Name: Micro-Mechanische Charakterisierung von Lungengewebe mit Atomic Force Microscopy (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 10 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie die lokale mechanische Umgebung von Lungenparenchym mit Atomic Force Microscopy charakterisieren. Diese Methode ermöglicht präzise Steifigkeitsmessungen an frischem Lungengewebe.

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Wir danken A. Tager und B. Shea für ihre kontinuierliche Zusammenarbeit und für die Bereitstellung des Lungengewebes zu Demonstrationszwecken verwendet hier. Diese Arbeit wurde vom National Institutes of Health gewähren HL-092961 gefördert. Diese Arbeit wurde teilweise am Center for Nanoscale Systems (ZNS), ein Mitglied der National Nanotechnology Infrastructure Network, das von der National Science Foundation NSF unter Auszeichnung ECS-0335765 wird unterstützt durchgeführt. CNS ist Teil der Faculty of Arts and Sciences der Harvard University.

1. Lungengewebe Bandvorbereitung <ol><li> Lungengewebe ist sehr kompatibel und schwer in Streifen für AFM Charakterisierung geschnitten. Um vorübergehend stabilisieren die Lunge Struktur für das Schneiden, aufblasen isoliert Mauslungen intratracheal mit 50 ml / kg Körpergewicht von 2% niedriger Gelpunkt Agarose (hergestellt in PBS) erwärmt auf 37 ° C. Vernähen der Luftröhre und kühlen aufgeblasenen Lungen in ein Bad von PBS bei 4 ° C für 60 Minuten. Die Agarose wird Gel und in den Lufträumen versteifen, sanft zur Stabilisierung der Lunge Struktur während dieses Intervalls 5. Höhere Agarose Konzentrationen, dh 3-4%, kann zur weiteren Verbesserung Gewebe Stabilisierung zum Schneiden sein. </li><li> Schneiden Sie die Agarose-stabilisierten Maus Lungengewebe mit einer Rasierklinge oder Skalpell in Streifen von 5 x 5 mm in Länge und Breite und 400 um Dicke, dann waschen Sie die Streifen in einem PBS-Bad bis 37 vorgewärmten ° C mit je 100 ml Becherglas auf einer Bank-top beheizten Rührplatte für 5 Minuten, um restliche Agarose zu entfernen. Um auszuschließen großen Atemwege und Gefäße, geschnittenen Streifen von subpleural entfernteren Regionen Hauptstamm Bronchien. Wenn Atemwege und der großen Gefäße werden abgebildet sind, schneiden Streifen aus Lungengewebe mehr proximal Hauptstamm Bronchien. </li></ol> 2. AFM Mikroindentation und Fluoreszenz-Imaging <ol><li> Zur Isolierung Bereiche von Interesse für die AFM Mikroindentation, können Gewebe durch Phasenkontrast-Mikroskopie sichtbar gemacht werden, oder immungefärbt und visualisiert durch Fluoreszenzmikroskopie. Für Immunfärbung Block Gewebe Streifen mit 5% Serum aus der Quelle des gewünschten sekundären Antikörper (in PBS) für 2 Stunden ohne Fixierung oder Permeabilisierung bei Raumtemperatur. </li><li> Inkubieren des Gewebes Streifen mit den entsprechenden Primär-Antikörper (z. B. Kaninchen anti-Kollagen I interstitielle Kollagen (1:250 Verdünnung), Kaninchen-anti-Laminin (1:250 Verdünnung) zu visualisieren, um Basalmembran sichtbar) in eine Vertiefung einer 12-Well-Platte auf einer Wippe unter leichtem Schütteln für 1 Stunde, waschen Probe 3 Mal für jeweils 5 Minuten mit PBS, gefolgt von entsprechenden Sekundär-Antikörper, konjugiert mit fluoreszierenden Marker (zB Alexa Fluor 546 Ziege anti-Kaninchen Zweitantikörper (1:250 Verdünnung)) für 1 Stunde bei Raumtemperatur. </li><li> Wash Gewebestreifen ausgiebig mit PBS und speichert in PBS bei 4 ° C </li><li> Unmittelbar vor dem AFM Charakterisierung, schließen Sie das Gewebe Streifen zu einem Poly-L-Lysin-beschichtete 15-mm Deckglas durch Anheben des Deckglas von unten die schwimmende Gewebe, so dass das Gewebe Streifen verteilt sich gleichmäßig auf dem Deckglas Oberfläche, ggf. Sandwich-Bandes mit einem zweiten sauberen, Deckglas unbeschichteten und gelten leichten Druck mit Gewebe Bindung an die Poly-L-Lysin-beschichtete Deckgläschen zu unterstützen. </li><li> Kalibrieren Sie das AFM-System nach der Herstellung der Anweisung unmittelbar vor jeder Runde Mikroindentation Experimente. Bestimmen Sie zwei kritische Parameter: 1) der Cantilever Federkonstante mit der Temperaturschwankungen Methode in Luft 6, und 2) die Federauslen Empfindlichkeit, die einen Parameter verwendet, um die Fotodiode Ausgangssignal auf den tatsächlichen Federauslen Entfernungsskala ist, Dd. Kalibrieren Ablenkempfindlichkeit durch den Erwerb einer Standard-Kraft-Weg-Kurve in PBS auf einen sauberen Glasobjektträger berechnen