Name: Messung der mechanischen Eigenschaften von lebenden Zellen mit Atomic Force Microscopy (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
Description: Lernen Sie die Messung des Elastizitätsmoduls lebender Zellen mittels Atomic Force Microscopy. Diese Methode nutzt Kraftspektroskopie und Hertz-Modell-Fitting zur Erstellung einer 2D-Steifigkeitskarte für zellmechanische Studien.

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Die Autoren danken Dr. Paul Janmey an der University of Pennsylvania für die Bereitstellung von Zelllinien in diesem Papier verwendet. QW auch anerkennen, JF Byfield und Evan Anderson für ihre aufschlussreichen Diskussionen über AFM-Techniken.

1. Kalibrieren Sie die Federkonstante der Cantilever <ol><li> Legen Sie den Ausleger in die AFM gemäß den Anweisungen des Herstellers. Es ist notwendig, die Cantileverhalters mit Ethanol gereinigt vor allen Experimenten. Dies wird Ihnen helfen zu begrenzen bakterielle Kontamination der Kultur in den AFM-Messungen. </li><li> Kalibrieren InvOLS (Inverse Optical Lever Sensitivity). Dieser Parameter beschreibt die Menge der Photodiode Antwort (Volt) pro Nanometer Cantileverauslenkung. </li><li> Legen Sie einen sauberen Glasobjektträger auf die Probe Bühne, installieren Sie dann die AFM Kopf und stellen Sie den Laserstrahl und die Ausrichtung nach den Anweisungen des Herstellers. Rasten Sie die AFM-Spitze auf dem Objektträger. </li><li> Mit der Piezo zurückgezogen, richten Sie den Spiegel mit einer Photodiode Lesung von -2 V. Führen Sie eine Kraft-Spektroskopie Messung mit einem Triggerpunkt (maximal Photodiode Antwort) von +2 V. </li><li> Mit der Piezo zurückgezogen, richten Sie den Spiegel mit einer Photodiode Lesung von -2 V. Führen Sie einen foRCE-Spektroskopie Messung mit einem Triggerpunkt (maximal Photodiode Antwort) von +2 V. Hinweis: Die Spannungswerte hier sind spezifisch für die Asylum AFM. Dieser Wert sollte nach den Vorgaben des Herstellers vorgesehen eingestellt werden. Nach der Datenerfassung abgeschlossen ist, in der Firma-Kontaktbereich der Kraftkurve vergrößern. Führen Sie eine lineare Anpassung in diese Region, um die Steigung, die in V / nm finden. Der Kehrwert dieser Wert beschreibt die optische Empfindlichkeit des Auslegers-Photodiode Ensemble. </li><li> Setzen Sie den Spiegel Ausrichtung zu einer freien Auslenkung von 0 V. </li><li> Kalibrieren der Cantilever Federkonstante. Ein thermischer-tune Verfahren wird verwendet, um die Federkonstante der Ausleger 28 zu bestimmen. </li><li> Nach der Kalibrierung des InvOLS, erhöhen den Scanner von dem Probentisch derart, dass es keine Wechselwirkung zwischen Spitze und Probe. </li><li> Beginnen Erfassung thermischen Daten. Dabei ist die thermische Schwingung des Freiträger Recorded. Die AFM-Software analysiert ein Leistungsspektrum eines solchen thermischen Schwingungen und zeichnet es in einem Datenfenster. </li><li> Nach ein paar Sekunden der Datenerfassung, führen Sie eine Anpassung an die Daten-Segment an der niedrigsten Frequenz (Grundresonanz) Spitze zu bestimmen, die Federkonstante zentriert. </li></ol> 2. Laden der Probe <ol><li> Installieren Sie die Dish Heizung Zubehör auf dem AFM Bühne, wenn nicht bereits ausgestattet. </li><li> Die Temperatur auf 37 ° C und für 20 Minuten warten, bis das System eine stabile thermische Gleichgewicht zu erreichen. </li><li> Legen Sie die Kulturschale auf dem AFM Bühne und sichern Sie es mit der Schelle mit der Schale Heizung vorgesehen. Es ist wichtig, um die Zeit zwischen Entnahme der Schale aus dem Inkubator und der ihn in der Phase, die Traumatisierung der Zellen zu vermeiden, zu minimieren. Für Messungen länger als 30 min sollte CO 2 eigenständiges Medium verwendet werden, um den normalen Kulturmedium ersetzen. </li><li> Tragen Sie einen kleinen Tropfen von 37 ° C Kulturmedium an der Spitze von Ter AFM-Cantilever, und senken Sie die AFM Kopf, bis die Spitze gerade in Flüssigkeit eingetaucht. </li><li> Mit dem Top-View CCD-Kamera, richten Sie den Laserstrahl auf den Cantilever (die Ausrichtung in flüssiger wird anders sein als in der Luft, wegen der Änderung des Brechungsindex des Mediums). </li><li> Rasten Sie die AFM-Spitze auf einer sauberen Fläche von der Kulturschale. </li><li> Durchführen der Kalibrierung der InvOLS wie oben für den Ausleger Empfindlichkeit in der flüssigen Umgebung beschrieben. </li></ol> Hinweis: a) Wenn Zellen auf Hydrogele kultiviert werden, die Kalibrierung der InvOLS sollten im Voraus gegen die Bodenfläche einer Kulturschale mit Zellkulturmedium gefüllt durchgeführt werden. Beim Umschalten auf Zellproben, hat besondere Aufmerksamkeit zu zahlen, um nicht die Laserstrahl Ausrichtung des Auslegers werden. b) InvOLS muss neu kalibriert, wenn es eine Änderung in der Laserausrichtung werden. c) Es wird auch empfohlen, InvOLS als Durchschnitt der Wert nehmen aus mehreren Eichkurven, seit jede Kalibrierung erzeugt eine andere InvOLS. Die Variation in InvOLS ist jedoch gering im Vergleich zu dem Mittelwert. Zum Beispiel, Kalibrieren