FM-Messtaster an die gewünschte Position, und führen Sie eine einzelne Einkerbung aus, um eine Standardkraft-Verschiebungskurve zu erfassen. Die Sonde bewegt sich nur in Z-Richtung. Wechseln Sie für die automatische Kartierung eines Interessenbereichs in den Modus "Force Map", wählen Sie die Scangröße und die Probenahmepunkte innerhalb des ausgewählten Bereichs aus.

Die A FM-Spitze RA verläuft zwischen den Eindringbewegungen über die Probenoberfläche und sammelt individuelle erzwungene Verschiebungskurven an jedem Punkt innerhalb eines indedefinierten Probengitters. Wir fanden es praktisch, ein 16 x 16 großes Probenraster zu verwenden, um einen Bereich von 80 Mikrometern x 80 Mikrometern bei einer Eindringgeschwindigkeit von 20 Mikrometern pro Sekunde zu kartieren, was in etwa 10 Minuten abgeschlossen werden kann. Um den Elastizitätsmodul zu berechnen, passen Sie die Kraft-Verschiebungskurve an das Hertz-Kugeleindruckmodell an, indem Sie die nichtlineare Kurvenanpassung des Lee-Quadrats verwenden, wie hier gezeigt, wobei F gleich K sub C mal Delta D ist die Kraft, um den Ausleger zu biegen.

K sub C ist die Cantilever-Federkonstante. R ist der Radius der Kugelspitze, Delta ist gleich Delta Z minus Delta D ist die Eindringung, und neu ist das Poisson-Verhältnis der Probe, das für Lungengewebe gleich 0,4 ist. Um die Qualität der Anpassung zu bewerten, berechnen Sie den SSR-Wert oder die Summe der Quadrate der Differenz zwischen den Daten und den Anpassungswerten während der nichtlinearen Kurvenanpassung

Eliminieren Sie unzuverlässige oder nicht interpretierbare Messungen, indem Sie Daten aus fehlerhaften Kurven mit großen SSR-Werten verwerfen. Falls gewünscht, konvertieren Sie den Elastizitätsmodul oder E in den reinen Modul. G.Unter Verwendung der Beziehung E ergibt sich die doppelte Summe von eins plus neuen Zeiten G.To um räumliche Steifigkeitsmuster zu visualisieren, die im Kraftkartenmodus erfasst wurden, Moduldaten und Konturkarten darzustellen, z. B. in einem 16 x 16-Raster, das einen Bereich von 80 Mikrometern x 80 Mikrometern abdeckt.

Um eine große Menge an Kraftkurvendaten zu verarbeiten, kann ein benutzerdefinierter Algorithmus geschrieben werden, um Kraftverschiebungskurven automatisch anzupassen, modulare Konturkarten zu extrahieren und/oder Konturkarten oder ELA-Transplantate zu zeichnen. Unter Verwendung der gleichen Verfahren und Parameter, die gerade beschrieben wurden, zeigt diese Abbildung, dass Ich Gewebe richtig schneide und färbe. Das Alveolärmikro des Lungenparenchyms ist gut erhalten, wie durch Immunfluoreszenzfärbung für die Basalmembrankomponente Laminin ohne Fixierung oder Permeation beobachtet wurde.

Diese Panels zeigen eine Immunfluoreszenzfärbung für Kollagen, eine in frischen, nicht fixierten Lungen, die von Mäusen entnommen wurden, die zuvor mit PBS oder mit Bliomycin behandelt wurden, um Fibrose zu induzieren. Beispieldiagramme für Kraftverschiebungen, die aus einem FM-Mikroeindruck erhalten wurden, sind hier mit der gleichen aufgebrachten Kraft dargestellt. Die A-FM-Spitze erzeugt eine große Vertiefung in einem weichen Bereich, was zu einer relativ flachen Kraftverschiebungskurve führt, die in Blau dargestellt wird, im Gegensatz zu einer kleinen Vertiefung und einer steilen Kraftverschiebungskurve für einen steiferen Bereich, die in Rot dargestellt ist.

Um nach jeder Vertiefung saubere Kraftkurven zu erhalten, muss die A-FM-Spitze vor der nächsten Vertiefung vollständig und berührungslos von der Probenoberfläche zurückgezogen werden. Dieser kontaktfreie Zustand entspricht dem flachen Bereich der Kurve, in dem die Spitze ohne Auslenkung des Auslegers verschoben wird. Diese Abbildung zeigt eine typische falsche Kurve ohne flachen Bereich, die auftritt, wenn die Spitze nicht vollständig von der Probenoberfläche zurückgezogen wird, z. B. wenn eine weiche Probe an der Spitze anhaftet, was es unmöglich macht, den Kontaktpunkt zu bestimmen, wenn die Spitze vollständig in der weichen Probe gefangen ist.

Die Kurve kann so aussehen, ohne deutliche Auslenkung, aber mit geringem Rauschen. Diese Abbildung zeigt die Steifigkeit. Daten, die aus erzwungenen Verschiebungskurven extrahiert wurden, die räumlich als Steifigkeitskarten dargestellt werden, die als ELA-Transplantate bezeichnet werden, wobei die Farbskalen mit der Steifigkeit des ELAs-Transplantats auffällige Unterschiede im Bereich und in der Verteilung der Gewebesteifigkeit im normalen und fibrotischen Lungenparenchym sowie große räumliche Unterschiede in der Steifigkeit, insbesondere innerhalb der fibrotischen Lungenprobe, zeigen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die lokale mechanische Umgebung des Lungenparenchyms charakterisieren können, indem Sie die lokalen elastischen Eigenschaften von frischem Lungengewebe direkt mit Hilfe der mikroskopischen Rasterkraftkopie messen.