dann die Steigung der Kraft-Weg-Kurve (Abb. 1b). In der Kraft-Weg-Kurve der Messung wird die AFM-Spitze in Richtung Ein-und Ausfahren von der Probenoberfläche an einem einzigen Standort (ohne Rasterung in XY-Richtung), mit der Auslenkung des Cantilevers, Ad, als eine Funktion der Spitze Verschiebung, Az überwacht . </li></ol> Wir empfehlen die Verwendung einer Siliziumnitrid-Dreieck Cantilever mit einer 5-Mikrometer Durchmesser Borosilikat kugelförmigen Spitze (Novascan). Mit AFM-Sonden mit einer Federkonstante von 0,06 N / m haben wir mechanisch weichen Materialien mit Schubmodule überspannt 100 bis 50.000 Pa aus. <ol start="6"><li> Wischen Sie die Unterseite der Probe Deckglas mit Seidenpapier, befestigen Sie es an einem Standard-Objektträger aus Glas mit Vakuum-Fett, montieren Sie die Glasplatte auf dem AFM Probenbühne und decken das Gewebe mit 500 ul PBS (Raumtemperatur). </li><li> Set dem Mikroskop Okular betrachten, die AFM-Spitze in der Mitte des Sichtfeldes durch eine Anpassung des Mikroskops Probenbühne auszurichten. Wählen Sie einen Bereich von Zinsen auf das Gewebe, indem Sie die AFM Probe Bühne, dann auf CCD-Kamera-Schalter-Anzeige zur Phasenkontrast-Bild und / oder Fluoreszenz-Aufnahmen des Gewebes erfassen, wie gewünscht. </li><li> Führen Sie Standard-AFM Engagement Betrieb, indem die AFM-Spitze langsam nach unten, bis sie in Kontakt mit der Probe ist. </li><li> Genaue AFM Mikroindentation Charakterisierung von weichen Proben erfordert kleine Eindringtiefen zu großen lokalen Stämme, die den Hertz-Modell für Elastizitätsmodul Berechnung ungültig zu vermeiden. Zur Vermeidung von großen Belastungen führen Einzug in Trigger-Modus, indem Sie die Cantilever maximalen Auslenkung (Triggerpunkt) bis 500 nm. Diese Auslenkung Grenze wird begrenze diemaximale Eindrückkraft auf weniger als 30 nN (F = Cantilever Federkonstante * Verschiebung oder F max = 0,06 nN / nm * 500 nm = 30 nN). </li></ol> Die Vertiefung Geschwindigkeit sollte so gewählt, dass ausreichend langsam, um elastische eher viskoelastischen Eigenschaften der weichen Probe 7 zu erkunden. Ein Geschwindigkeitsbereich von 2-20 um pro Sekunde eignet sich für das Lungengewebe. <ol start="10"><li> Für eine einzelne Messung aus einem Gebiet von Interesse, bewegen Sie die AFM-Sonde, um den Standort von Interesse und führen Sie einen einzigen Einbuchtung auf einem Standard-Kraft-Weg-Kurve (die Sonde bewegt sich nur in Z-Richtung, ohne XY-Scanning) zu sammeln. </li><li> Für die automatisierte Zuordnung einer Region von Interesse, um Force-Karte zu wechseln, wählen Sie die Scan-Format und Sample Points in den ausgewählten Bereich. In Force-Map-Modus speichert der AFM-Spitze Rastern über die Probe Fläche zwischen Vertiefung Bewegungen und individuelle Kraft-Weg-Kurven an jedem Punkt innerhalb einer definierten Probe Netz. Weitere Messstellen wird eine höhere räumliche Auflösung, sondern verlängern die Zeit für das Mapping erforderlich. Wir fanden es sinnvoll, eine 16 x 16 Probe Raster verwenden, um ein 80 x 80-um-Bereich auf eine Vertiefung Geschwindigkeit von 20 mu m pro Sekunde, die in ca. 10 Minuten durchgeführt werden kann map. </li></ol> 3. AFM Datenextraktion <ol><li> Zur Berechnung der E-Modul, passen die Kraft-Weg-Kurve, um die Hertz Kalotte Modell mit der kleinsten Quadrate nichtlineare geschwungene Armatur 8 (Abb. 1 A, C): <img src="/files/ftp_upload/2911/2911eq1.jpg" alt="Gleichung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Gleichung 1"> wo F = k c * Δ d, wird die Kraft auf den Cantilever verbiegen, k c der Biegefeder konstant ist, R Sphäre Spitzenradius ist, δ = Δ z - Δ d ist Einzug und υ ist die Probe Poissonzahl (υ = 0,4 für Lungengewebe 9). </li><li> Zur Beurteilung der Qualität der Anpassung, die Berechnung der SSR-Wert oder die Summe der Quadrate der Differenz zwischen den Daten und die Passform Werte, während die nicht-lineare Kurvenanpassung. Beseitigen unzuverlässig oder un-interpretierbare Messungen durch Verwerfen von Daten aus "schlechten" Kurven mit großen SSR Werte. </li><li> Wenn gewünscht, konvertieren Elastizitätsmodul (E) zu Schubmodul (G), unter Verwendung der Beziehung E = 2 x (1 + υ) x G. Zur Visualisierung räumlicher Muster der Steifigkeit in Force-Map-Modus gesammelt, Plot-Modul Daten in Höhenlinien (z. B. in 16 x 16 Probe Raster für ein 80 x 80-um-Bereich). </li><li> Für die Verarbeitung einer großen Menge von Kraftkurve Daten kann eine benutzerdefinierte Algorithmus geschrieben, um automatisch fit Kraft-Weg-Kurven, extrahieren Moduli und / oder Grundstück elastographs mit dem gleichen Verfahren und Parameter wie in 3.2 und 3.3 (zB Matlab) skizziert werden. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2911/2911fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1 (A) Schematische Darstellung des AFM Mikroindentation einer weichen Probe auf einem starren Substrat mit einem kugelförmigen Sonde (mit freundlicher Genehmigung aus Dimitriadis E., et al. 2002 Biophys J 8). (B) Repräsentative Kraft-Weg-Kurve von einem sauberen Objektträger in PBS zu Federauslen Empfindlichkeit bestimmen gesammelt. (C) Repräsentative Kraft-Weg-Kurven von weich (blau) und steif (rot) Proben, die die entsprechenden Parameter aus (A) gesammelt. 4. Repräsentative Ergebnisse: Abbildung 2A zeigt eine Lungenparenchym Streifen auf Poly-L-Lysin beschichteten Deckgläschen in PBS befestigt mit einem AFM-Sonde in direkt oberhalb des Bereichs von Interesse und bereit für Mikroindentation Mapping. Abbildung 2B zeigt, dass in gut geschnitten und gefärbt Gewebe, die alveoläre Mikroarchitektur des Lungenparenchyms gut erhalten, wie durch Immunfluoreszenzfärbung für Basalmembran Komponente Laminin ohne Fixierung oder Permeabilisierung beobachtet. Abbildung 2 CD zeigen Immunfluoreszenzfärbung für Kollagen I in frischen unfixierten Lungen von Mäusen, die zuvor mit PBS (Abb. 2C) behandelt geerntet, behandelt oder mit Bleomycin (Abb. 2D) zur Fibrose 10 zu induzieren. Abbildung 3A zeigt ein Beispiel für Kraft-Weg-Diagramme aus AFM Mikroindentation erhalten. Mit der gleichen Krafteinwirkung erzeugt AFM-Spitze eine große Einbuchtung auf einem weichen Bereich (blaue Linie), was zu einer relativ "flachen" Kraft-Weg-Kurve im Vergleich zu einer kleinen Einbuchtung und eine "steile" Kraft-Weg-Kurve für eine steifere Region ( rote Linie). Um eine saubere Kraft Kurven zu erhalten, nach jeder Vertiefung der AFM-Spitze muss vollständig von der Probenoberfläche und frei von Kontakt, bevor die nächste Vertiefung eingefahren werden. Dieser Kontakt freien Zustand entspricht dem flachen Bereich der Kurve in Abbildung 3A, wo die Spitze übersetzt, ohne Federauslen. 3B zeigt eine typische falsche Kurve ohne eine flache Region, die, wenn die Spitze nicht vollständig von der Probenoberfläche eingefahren auftritt (z. B. Soft Probe einttaches bis zur Spitze) macht es unmöglich, den Kontakt zu bestimmen. Wenn die Spitze ist komplett in weiche Probe gefangen ist, kann die Kurve aussehen wie in Abbildung 3C gezeigt, ohne klare Ablenkung, aber kleine Geräusch. Abbildung 4 zeigt Schubmodul Daten aus Kraft-Weg-Kurven räumlich wie Steifigkeit Karten (elastographs), wo Farbskalen mit Schubmodul angezeigt extrahiert. Elastographs zeigen auffallende Unterschiede in der Reichweite und Verteilung von Gewebe Schubmodul in normalen (Abb. 4A) und fibrotische (Abb. 4B) Lungenparenchym und große räumliche Variationen in Schubmodul, insbesondere innerhalb der Lungenverletzung Probe. <img src="/files/ftp_upload/2911/2911fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. (A) Phasenkontrast-Aufnahme zeigt eine AFM-Sonde über eine Maus Lungenparenchym Streifen. Scale-bar, 50 pm. (B) Immunfärbung von Laminin in normalen Maus Lungengewebe zeigt die alveoläre Mikroarchitektur des normalen Lungenparenchyms. White-Box zeigt typische 80-by-80 um Elastizität Mapping-Bereich. Maßstab: 20 um. (C und D) Immunfärbung von Kollagen I in Kochsalzlösung (C) und Bleomycin (D) behandelten Maus Lungenparenchym. Scale-Bars, 100 um. <img src="/files/ftp_upload/2911/2911fig3.jpg" alt="Abbildung 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 3"> Abbildung 3. (A) Repräsentative interpretierbar Kraft-Weg-Kurven aus Kochsalzlösung (blau) und Bleomycin behandelt (rot) Maus Lungenparenchym gesammelt, bzw.. Schwarze Linien sind am besten geeignet, die sich aus der sphärischen Hertz-Modell und sind mit ihren entsprechenden berechneten Elastizitätsmoduln gekennzeichnet. (B, C) Vertreter un-interpretierbaren Kraft-Weg-Kurven. <img src="/files/ftp_upload/2911/2911fig4.jpg" alt="Abbildung 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 4"> Abbildung 4. Representative elastographs von Kochsalzlösung (A) und Bleomycin-behandelten (B) Maus Lungenparenchym gesammelt. Die farbigen Balken zeigen Schubmodul in Kilopascal. Achsenbeschriftungen anzuzeigen räumlichen Skala in Mikrometern. Maßstabsbalken: 20 um