eines Bruker DNP-10 Freischwinger mit Federkonstante 0,06 N / m in Flüssigkeit durch 100 mal produzieren einen mittleren Wert von 66,3 InvOLS nm / V, mit einer Standardabweichung von nur 0,5 nm / V. 3. Sammeln Kraftkurven of Cell Einzug <ol><li> Markieren Sie eine Zelle für den Einzug. Mit Hilfe des optischen Mikroskops, zum Bewegen der Plattform, um den Ausleger über der Zelle so zu positionieren, daß die Spitze in der peri-Kerne Region befindet. Eine genaue Einstellung der Position des Auslegers kann durch Aufbringen Offsets auf die X-und Y-Scannern durchgeführt werden. Hinweis: Die AFM-Cantilever muss von der Probenoberfläche zurückgezogen werden beim Bewegen der Probe Bühne, um eine Zielzelle auszuwählen. Dies schützt den Ausleger von Klopfen in der Probe, da die Probenoberfläche eventuell nicht flach. </li><li> Wechseln Sie zu Spektroskopie-Modus zu erzwingen. Stellen Sie den EinzugRate im Bereich von 1-10 um / sec, niedrig genug ist, um hydrodynamischen Effekte zu vermeiden. </li><li> Stellen Sie die Ablenkung Triggerpunkt, der die maximale Eindruckkraft begrenzt, um Schäden an Zellen zu vermeiden. Wählen Sie die Relative Auslösung Option, die für jeden Drift im Ablenksignal korrigieren. Eine maximale Kraft von 2 nN ist ein guter Ausgangspunkt für die meisten Proben. Dieser Wert sollte jedoch nach der Probe Steifigkeit eingestellt werden. Für weiche Proben einen niedrigeren Wert sollte verwendet werden, um übermäßige Vertiefung der Probe zu vermeiden. Für steife Proben einen hohen Wert sollte verwendet werden, um messbare Vertiefung erzeugen. </li><li> Stellen Sie die Kraft Abstand groß genug, um sicherzustellen, dass die Spitze vollständig aus der Zelle zwischen Kraftmessungen abgenommen werden. Üblicherweise wird die Kraft-Weg bei 5 um eingestellt. </li><li> Befehl die AFM zu einer einzigen Kraft Kurve zu nehmen. </li><li> Sammeln mindestens drei unterschiedlichen Kennlinien an verschiedenen Stellen in der peri-Kerne Bereich jeder Zelle. Obwohl es vorteilhaft ist, mehrere nehmenKurven auf jeder Zelle für zuverlässige statistische Daten zu viele Kraftkurven kann zu Veränderungen in der Zelle Steifigkeit aufgrund von Stress aus der AFM-Sonde führen. </li><li> Wenn die Datenerfassung abgeschlossen ist, ziehen Sie die Spitze, und wiederholen Sie die Schritte 3.1-3.6 für so viele Zellen wie für gute statistische Daten über die Zelle Steifigkeit unter einer bestimmten Bedingung Probe benötigt. In der Regel werden 30 Zellen für jede Bedingung gemessen. </li></ol> Um die Verteilung der Steifigkeit in einer Zelle zu charakterisieren, wird eine Kraft-Karten-Modus angewendet wird. In der Kraft-Karten-Modus, stellen Sie eine Scan-Größe, um die Region in der Nähe sind, eine angemessene Auflösung; setzen die Vertiefung Parameter wie für einzelne Kraft Kurven ausgewählt, die AFM wird dann über den definierten Bereich Probe rastern und nehmen einzelne Kraft Kurven bei jedem Pixel in den Probenbereich. 4. Data Analysis Die aufgezeichneten Kraft Kurven werden unter Verwendung eines benutzerdefinierten MATLAB Verfahren, um die Zelle Steifigkeit berechnen. Das Folgende ist eine kurze Beschreibung der MATLAB Verfahren: <ol><li> Die MATLAB-Programm identifiziert die Kontaktstelle koordiniert z0 und d0 (siehe Abbildung 1) mit Hilfe eines Algorithmus aus einer publizierten Methode von Lin et al angenommen 29.: </li><li> Für jeden Datenpunkt in der Kraft-Kurve, eine lineare Anpassung der Daten auf der linken Seite zur Sehenswürdigkeit und ein Hertz-Modell auf der rechten Seite (mit dem gewählten Punkt als erste Anlaufstelle) passen, bis zu dem Satz maximale Vertiefung (200-300 nm empfohlen). </li><li> Für jeden Punkt, die Berechnung der relativen RMS Fehler von beiden passt und die Summe dieser Werte. </li><li> Der Punkt, der die insgesamt mindestens Anpassungsfehler erreicht wird als erste Anlaufstelle ausgewählt. Hinweis: Rechenzeit kann durch die Implementierung eines golden-Abschnitt Suche anstatt linear Scannen des gesamten Kraftkurve reduziert werden. </li><li> Probenverformung δ und Eindruckkraft F werden wie folgt berechnet: <img alt="Gleichung 1"fo: content-width = &quot;3.073in&quot; fo: src = &quot;/ files/ftp_upload/50497/50497eq1highres.jpg&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/50497/50497eq1.jpg&quot; /&gt; </li><li> Eine der kleinsten Quadrate angewendet wird, um die F vs passen δ Daten in der Post-Kontaktbereich, z ≥ z 0, nach Hertz Modell der Elastizitätsmodul, E der Zelle zu extrahieren: <img alt="Gleichung 2" fo:content-width="2.773in" fo:src="/files/ftp_upload/50497/50497eq2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50497/50497eq2.jpg" /> , Wobei v das Poisson-Verhältnis. Hinweis: Wenn δ mehr als 10% der Dicke der Probe (Zelle Höhe) ist die gemessene Zelle Steifigkeit wird durch das Substrat Steifigkeit betroffen. Die Dicke der perinukleären Region ist in der Regel in der Größenordnung von wenigen Mikrometern. Daher wird nur die ersten 200-300 nm von F-δ-Kurve nach Hertz-Modell passt. </li></ol>