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Keine Interessenskonflikte erklärt.

Mechanische Charakterisierung von Lungengewebe mit AFM Mikroindentation bietet beispiellose räumliche Auflösung (Abb. 4) und bietet eine einzigartige Perspektive auf mikro-Variationen in Gewebesteifigkeit. Als ein Beispiel für seine Nützlichkeit, angegeben bisherigen Makro-Messungen in normaler und fibrotischen Lungengewebe Streifen eine ungefähre 2-3-fache Erhöhung der Elastance mit Fibrose 11,12. Im Gegensatz dazu zeigt AFM Mikroindentation dass Gewebe Versteifung ist klar lokalisiert und mit einigen Regionen ausstellenden bis ~ 30-fache Erhöhung der Schubmodul über dem Median in normalem Lungengewebe 10 beobachtet. Als Matrix Steifigkeit jetzt bekannt ist, entscheidend beeinflussen Zellfunktionen, bieten diese lokalen Messungen von unschätzbarem Wert Parameter an die biofidelity von Zellkultur-Studie der Lungenzellen zu verbessern. Mehrere praktische Fragen ergeben sich durch die Verwendung von dünnen Streifen des Lungengewebes. Die Oberflächen der Bänder sind nicht perfekt flach, da das Gewebe Profil folgt die Architektur des zugrunde liegenden Alveolen. Die AFM-System passt sich automatisch Spitzenposition in der Z-Richtung während Einzug, wenn die Probenoberfläche Höhenvariation kleiner ist als 15-um zu helfen, die Herausforderung zu meistern. Die Messungen sind bei Raumtemperatur nicht 37 ° C aus, so Abweichungen der mechanischen Eigenschaften durch diese Temperaturschwankungen verursacht werden, können nicht ausgewertet werden, obwohl sie würden erwarten, dass kleinere werden. Der Einfluss der zugrunde liegenden Alveolenwand Architektur auf den beobachteten mechanischen Eigenschaften ist schwierig, mit den aktuellen Lichtmikroskopie Setup ermitteln. Zum Beispiel wäre es wünschenswert, um festzustellen, ob Alveolarwände Anisotropie und unterschiedlichen mechanischen Eigenschaften aufweisen, wenn sie in Richtungen ausgerichtet oder quer zur Ebene der Wand eingedrückt. Allerdings sind die aktuellen Exemplare dick, und die Imaging-System keine 3D-Funktionen, daher ist es nicht möglich, die lokalen Alveolenwand Orientierung an jedem Punkt des Kontaktes zu bestimmen. Schließlich bleibt der Einfluss der zellulären Bestandteile am gemessenen mechanischen Eigenschaften nicht vollständig geklärt. In den Methoden detaillierte hier werden keine Anstrengungen unternommen, um gezielt zu entfernen zellulären Bestandteile des Gewebes. Allerdings stellen die Zellen an der Oberfläche zur Verfügung Eindrucks kaum lebensfähig zu sein angesichts der Zeit, da Gewebe Ernte und die Notwendigkeit des Schneidens des Gewebes um den Zugang zu den Alveolen zu gewinnen vergangen. Spezielle Experimente an Zellen zu entfernen oder neu zu besiedeln Matrizen mit lebenden Zellen, und bewerten die daraus resultierenden Veränderungen in Gewebesteifigkeit scheint gerechtfertigt. Da frische unfixierten Gewebe für diese Messungen benötigt wird, sollte die Zeit von Gewebe Ernte der Messung vergangen minimiert und Proben sollten bei 4 ° C gelagert werden, um Veränderungen der mechanischen Eigenschaften zu vermeiden. Besonderes Augenmerk sollte, wenn Gewebe Streifen zwischen Containern beim Waschen oder Färben, so dass minimale Verformung oder Beschädigung erzeugten übertragen werden. Für AFM Anwendung in flüssiger, ist ein entscheidender Schritt, um das Gewebe so flach wie möglich schneiden und bewegungsunfähig die Probe auf die Unterstützung Deckglas. Falls vorhanden, kann eine automatisierte Schneiden Maschine wie ein Vibratom oder Gewebe Hobel verwendet, um Scheiben von sehr gleichmäßige Dicke geschnitten werden. Es ist wichtig, um Gewebe-Streifen sofort anschließen, bevor AFM-Messungen und zur Minimierung der Zeit für AFM-Messungen verstrichen, da die Probe wird schließlich aus der Deckgläser ablösen. Eine nützliche Beobachtung ist, dass größere Streifen zu befestigen stabiler zu rutscht abdecken und in Kraft bleiben für längere Laufzeiten in PBS als kleinere Streifen erscheinen. AFM Mikroindentation können charakterisieren Proben umfassen ein breites Spektrum von 100 Pa bis 50 kPa (Schubmodul) bei Verwendung eines Standard 0,06 N / m Ausleger mit einem 5 Mikrometer Durchmesser kugelförmiger Spitze. Dieser Bereich lässt sich mittels Sonden mit unterschiedlichen Federkonstanten werden; AFM-Sonden mit kugelförmigen Glas-Tipps bis hin 0,6 bis 12 &amp;mgr; m im Durchmesser und Federkonstanten zwischen 0,01 bis 0,58 N / m sind im Handel erhältlich (z. B. Novascan) und häufig gebrauchte 3. Mit einem 5 um kugelförmige Spitze, ist die theoretische Kontaktfläche zwischen Spitze und Gewebe etwa 5-9 um 2 für 400-700 nm Vertiefung (Abb. 1A). Kleinere oder größere Tipps können verwendet werden, um kleinere oder größere Schuppen von räumlicher Auflösung liefern. Pyramidal Tipps sind auch in AFM Mikroindentation 13-16 verwendet worden, die zumeist kleineren Kontaktflächen und somit zur Steigerung räumliche Auflösung bei der Kartierung, obwohl Daten Montage komplexer ist für diesen Tipp Geometrie. Mehrere Einschränkungen dieser Methode zu beachten. Die Lunge ist traditionell mechanisch nicht-invasiv, zum Beispiel mit Druck-Volumen-Analyse 17 oder Punch-Einzug der ganzen Lunge 19,20 aus. Invasive Methoden wie das hier beschriebene Veränderung der Lunge Architektur in wichtigen Punkten durch den Verlust der Luft-Flüssigkeit-interface, die normalerweise existiert in der luftgefüllten Lunge und der Verlust der Vorspannung, die Lunge teilweise Inflation bleibt auf Entspannung der Atemmuskulatur. Diese Einschränkungen sind für alle Messungen im Lungengewebe Streifen 18 hergestellt. Bemerkenswert ist jedoch