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<li>Dimitriadis, E. K., Horkay, F., Maresca, J., Kachar, B., Chadwick, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+elastic+moduli+of+thin+layers+of+soft+material+using+the+atomic+force+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Determination of elastic moduli of thin layers of soft material using the atomic force microscope.</a> Biophysical Journal. 82 (02), 2798-2810 (2002).</li>
<li>Trache, A., Lim, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+cell+response+to+mechanical+stimulation+studied+by+integrated+optical+and+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Live cell response to mechanical stimulation studied by integrated optical and atomic force microscopy.</a> J. Vis. Exp. (44), e2072(2010).</li>
<li>Lim, S. M., Kreipe, B. A., Trzeciakowski, J., Dangott, L., Trache, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix+effect+on+RhoA+signaling+modulation+in+vascular+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix effect on RhoA signaling modulation in vascular smooth muscle cells.</a> Exp. Cell Res. 316, 2833-2848 (2010).</li>
</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Die AFM Vertiefung Methode hat Vorteile gegenüber mechanischen Eigenschaften von lebenden Zellen zu charakterisieren. Wenn auch weniger empfindlich als die magnetische Verdrehen Durchflusszytometrie und optische Pinzette, die Kräfte auf die Pikonewton Stufe 32 messen kann, kann die AFM Widerstandskraft von Proben im Bereich von zig Pico-Newton, um Hunderte von nano-Newton, vergleichbar zu erfassen, um der Kraft reichen, dass Zellen können unter Verwendung einer Mikropipette 19 aufgebracht werden. D...

Mechanische Eigenschaften, insbesondere Festigkeit, der einzelnen Zellen und der sie umgebenden extrazellulären Matrix (ECM) sind entscheidend für viele biologische Prozesse wie Zellwachstum, Motilität, Teilung, Differenzierung und Gewebshomöostase. 1 Es wurde gezeigt, dass die Zelle mechanische Steifigkeit wird hauptsächlich bestimmt durch das Zytoskelett, insbesondere die Netzwerke von Actin und intermediären Filamenten und andere Proteine ​​mit ihnen verbunden sind. 2 ergibt sich aus mechanischen Tests in vitro Netzwerke von Actin und Intermediärfilamenten vermuten, dass die Zelle Mechanik weitgehend abhängig von der Zytoskelett-Struktur und der Vorspannung ist in das Zytoskelett. 3-5 Steifigkeit von lebenden Zellen wird dann als Index für die Zytoskelett-Struktur 6, Myosin Aktivität 7 und viele andere zelluläre Prozesse evaluieren angesehen. Noch wichtiger ist, sind Veränderungen in der Zelle mechanische Eigenschaften auch oft festgestellt, dass nahe stehendeATED mit verschiedenen Krankheitszuständen wie Tumorbildung und Metastasenbildung 8-10 Kontrolle der mechanischen Steifigkeit von lebenden Zellen kann daher einen neuen Weg zur Zellphysiologie zu überwachen;. zu erkennen und zu diagnostizieren Krankheiten 8;. und um die Wirksamkeit der medikamentösen Behandlungen ausgewertet 11 , 12 Mehrere Verfahren, einschließlich Teilchen Tracking Mikrorheologie, 13-16 magnetischen Verdrehen Zytometrie 17 Mikropipette Streben 18,19 und Mikroindentation 20-22 wurden entwickelt, um die Elastizität der Zellen zu messen. Particle Tracking Mikrorheologie zeichnet die thermischen Schwingungen von entweder Submikron fluoreszierenden Teilchen in Zellen oder Bezugsmarkierungen in der Zelle Zytoskeletts injiziert. 23 elastischen und viskosen Eigenschaften von Zellen aus den gemessenen Verschiebungen Teilchen mit der Fluktuations-Dissipations-Theorem berechnet. 14,23 Dieses Verfahren ermöglicht gleichzeitige Messungen der lokalenmechanische Eigenschaften mit hoher räumlicher Auflösung an verschiedenen Orten in einer Zelle. Jedoch kann Einspritzen fluoreszierenden Teilchen in die Zellen auf Veränderungen in der zellulären Funktion, Zytoskelett-Struktur und damit die Zellmechanik führen. Die Mikropipette Aspiration Methode gilt Unterdruck in einer Mikropipette mit einem Durchmesser im Bereich von 1 bis 5 um ein kleines Stück von der Zellmembran in die Pipette saugen. Zelle Steifigkeit von der angelegten Unterdruck und Zellmembran Verformung. 18 Dieses Verfahren berechnet wird, kann jedoch nicht erkennen, die heterogene Verteilung der Steifigkeit über die Zelle. Magnetische Verdrehen Durchflusszytometrie (MTC) gilt Magnetfeld Drehmoment an superparamagnetische Kügelchen, die an der Zellmembran zu erzeugen. 17 Handy Steifigkeit wird bei diesem Verfahren aus der Beziehung zwischen der angelegten Drehmoments und der Drehverformung der Zellmembran abgeleitet. Es ist schwierig, die Position der magnetischen Kügelchen in der MTC Verfahren zu steuern, und es ist auch challenging, die Verdrehungsdeformation mit hoher Auflösung zu charakterisieren. Mikroindentation gilt ein Stempel mit wohldefinierten Geometrie in die Zelle zu stanzen. Das Einrücken Kraft und die daraus resultierende Vertiefung in Zellen folgen oft die Vorhersage der Hertz-Modell. Young-Modul von Zellen aus den Kraft-Vertiefung Kurven durch Aufstecken auf die Hertz-Modell berechnet werden. Diese Methode wurde in großem Umfang eingesetzt, um die mechanischen Eigenschaften von Gewebe und Zellen trotz seiner Grenzen wie die Unsicherheit in Kontaktstelle Bestimmung Anwendbarkeit der Hertz-Modell, und das Potential zu Schäden am Zellen zu testen. Unter den vielen Geräten für microindentaion 20, ist der Atomic Force Microscope (AFM) im Handel erhältlich und wurde in großem Umfang angewendet, um die mechanischen Eigenschaften von lebenden Zellen und Geweben 21,24-27 charakterisieren. Dieses Papier zeigt das Verfahren der Verwendung eines Asylum MFP3D-Bio AFM zu Zelle Mechanik charakterisieren. AFM nicht aufly liefert hochauflösende Topographie der Zellen, sondern auch weit verbreitet angewendet worden, um die mechanischen Eigenschaften von Gewebe-Zellen charakterisieren. Das Prinzip der AFM Vertiefung ist in Abbildung 1 dargestellt. Die AFM-Cantilever nähert die Zelle von wenigen Mikrometern über, in Kontakt mit der Zelle; Einzüge die Zelle, so dass die Cantileverauslenkung erreicht einen vorgewählten Sollwert und zieht sich aus der Zelle. Dabei wird die freitragende Auslenkung in Abhängigkeit von seiner Lage aufgezeichnet, wie in Abbildung 1 dargestellt. Vor dem Kontakt mit der Zelle bewegt sich der Ausleger in dem Medium ohne sichtbare Verformung. Wenn Einrücken auf der Zelle, den Freischwinger Kurven und den Ablenksignal zunimmt. Die Ausleger sind als elastische Strahlen, so dass die Auslenkung proportional zu der Kraft, die auf die Zelle modelliert. Durch die Einstellung der maximalen Cantileverauslenkung wird die maximale Größe der Kraft, die auf die Probe beschränkt d vermeidenAmage zu den Zellen. Der Abschnitt der Kraftverlauf von Punkt B nach C in Fig. 1, wobei die Spitze Vertiefungen in die Zelle, an die Hertz-Modell zu passen, um die Zelle zu extrahieren Steifigkeit zeigen. <img src="/files/ftp_upload/50497/50497fig1.jpg" alt="Abbildung 1" fo:content-width="4.75in" fo:src="/files/ftp_upload/50497/50497fig1highres.jpg"/> Abbildung 1. Illustration von AFM Mikroindentation und Interpretation der Kraft-Kurve. Das obere Feld zeigt die Bewegung der AFM-Cantilever durch die Piezo-Scanner gefahren. Die vertikale Lage des Auslegers und der z Cantileverauslenkung D wird während des Verfahrens aufgezeichnet. Der Ausleger beginnt bei Punkt a, wenige Mikrometer über der Zelle. Bei Annäherung an die Zelle, bleibt die Probe Vertiefung δ Null bis Punkt B, wo die Spitze in Kontakt mit der Zelle erreicht. Die Koordinaten des Punktes b in der Handlung sind kritische Wertefür die Datenanalyse durch (z 0, d 0&gt;) bezeichnet. Von B nach C, die Cantilever-Einzüge in die Zelle, bis die Cantileverauslenkung erreicht einen Sollwert, der auf das Verhältnis zwischen der maximalen gezielte Eindruckkraft und Kragfeder Konstante sein wird. Sobald die Auslenkung Signal erreicht den vorgegebenen Maximalwert, wird der Ausleger dann aus der Zelle zu Punkt d, wo es oft nach unten durch Spitze-Probe Haftung gezogen werden zurückgenommen, löst sich von der Zelle und kehrt in seine ursprüngliche Lage am e. Das rechte Bild zeigt die Beziehung zwischen der Vertiefung und dem aufgezeichneten z und d-Signals. In der unteren linken Bereich ist eine graphische Darstellung eines repräsentativen Kraftverlauf, die maximale Vertiefung eines Auslegers, der die Federkonstante gemessen werden 0.07N / m ist, ist auf 17 nm, so dass die maximale Eindruckkraft anzuwendenden Probe ist 1,2 nN. Die wichtigsten Orten während der Vertiefung sind markiert.