der Median Steifigkeit in das Parenchym von normalem Lungengewebe (Schubmodul ~ 0.5kPa) gemessen unterscheidet sich nicht wesentlich von Schätzungen, die auf Punch-Einzug der intakten Lunge in Ruhe Bänden 19,20 basieren. Während Lungengewebe ist bekannt, dass nicht-linearen Versteifung mit zunehmender Verformung aufweisen, ist es nicht möglich, in einem strengen Mode testen, ob diese Eigenschaft sich weiterhin auf die Mikro-Maßstab mit dem hier verwendeten Verfahren. Die Hertz-Modell geht Homogenität der Probe. Allerdings sind die meisten biologischen Materialien, einschließlich Lungenparenchym, zunehmend heterogenen bei sinkenden räumlichen Skalen. Die Heterogenität der Probe kann Artefakte wie Variation der Young-Modul je nach Eindringtiefe, dh je nach der Schicht oder Komponente, die Verformung führen. Die Heterogenität in der xy-Ebene können durch sorgfältige Auswahl der entsprechenden sphärischen Spitze Größe abhängig von der Mikrostruktur des Biomaterials durch Dimitriadis EK et al begrenzt werden. 8 Es ist viel schwieriger zu prognostizieren oder korrigieren Sie die Hertz-Modell Fehler aufgrund von Material Heterogenität in der z-Richtung. Azeloglu et al. vor kurzem vorgeschlagen, ein Hybrid-Rechenmodell, um die elastischen Eigenschaften von heterogenen Substrat mit diskreten eingebetteten Einschlüsse 21 charakterisieren. Ihre neue Technik bietet ein mögliches Mittel, um die Aufnahme Eigenschaften von heterogenen Materialien Überwindung der Beschränkungen des Hertzschen Analyse zu berechnen. Die Hertz-Modell nimmt auch absolute elastische Verhalten, während biologische Materialien zeigen in der Regel zeitabhängige viskoelastische Verhalten. Eine vollständige viskoelastische Charakterisierung des Gewebes kann durch Variation der Einzug Geschwindigkeiten verwendet eingeholt werden. Wichtig ist, zeigt bisherigen Makro-mechanische Prüfung von Normal-und fibrotischen Lungengewebe schwache Frequenzabhängigkeit des Lungengewebes mechanischen Eigenschaften und die Bewahrung der Unterschiede zwischen normalen und Bindegewebe mechanischen Eigenschaften über alle Frequenzen getestet 11. Diese Befunde legen nahe, dass die Messung der mechanischen Eigenschaften mit einer einzigen Vertiefung Geschwindigkeit, mit AFM ein wesentlicher Aspekt der Veränderungen im Gewebe mechanische Eigenschaften, die Fibrose begleiten erfasst. Die Poisson-Verhältnis von 0,4 für das Lungengewebe in dieser Arbeit verwendet wird, aus einer makroskopischen Messung 9. Leider sind die Poissonzahl auf Mikro-Ebene und Änderungen unter Krankheitszustand in der Literatur nicht zur Verfügung. Als Alternative zu E, E / (1-υ 2) oder (1-υ 2) / πE (die elastische Konstante k bezeichnet) 22 kann von AFM Mikroindentation berechnet und gemeldet werden, wenn die Poissonzahl unbekannt ist. Für die meisten Biomaterialien Poissonzahl ist im Bereich von 0,4 bis 0,5 aufgrund ihres hohen Wassergehaltes. Im Bereich von 0,3 bis 0,5 variiert der Faktor 1 / (1-υ 2) nur 1,10 bis 1,33, so dass zumutbare Abweichungen in der Poissonzahl nur bescheidene Auswirkungen auf die gemeldete Modul auszuüben. Der Anstieg der Schubmodul, dass wir Bericht für fibrotische Gewebe bezogen auf normales Gewebe ist mehrfach in Größe, was bedeutet, dass Fehler mit Variationen in Poissonzahl verbundenen geringen relativ zu den Veränderungen der mechanischen Eigenschaften beobachtet werden. Der eigentliche Algorithmus und Code, der für die Analyse der Kraft-Weg-Daten verwendet werden kann, ist vorbehaltlich der spezifischen Anwendung Zustand und die anschließende Eigenschaften der verschiedenen Bevölkerungsgruppen des Kraft-Weg-Kurven. Wenn mehr ausgefeilte Analyse von Interesse ist, kann man bitte das Arbeitsprogramm der Lin et al. 23. Die Autoren stellten eine Reihe von synergistischen Strategien in einen Algorithmus, der viele der Komplikationen, die bisher die Bemühungen um den Einbau von Hertz-Modelle Einzug Daten automatisieren behindert haben überwindet. Mehrere andere Bereiche sind für die weitere Entwicklung und Nutzung dieser Methode. In Fällen, wo man bei der Visualisierung der Alveolarwände ohne Antikörpermarkierung interessiert ist, kann sowohl Elastin und Kollagen visualisiert werden von ihren autofluoreszierenden Signal im grünen Spektrum. Auf der anderen Seite könnte eine bessere Bildgebung, entweder mit dünner Gewebeschnitte, 3D-Bildgebung, oder beides, verbessern die Fähigkeit, Gewebe-Architektur mit zugrunde liegenden mechanischen Eigenschaften korreliert. Während die aktuellen Methoden Färbung und Visualisierung von Komponenten der extrazellulären Matrix, wie Kollagen und Laminin ermöglichen, könnten zusätzliche Anstrengungen zur Färbung Zelloberflächenmarker auf bestimmte Zellpopulationen zu identifizieren und die mechanische Mikroumgebungen in der Nähe solcher Populationen zu charakterisieren angestrebt werden. Alternatively, konnte Gewebe von Mäusen, die Fluoreszenz-markierten Linie Marker oder Zelle bestimmte Proteine, die dasselbe Ziel verfolgen, geerntet werden. Schließlich detailliert die Methode scheint hier gut zu charakterisieren andere anatomische Merkmale in der Lunge, wie Schiffe, die Umgestaltung in Hypertonie und Atemwegen, die Umgestaltung in Asthmatiker geeignet. Auf der Grundlage seiner aktuellen Stand der Entwicklung und das Potenzial für eine weitere Verbesserung, erscheint AFM Mikroindentation balanciert, um wertvolle Einblicke in die Veränderungen im Gewebe Steifigkeit, die Progression der Erkrankung in der Lunge begleiten Ausbeute und wird ohne Zweifel von Wert bei der Charakterisierung von räumlichen und zeitlichen Veränderungen in der Steifigkeit einer Vielzahl anderer Weichteile.