<table><tbody><tr><td>Rasterkraftmikroskop </td><td>Asylum Research</td><td>MFP3D-BIO</td><td></td></tr></tbody></table>

messung der mechanischen eigenschaften von lebenden zellen mit atomic force microscopy

Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy

Mechanische Eigenschaften der Zellen und der extrazellulären Matrix (ECM) spielt eine wichtige Rolle in vielen biologischen Prozessen einschließlich Stammzelldifferenzierung, Tumorentstehung und Wundheilung. Änderungen in der Steifigkeit von Zellen und ECM sind oft Anzeichen von Veränderungen in der Zellphysiologie oder Krankheiten in Geweben. Somit ist Zelle Steifigkeit ein Index, um den Status von Zellkulturen zu bewerten. Unter der Vielzahl von Methoden angewandt, um die Steifigkeit von Zellen und Geweben zu messen, bietet Mikro-Vertiefung mit einem Atomic Force Microscope (AFM) einen Weg, um zuverlässig zu messen die Steifigkeit der lebenden Zellen. Diese Methode wurde in großem Umfang angewendet, um die mikro-Steifigkeit für eine Vielzahl von Materialien, angefangen von Metalloberflächen weichen biologischen Geweben und Zellen zu charakterisieren. Das Grundprinzip dieses Verfahrens ist es, Gedankenstrich eine Zelle mit einer AFM-Spitze aus Geometrie und messen die aufgebrachte Kraft aus der Biegung des AFM-Cantilever. Montage der Kraft-Einzug Kurve nach Hertz-Modusl für die entsprechende Geometrie der Spitze geben können quantitative Messungen der Steifigkeit des Materials. Dieses Papier zeigt das Verfahren, um die Steifigkeit von lebenden Zellen mit AFM charakterisiert. Die wichtigsten Schritte einschließlich des Prozesses der AFM Kalibrierung, Kraft-Kurve Erwerb und Datenanalyse unter Verwendung eines MATLAB Routine demonstriert. Einschränkungen dieser Methode werden ebenfalls diskutiert.

2a zeigt drei repräsentative Kraftkurven von 3T3 Fibroblasten auf Kunststoff-Oberfläche, Polyacrylamidgel von Young-Module 3.000 Pa und 17.000 Pa bzw. kultiviert gemacht. Nach sorgfältiger Ermittlung der Kontaktstellen in den Kurven wird das Einrücken Kraft als Funktion der Zelle Verformung in 2b dargestellt. Unter einer Kraft von Größenordnungen kleiner als 0,3 nN, eine Pyramidenform Spitze Spiegelstriche 3 Mikrometer in einer Zelle auf einer 3 kPa Polyacrylamidgel kultiviert. Im Gegen...

Dieses Papier zeigt ein Protokoll, um die mechanischen Eigenschaften von lebenden Zellen mittels Mikroindentation mit einem Atomic Force Microscope (AFM) zu charakterisieren.

Messung der mechanischen Eigenschaften von lebenden Zellen mit Atomic Force Microscopy