<table border="1"><tbody><tr><th> Name des Reagenzes </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th><th> Kommentare </th></tr><tr><td> AFM-Spitze </td><td> Novascan </td><td> PT.GS </td><td> 5 Mikron Borosilikat Perlen, 0,06 N / m </td></tr><tr><td> Poly-L-Lysin Deckgläser </td><td> VWR </td><td> 354085 </td><td> BD BioCoat 12 mm rund No.1 Glas </td></tr><tr><td> Agarose, Low Geliertemperatur </td><td> Sigma </td><td> A0701 </td><td></td></tr><tr><td> Kaninchen-Anti-Collagen I (Rb PAB) Antikörper </td><td> Abcam </td><td> ab34710-100 </td><td></td></tr><tr><td> Alexa Fluor 546 Ziege anti-Kaninchen-Antikörper </td><td> Invitrogen </td><td> A11010 </td><td></td></tr><tr><td> Kaninchen-anti-Laminin </td><td> Sigma </td><td> L9393 </td><td></td></tr></tbody></table>

micro-mechanische charakterisierung von lungengewebe mit atomic force microscopy

Micro-Mechanical Characterization of Lung Tissue Using Atomic Force Microscopy

Matrix Steifigkeit stark beeinflusst Wachstum, Differenzierung und Funktion von anhaftenden Zellen 1-3. Auf der Makroebene die Steifigkeit von Geweben und Organen im menschlichen Körper über mehrere Größenordnungen 4. Viel weniger ist über, wie Steifigkeit räumlich variiert innerhalb von Geweben bekannt, und was den Umfang und die räumliche Skala von Steifigkeit Änderungen sind in Krankheitsprozesse, die sich in Gewebe-Remodeling. Um besser zu verstehen, wie sich Änderungen in der Matrix Steifigkeit Zellphysiologie beitragen in Gesundheit und Krankheit, werden die Messungen von Gewebe Steifigkeit bei einer räumlichen Skala relevanten Wohnsitz erhaltenen Zellen benötigt. Dies gilt insbesondere für die Lunge, ein hoch-konform und elastischem Gewebe, in dem Matrix Remodelling ist ein hervorstechendes Merkmal in Krankheiten wie Asthma, Emphysem, Hypertonie und Fibrose. Zur Charakterisierung der lokalen mechanischen Umfeld des Lungenparenchyms mit einer räumlichen Skala relevanten residenten Zellen haben wir Methoden zur direkten Messung der lokalen elastischen Eigenschaften des frischen murine Lungengewebe mit Rasterkraftmikroskopie (AFM) Mikroindentation entwickelt. Bei entsprechender Wahl der AFM Eindringkörper, Freischwinger und Eindringtiefe, erlauben diese Methoden Messungen der lokalen Gewebe Schubmodul parallel mit Phasenkontrast-und Fluoreszenz-Imaging in der Region von Interesse. Systematische Entnahme von Gewebe-Streifen bietet Karten von Gewebe mechanische Eigenschaften, die lokale räumliche Variationen in Schubmodul offenbaren. Korrelationen zwischen mechanischen Eigenschaften und der zugrunde liegenden anatomischen und pathologischen Merkmale zeigen, wie Steifigkeit mit Matrix-Ablagerung in Fibrose variiert. Diese Methoden können in andere Weichteile und Krankheiten ausgedehnt werden, um zeigen, wie lokale Gewebe mechanische Eigenschaften über Raum und zum Fortschreiten der Krankheit variieren.

Die Steifigkeit der extrazellulären Matrix stark beeinflusst mehrere Verhalten von adhärenten Zellen. Matrix Steifigkeit variiert räumlich in einem Gewebe, und unterliegt Änderungen in verschiedenen Krankheitszuständen. Hier entwickeln wir Methoden, um räumliche Veränderungen der Steifigkeit in normalen und fibrotische Maus Lungengewebe mit Rasterkraftmikroskopie Mikroindentation charakterisieren.

Micro-Mechanische Charakterisierung von Lungengewebe mit Atomic Force Microscopy

Die Steifigkeit der Matrix beeinflusst das Wachstum, die Differenzierung und die Funktion adhärenter Zellen stark1-3. Auf der Makroebene beeinflusst die Steifigkeit von Geweben und Organen ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, das lokale mechanische Umfeld des Lungengewebes auf einer räumlichen Skala zu charakterisieren, die für residente Zellen relevant ist, indem die lokalen elastischen Eigenschaften von frischem Spiegelungslungengewebe mithilfe der Mikroeindrückung durch Rasterkraftmikroskopie direkt gemessen werden. Dies wird erreicht, indem das mit Agarose aufgeblasene Mauslungen-Gewebe mit einer Rasierklinge oder einem Skalpell geschnitten wird, um Lungenparenchym-Streifen mit einer Länge und Breite von fünf mal fünf Millimetern und einer Dicke von 400 Mikrometern herzustellen. Anschließend werden die nicht fixierten, nicht permeabilisierten Lungen-Gewebestreifen immunhistochemisch gefärbt, um Bereiche von Interesse für die Mikroeindrückung mittels Rasterkraftmikroskopie zu identifizieren.Danach wird eine Mikroeindrückprüfung mit einer Kraftmesssonde an Gewebestreifen in PBS bei Raumtemperatur durchgeführt, um die lokalen elastischen Eigenschaften des frischen Lungengewebes direkt zu messen. Die Ergebnisse zeigen auffällige Unterschiede im Bereich und in der Verteilung der Gewebesteifigkeit zwischen normalem und fibrotischem Lungengewebe sowie große räumliche Variationen der Steifigkeit, insbesondere innerhalb der fibrotischen Lungeprobe.Basierend auf Steifigkeitskarten, die aus erzwungenen Verschiebungskurven gewonnen wurden, die mittels einer mikromechanischen Eindringprüfung mit einer Kraftmikroskopie (FM) aufgenommen wurden. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Messmethoden wie dem Dehnen von Gewebestreifen liegt darin, dass sie eine beispiellose räumliche Auflösung bietet und somit einen einzigartigen Einblick in die mikroskaligen Variationen der Gewebesteifigkeit ermöglicht. Diese Messung kann helfen, zentrale Fragen zu beantworten, beispielsweise wie sich die Steifigkeit räumlich innerhalb des Gewebes verändert und welches Ausmaß sowie räumliche Skala die Steifigkeitsänderungen bei der Erkrankung aufweisen.Prozesse, die zu einer Gewebeumgestaltung führen. Um Streifen aus Lungengewebe vorzubereiten, beginnen Sie mit der Stabilisierung der Lungenstruktur zum Schneiden, indem Sie isolierte Mauslungen über die Trachea mit 50 Milliliter pro Kilogramm Körpergewicht warmer, 2 %iger Low-Gel-Point-Agarose, die in PBS hergestellt wurde, aufblasen. Binden Sie die Trachea ab und kühlen Sie die aufgeblasenen Lungen 60 Minuten lang in einem Bad aus PBS bei vier Grad Celsius. Die Agarose wird in den Luftwegen gelieren und versteifen, wodurch die Lungenstruktur sanft stabilisiert wird. Während dieses Zeitintervalls schneiden Sie das agarosestabilisierte Lungengeweise der Maus mit einem Rasiermesser oder Skalpell in Streifen von etwa fünf mal fünf Millimetern Länge und Breite sowie 400 Mikrometer Dicke.Anschließend die Streifen fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius in PBS waschen, um restliches Aros zu entfernen, um große Atemwege und Gefäße auszuschließen. Wenn große Atemwege und Gefäße abgebildet werden sollen, Streifen aus subpleuralen Regionen fernab der Hauptbronchien schneiden; wenn Bereiche von Interesse für eine FM-Mikroeindrückung isoliert werden sollen, Streifen aus Lungengewebe näher zu den Hauptbronchien schneiden. Das Gewebe mittels Hellfeldmikroskopie oder Immunfärbung sichtbar machen und mittels Fluoreszenzmikroskopie visualisieren.Bitte beachten Sie den schriftlichen Teil dieses Protokolls für das Verfahren. Unmittelbar vor einer FM-Charakterisierung befestigen Sie die Gewebestreifen an mit Poly-L-Lysin beschichteten 15-Millimeter-Deckgläsern, indem Sie das Deckglas von unten an das schwimmende Gewebe heranführen und sicherstellen, dass sich der Gewebestreifen gleichmäßig auf der Oberfläche des Deckglases ausbreitet. Falls erforderlich, können Sie den Streifen mit einem zweiten sauberen, unbeschichteten Deckglas abdecken und sanften Druck ausüben, um die Anheftung des Gewebes an das mit Poly-L-Lysin beschichtete Deckglas zu unterstützen.Kalibrieren Sie das AFM-System unmittelbar vor jeder Runde von Mikroeindruckversuchen gemäß den Anweisungen des Herstellers. Bestimmen Sie dazu zwei kritische Parameter: die Federkonstante des Cantilevers mit der Thermalschwankungsmethode in Luft und die Ablenkungsempfindlichkeit des Cantilevers, ein Parameter, der verwendet wird, um das Ausgangssignal der Photodiode auf die tatsächliche Ablenkungsdistanz des Cantilevers umzurechnen.Kalibrieren Sie die Ablenkempfindlichkeit, indem Sie eine Standard-Kraft-Weg-Kurve in PBS auf einem sauberen Glasobjektträger aufnehmen. Berechnen Sie anschließend die Steigung der Kraft-Weg-Kurve aus der Kraft-Weg-Kurvenmessung. Die AFM-Spitze wird an einer einzelnen Position zur Probenoberfläche hin ausgestreckt und von ihr zurückgezogen, wobei die Ablenkung des Cantilevers ΔD als Funktion der Spitzenverschiebung ΔZ überwacht wird. Es wird empfohlen, einen dreieckigen Siliziumnitrid-Cantilever mit einer fünf Mikrometer durchmessenden borosilikatgläsernen kugelförmigen Spitze zu verwenden, und zwar mit FM-Sonden mit einer Federkonstante von 0,06 Newton pro Meter.Wir haben weiche Materialien mechanisch charakterisiert, deren Schermodul zwischen 100 und 50.000 Pascal liegt. Wischen Sie die Unterseite des Probenobjektträgers mit einem Papiertuch ab und befestigen Sie ihn anschließend mit Vakuumfett auf einem Standard-Glasobjektträger. Bringen Sie den Glasobjektträger auf der AFM-Probenhalterung an und bedecken Sie das Papiertuch mit 500 Mikrolitern PBS bei Raumtemperatur.Platzieren Sie dann einen FM-Scanning-Kopf über der Probe. Justieren Sie den Mikroskop-Probenhalter, um das Mikroskop für die Betrachtung durch das Okular einzustellen und die A-FM-Spitze in der Mitte des Sichtfeldes auszurichten. Bewegen Sie den A-FM-Probenhalter, um einen interessierenden Bereich im Gewebe auszuwählen.Wechseln Sie dann zur CCD-Kamera-Ansicht, um Phasenkontrastbilder und/oder Fluoreszenzbilder des Gewebes nach Bedarf aufzuzeichnen. Bewegen Sie die AFM-Spitze langsam nach unten, bis sie genau mit der Probe in Kontakt steht. Eine mikroinduktive Charakterisierung weicher Proben mittels AFM erfordert geringe Eindringtiefen, um große lokale Dehnungen zu vermeiden, die das Hertz-Modell, das zur Berechnung des elastischen Moduls verwendet wird, ungültig machen. Um große Dehnungen zu vermeiden, führen Sie die Eindringung im Auslösermodus durch, indem Sie die maximale Auslenkung des Cantilevers auf 500 Nanometer einstellen.Diese