Mechanical  properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many  biological processes including stem cell differentiation, ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, den elastischen Modul lebender Zellen mithilfe eines Rasterkraftmikroskops zu messen. Dazu werden zunächst FM-Kraftspektroskopie-Messungen an verschiedenen Positionen auf der Zelle durchgeführt. Im zweiten Schritt wird jede Kraft-Abstand-Kurve analysiert, um den Punkt zu bestimmen, an dem die AFM-Spitze erstmals mit der Zelle in Kontakt kommt.Als Nächstes werden die ersten 200 bis 300 Nanometer der Eindringtiefe-Daten ausgehend vom Kontakt­punkt an das Hertz-Modell angepasst. Um den elastischen Modul zu ermitteln, liefern die Ergebnisse eine zweidimensionale Karte der Zellsteifigkeit, die mithilfe des Kraft­abbildungs­modus erstellt wurde, wobei jedes Pixel eine einzelne Kraft-Abstand-Kurve darstellt. Den Ablauf dieses Verfahrens demonstriert Guen Thomas, ein Doktorand aus meinem Labor. Um dieses Verfahren zu beginnen, reinigen Sie den Cantilever-Halter mit 70 %igem Ethanol und lassen Sie ihn trocknen.Danach einen bru DNP 10 Cantilever gemäß den Herstelleranweisungen in das A FM einsetzen. Anschließend die Empfindlichkeit des inversen optischen Hebelarms kalibrieren. Dieser Parameter beschreibt die Reaktion des Photodetektors in Volt pro Nanometer Cantileverauslenkung.Um dies zu erreichen, laden Sie zunächst einen sauberen Glasobjektträger auf die Probenhalterung. Bringen Sie den FM-Kopf an und justieren Sie den Laserstrahl und die Ausrichtung gemäß den Herstelleranweisungen. Nach der Ausrichtung bringen Sie die FM-Spitze mit dem Glasobjektträger in Kontakt, wobei P acht O zurückgezogen ist.Richten Sie den Spiegel so aus, dass das Photodiodensignal bei minus zwei Volt liegt. Führen Sie anschließend eine Kraftspektroskopiemessung mit einem maximalen Photodiodensignal oder Auslösepunkt von plus zwei Volt durch. Sobald die Datenaufnahme abgeschlossen ist, zoomen Sie in den Bereich des festen Kontakts der Kraftkurve hinein und führen Sie eine lineare Anpassung für diesen Bereich durch.Um die Steigung in Volt pro Nanometer zu ermitteln, stellen Sie danach die Spiegeljustierung auf eine freie Auslenkung von null Volt zurück. Kalibrieren Sie anschließend die Federkonstante des Cantilevers mit der von Levy und Malam beschriebenen thermischen Abstimmungsmethode. Beginnen Sie damit, den Scanner vom Probenhalter wegzubewegen, sodass keine Wechselwirkungen zwischen der Spitze und der Probe auftreten.Zeichnen Sie anschließend die thermischen Daten auf, indem Sie die thermische Schwingung des Kragträgers erfassen. Die AFM-Software analysiert ein Leistungsspektrum dieser thermischen Schwingung und stellt es in einem Datenfenster dar. Führen Sie danach eine Anpassung an den Datenabschnitt durch, der um die niedrigste Frequenz zentriert ist – auch bekannt als fundamentale Resonanzspitze –, um die Federkonstante zu bestimmen.Um das a FM für die Kulturschalen vorzubereiten, installieren Sie ein Schalenheiz-Zubehör auf dem a FM-Objekttisch und stellen Sie die Temperatur auf 37 Grad Celsius ein. Warten Sie 20 Minuten, bis das System ein stabiles thermisches Gleichgewicht erreicht hat. Nach dem Vorheizen wird eine Kulturschale auf den a FM-Objekttisch gestellt und mit der mitgelieferten Klammer des Schalenheizers fixiert. Für Messungen, die länger als 30 Minuten dauern, sollte ein Kohlendioxid-unabhängiges Medium verwendet werden, um das normale Kulturmedium zu ersetzen.Als Nächstes einen kleinen Tropfen Kulturmedium mit 37 Grad Celsius auf die Spitze des A FM-Kantas anbringen und den a FM-Kopf so absenken, dass die Spitze gerade unter die Flüssigkeitsoberfläche taucht. Mithilfe einer CCD-Kamera von oben den Laserstrahl auf dem Kanta ausrichten. Die Ausrichtung in Flüssigkeit unterscheidet sich von der in Luft aufgrund der Änderung des Brechungsindex des Mediums.Nach der Ausrichtung platzieren Sie die A-FM-Spitze auf einem zellfreien Bereich der Kulturschale und kalibrieren die Empfindlichkeit der inversen optischen Hebelanordnung in der Flüssigumgebung. Um die Messungen der mechanischen Eigenschaften von Zellen zu beginnen, positionieren Sie die Cantileverspitze mithilfe eines optischen Mikroskops über dem Perle-Augen-Bereich einer Zelle. Präzise Anpassungen der Cantileverposition werden durch Anlegen von Versätzen an die X- und Y-Scanner erreicht.Schalten Sie dann das FM in den Vier-Spektroskopie-Modus und stellen Sie die Eindrückgeschwindigkeit auf fünf Mikrometer pro Sekunde ein, was niedrig genug ist, um hydrodynamische Effekte zu vermeiden. Stellen Sie anschließend den Auslenkungsauslösepunkt auf zwei Nano-Newton ein. Um eine Beschädigung der Zellen zu vermeiden, passen Sie diesen Wert entsprechend der Probensteifheit an.Wählen Sie außerdem die option der relativen auslösung, um eventuelle drifte im ablenkungssignal zu korrigieren. Stellen Sie dann den kraft-abstand auf fünf mikrometer ein, um sicherzustellen, dass die spitze zwischen den kraftmessungen vollständig von der zelle gelöst wird. Erfassen Sie drei kraftkurven an verschiedenen positionen im kernbereich von mindestens 30 zellen für jede bedingung.Obwohl es vorteilhaft ist, mehrere Kurven an jeder Zelle aufzunehmen, kann die Aufnahme zu vieler Kurven aufgrund der Belastung durch die AFM-Sonde zu Veränderungen der Zellsteifigkeit führen. Charakterisieren Sie die Verteilung mechanischer Eigenschaften innerhalb einer einzelnen Zelle mithilfe des Kraftkarten-Modus weitergehend.Stellen Sie im Kraftkartenmodus die Scan-Größe auf 30 Mikrometer, die Auflösung auf 32 × 32 und verwenden Sie dieselben Eindrückparameter wie bei einzelnen Kraftkurven. Das AFM nimmt dann an jedem Pixel des Probenbereichs einzelne Kraftkurven auf und liefert eine Steifigkeitskarte der gesamten Region. Analysieren Sie anschließend die aufgezeichneten Kraftkurven mithilfe von MATLAB, um die Zellsteifigkeit zu berechnen.Beginnen Sie mit einem Algorithmus, der erstmals von Lynette Al veröffentlicht wurde und mithilfe von Matlab sowohl eine lineare Anpassung als auch eine Hertz-Anpassung für jeden Punkt berechnet. Berechnen Sie den relativen RMS-Fehler beider Anpassungen und summieren Sie diese Werte an jedem Punkt. Der Punkt, der den minimalen gesamten Anpassungsfehler aufweist, wird als Ausgangspunkt des Kontakts ausgewählt; die Lokalisierung dieses Punkts ist entscheidend für die genaue Bestimmung des Elastizitätsmoduls der Zelle.Berechnen Sie anschließend die Probendeformation Delta. Verwenden Sie dazu die folgenden Gleichungen, wobei die Deformation vor dem Zellkontakt, wenn Z kleiner als Z null ist, gleich null ist und nach dem Kontakt gleich der Differenz zwischen der Cantileverauslenkung D und der Gesamtstrecke Z jenseits des Kontakt­punkts ist. Berechnen Sie dann die Eindrückkraft F mithilfe der folgenden Gleichungen, wobei die Kraft vor dem Zellkontakt, wenn Z kleiner als Z null ist, gleich null ist und nach dem Kontakt gleich der Federkonstante K des Cantilevers multipliziert mit der Cantileverauslenkung jenseits des Kontakt­punkts ist.Elise Quadrat-Anpassung wird anschließend auf die Daten zur Probendeformation in Abhängigkeit von der Eindrückkraft im Bereich nach dem Kontakt gemäß dem Hertz-Modell angewendet, um den Elastizitätsmodul der Zelle basierend auf der verwendeten Spitzenform zu ermitteln. Hier sind repräsentative Kraftkurven, die von drei T3-Fibroblasten-Zellen stammen, die auf drei verschiedenen Oberflächen kultiviert wurden. Wie hier zu sehen ist, können unterschiedliche Oberflächen die Steifheit des zellulären Cytoskeletts stark beeinflussen.Die durchschnittliche Verformung von Zellen, die auf einer harten Kunststoffoberfläche kultiviert wurden, ist in Rot dargestellt. Diejenigen, die auf einem steifen Polyacrylamid-Gel gewachsen sind, sind in Lila dargestellt, und diejenigen, die auf einem elastischen Polyacrylamid-Gel gewachsen sind, sind in Blau dargestellt. Nach sorgfältiger Identifizierung der Kontaktstellen in den Kurven können die eindringenden Kräfte als Funktion der Zellverformung genau dargestellt werden.Außerdem lässt sich ihr E-Modul genau aus den ersten 300 Nanometern der Eindringtiefe nach Kontakt berechnen. Gezeigt ist hier ein Fibroblast, der mit dem grün fluoreszierenden Protein markierten Menton, einer Art intermediären Filament, transfiziert wurde. Je heller das Bild, desto mehr Menton befindet sich in diesem Bereich.Das kann mit der Steifigkeit des zellulären Cytoskeletts in Zusammenhang stehen. Mithilfe der hier vorgestellten Kraft-Kartierungstechnik der AKA (AFM) lässt sich eine ähnliche Steifigkeitskarte eines Fibroblasten mit einer Auflösung von 32 mal 32 Pixeln darstellen, wobei jedes Pixel einen Bereich von 2,5 mal 2,5 µm² Zelloberfläche repräsentiert. Nach dem Anschauen dieses Videos werden Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie die Rasterkraftmikroskopie (Atomic Force Microscopy) zur Messung der Elastizität lebender Gewebezellen eingesetzt wird.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Dieses Papier soll den Leser in den Betrieb eines integrierten atomic force-optische Bildgebung Mikroskop für die mechanische Stimulation von lebenden Zellen in Kultur zu unterrichten. Eine Schritt-für-Schritt-Protokoll vorgestellt. Eine repräsentative Datenmenge, die Live-Zell-Antwort auf mechanische Stimulation zeigt vorgestellt.