Ablenkungsgrenze begrenzt die maximale Eindrückkraft auf weniger als 30 Nanonewton. Die Eindrückgeschwindigkeit sollte ausreichend langsam gewählt werden, um die elastischen statt der viskoelastischen Eigenschaften der weichen Probe zu untersuchen. Wählen Sie für eine Einzelmessung aus einem Bereich von Interesse einen Geschwindigkeitsbereich von zwei bis 20 Mikrometern pro Sekunde für Lungengewebe.Bewegen Sie die A-FM-Sonde an die gewünschte Position und führen Sie eine einzelne Eindrückung durch, um eine Standard-Kraft-Weg-Kurve aufzuzeichnen. Die Sonde bewegt sich dabei ausschließlich in Z-Richtung. Für die automatisierte Kartierung eines interessierenden Bereichs wechseln Sie in den Kraft-Kartierungsmodus, wählen Sie die Scan-Größe und die Abtastpunkte innerhalb des ausgewählten Bereichs.Die AFM-Spitze bewegt sich zwischen den Eindrückbewegungen über die Probenoberfläche und erfasst an jedem Punkt innerhalb eines vordefinierten Probenrasters individuelle Kraft-Weg-Kurven. Es hat sich als praktisch erwiesen, ein 16-mal-16-Probenraster zu verwenden, um einen Bereich von 80 Mikrometer mal 80 Mikrometer bei einer Eindringgeschwindigkeit von 20 Mikrometern pro Sekunde abzubilden, was in etwa 10 Minuten abgeschlossen ist. Zur Berechnung des E-Moduls wird die Kraft-Weg-Kurve mithilfe der nichtlinearen Kleinste-Quadrate-Kurvenanpassung an das Hertzsche Modell für sphärische Eindrückung angepasst, wie hier dargestellt, wobei F gleich K-Index-C mal Delta-D ist, die Kraft zur Biegung des Cantilevers.K sub C ist die Federkonstante des Cantilevers. R ist der Kugelspitzenradius, δ = δZ − δD ist die Eindrücktiefe, und ν ist das Poisson-Verhältnis der Probe, das für Lungengewebe 0,4 beträgt. Zur Beurteilung der Güte der Anpassung berechnen Sie den SSR-Wert (Summe der Quadrate der Differenzen zwischen den Daten und den Anpassungswerten) während der nichtlinearen Kurvenanpassung.Eliminieren Sie unzuverlässige oder nicht interpretierbare Messungen, indem Sie Daten von schlechten Kurven mit hohen SSR-Werten verwerfen. Falls gewünscht, wandeln Sie das elastische Modul oder E in den Schubmodul G unter Verwendung der Beziehung E gleich zwei mal die Summe aus eins plus nu mal G. Um räumliche Steifigkeitsmuster, die im Kraftkartenmodus erfasst wurden, zu visualisieren, stellen Sie die Moduldaten und Isolinienkarten dar, beispielsweise in einem 16 mal 16-Gitter, das einen Bereich von 80 Mikrometern mal 80 Mikrometern abdeckt.Um eine große Menge an Kraft-Kurven-Daten zu verarbeiten, kann ein benutzerdefinierter Algorithmus geschrieben werden, um Kraft-Weg-Kurven automatisch anzupassen, Module zu extrahieren und/oder Konturkarten oder ELA-Grafts darzustellen. Unter Verwendung der zuvor beschriebenen gleichen Verfahren und Parameter zeigt diese Abbildung, dass das Gewebe ordnungsgemäß geschnitten und angefärbt wurde. Die alveoläre Mikrostruktur des Lungenparenchyms ist, wie durch Immunfluoreszenz-Färbung für die Basalmembrankomponente Laminin ohne Fixierung oder Permeabilisierung beobachtet, gut erhalten.Diese Bilder zeigen immunfluoreszenzfärbungen für Kollagen, eine an frischen, unbehandelten Lungen von Mäusen, die zuvor mit PBS oder mit Bleomycin zur Induktion einer Fibrose behandelt wurden. Hier dargestellte Kraft-Weg-Kurven, erhalten mittels einer Kraftmikroskop-Mikroeindrückprüfung bei gleicher aufgebrachter Kraft. Die AFM-Spitze erzeugt eine große Eindrückung in einem weichen Bereich, was zu einer relativ flachen Kraft-Weg-Kurve führt, dargestellt in Blau, im Vergleich zu einer kleinen Eindrückung und einer steilen Kraft-Weg-Kurve für einen steiferen Bereich, dargestellt in Rot.Um nach jeder Eindrückung saubere Kraftkurven zu erhalten, muss die AFM-Spitze vollständig von der Probenoberfläche zurückgezogen und vor der nächsten Eindrückung kontaktfrei sein. Dieser kontaktfreie Zustand entspricht dem flachen Bereich der Kurve, in dem sich die Spitze ohne Auslenkung des Cantilevers bewegt. Diese Abbildung zeigt eine typische fehlerhafte Kurve ohne flachen Bereich, die auftritt, wenn die Spitze nicht vollständig von der Probenoberfläche zurückgezogen wird, beispielsweise wenn eine weiche Probe an der Spitze haftet, wodurch es unmöglich wird, den Kontakt­punkt zu bestimmen, falls die Spitze vollständig in der weichen Probe eingeschlossen ist.Die Kurve kann wie folgt aussehen, ohne klare Ablenkung, jedoch mit geringem Rauschen. Diese Abbildung zeigt die Steifigkeit. Aus erzwungenen Verschiebungskurven gewonnene Daten werden räumlich als Steifigkeitskarten dargestellt, die als ELAs-Transplantat bezeichnet werden, wobei die Farbskala der Steifigkeit entspricht. ELAs-Transplantate zeigen auffällige Unterschiede im Bereich und in der Verteilung der Gewebesteifigkeit im normalen und fibrotischen Lungenparenchym sowie große räumliche Variationen der Steifigkeit, insbesondere innerhalb der fibrotischen Lungenprobe.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man das lokale mechanische Umfeld des Lungengerüstes charakterisiert, indem man die lokalen elastischen Eigenschaften von frischem Lungengewebe mittels Rasterkraftmikroskopie direkt misst.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Quelle: Canovic, E. P., et al. Charakterisierung der mehrskaligen mechanischen Eigenschaften von Hirngewebe mittels Rasterkraftmikroskopie, Stoßeindringung und Rheometrie. J. Vis. Exp. (2016)Dieses Video zeigt den Einsatz der Rasterkraftmikroskopie (AFM) zur Messung der viskoelastischen Eigenschaften von Hirngewebe, bei dem ein Cantilever-Sensor mit einer kugelförmigen Sonde mit dem Gewebe interagiert und sich unter den ausgeübten Kräften biegt. Ein Laserstrahl, der auf einen Detektor abgelenkt...

Charakterisierung der mechanischen Eigenschaften von Hirngewebe der Maus mittels Rasterkraftmikroskopie

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Rasterkraftmikroskopie Cantilever-basierte Nanoindentation: Messungen mechanischer Eigenschaften auf der Nanoskala in Luft und Flüssigkeit

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Automatisierter Vibratomschnitt von Agarose-eingebettetem Lungengewebe für die Multiplex-Fluoreszenzbildgebung

Dieses Protokoll visualisiert, wie Kryoschnitte von murinem Lungengewebe vorbereitet, Rasterkraftmikroskopie-Kraftkartenexperimente durchgeführt und die Daten analysiert werden, um den Elastizitätsmodul der nativen pulmonalen Basalmembran der Maus zu bestimmen.

Extraktion des Elastizitätsmoduls nativer pulmonaler Basalmembranen von Mäusen aus der Rasterkraftmikroskopie abgeleiteten Kraftkarten

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Micro-Mechanische Charakterisierung von Lungengewebe mit Atomic Force Microscopy

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