Live Cell Reaktion auf mechanische Stimulation von Integrated Optical und Atomic Force Microscopy Studium

Hier zeigen wir die experimentellen Techniken verwendet, um den Vorsprung Kräfte auszuwerten, die Podosomes auf einem konformen Film, von der Vorbereitung des Films für die automatisierte Analyse von topographische Bilder gelten.

Vorsprung-Kraft-Mikroskopie: Eine Methode, um Kräfte entwickelt von Zelle Vorsprünge zu quantifizieren

In diesem Protokoll beschreiben wir eine Mikropipette-Methode, um eine kontrollierte Kraft direkt in den Zellkern in einer lebenden Zelle anwenden. Dieser Test ermöglicht Verhör der nuklearen mechanischen Eigenschaften in der lebendigen, anhaftende Zelle.

Eine direkte Kraft-Sonde zur Messung der mechanischen Integration zwischen dem Kern und dem Zytoskelett

Hier präsentieren wir ein Protokoll für die gleichzeitige Verwendung von Förster Resonance Energy Transfer-basierte Spannung Sensoren zur Messung der Belastung und Fluoreszenz Proteingewinnung nach Immunofluoreszenz Proteindynamik ermöglichen die Messung der Kraft-und Kleinschreibung messen Proteindynamik innerhalb von lebenden Zellen.

Messung von Kraft-und Kleinschreibung Proteindynamik in lebenden Zellen mit einer Kombination von fluoreszierenden Techniken

Wir präsentieren ein Protokoll zur Funktionalisierung von AFM-Auslegern (Atomic Force Microscope) mit einer einzelnen T-Zelle und einem Perlenteilchen für immunologische Studien. Gezeigt werden Verfahren zur Untersuchung der Einzelpaar-T-Zell-dendritischen Zellbindung durch AFM und zur Überwachung der echtzeitzellulären Reaktion von Makrophagen auf ein einzelnes Feststoffteilchen durch AFM mit Fluoreszenzbildgebung.

Funktionalisierung von Atomkraftmikroskop-Auslegern mit Einzel-T-Zellen oder Einzelpartikeln für die immunologische Einzelkraftspektroskopie

Hier präsentieren wir Die Atomkraftmikroskopie (AFM), die als Nano- und Mikroeindrüsenwerkzeug für Zellen und Gewebe betrieben wird. Das Gerät ermöglicht die gleichzeitige Erfassung der 3D-Oberflächentopographie der Probe und ihrer mechanischen Eigenschaften, einschließlich zellwandiger Young-Moduls sowie Turgordruck.

Einsatz der Atomkraftmikroskopie zur Messung mechanischer Eigenschaften und Turgordruck von Pflanzenzellen und Pflanzengeweben

Dieses Protokoll zielt darauf ab, AFM-Messungen an Hunderten von mikrobiellen Zellen zu automatisieren. Zuerst werden Mikroben in PDMS-Stempelmikrostrukturen immobilisiert und dann werden kraftspektroskopische Messungen automatisch an Hunderten von immobilisierten Zellen durchgeführt.

Automatisierung von Bio-Rasterkraftmikroskop-Messungen an Hunderten von C. albicans-Zellen

Hier wird das Protokoll der Conpokal-Technik vorgestellt, das konfokale und atomare Kraftmikroskopie zu einer einzigen Instrumentenplattform vereint. Conpokal bietet die gleiche Zelle, die gleiche Region, fast gleichzeitige konfokale Bildgebung und mechanische Charakterisierung von lebenden biologischen Proben.

Nahezu simultanes Laserscanning Konfokal- und Atomkraftmikroskopie (Conpokal) auf lebenden Zellen

Hier stellen wir ein Protokoll vor, um die intrazellulären mechanischen Eigenschaften isolierter embryonaler Zebrafischzellen im dreidimensionalen Einschluss mit direkter Kraftmessung durch eine optische Falle zu untersuchen.

Direkte Kraftmessungen der subzellulären Mechanik im Einschluss mit optischen Pinzetten

Studien der Zellwandbiomechanik sind essentiell für das Verständnis des Pflanzenwachstums und der Morphogenese. Das folgende Protokoll wird vorgeschlagen, um dünne primäre Zellwände in den inneren Geweben junger Pflanzenorgane mittels Rasterkraftmikroskopie zu untersuchen.

Charakterisierung mechanischer Eigenschaften der primären Zellwand in lebenden Pflanzenorganen mittels Rasterkraftmikroskopie

Die Quantifizierung der Kontaktfläche und der Kraft, die von einer Rasterkraftmikroskop-Sondenspitze (AFM) auf eine Probenoberfläche ausgeübt wird, ermöglicht die Bestimmung der mechanischen Eigenschaften im Nanobereich. Best Practices zur Implementierung von AFM-Cantilever-basierter Nanoindentation in Luft oder Flüssigkeit an weichen und harten Proben zur Messung des Elastizitätsmoduls oder anderer nanomechanischer Eigenschaften werden diskutiert.

Rasterkraftmikroskopie Cantilever-basierte Nanoindentation: Messungen mechanischer Eigenschaften auf der Nanoskala in Luft und Flüssigkeit

Lernen Sie die Messung des Elastizitätsmoduls lebender Zellen mittels Atomic Force Microscopy. Diese Methode nutzt Kraftspektroskopie und Hertz-Modell-Fitting zur Erstellung einer 2D-Steifigkeitskarte für zellmechanische Studien.

Messung der mechanischen Eigenschaften von lebenden Zellen mit Atomic Force Microscopy

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