Messung der mechanischen Eigenschaften von lebenden Zellen mit Atomic Force Microscopy

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, den Elastizitätsmodul lebender Zellen mit Hilfe eines Rasterkraftmikroskops zu messen. Dies wird erreicht, indem zunächst eine FM-Kraftspektroskopie an verschiedenen Stellen der Zelle durchgeführt wird. In einem zweiten Schritt wird jede erzwungene Abstandskurve analysiert, um den Punkt zu bestimmen, an dem die A-FM-Spitze zunächst mit der Zelle in Kontakt kommt.

Als nächstes werden beginnend am Kontaktpunkt die ersten 200 bis 300 Nanometer der Eindringdaten an das Hertz-Modell angepasst. Um den Elastizitätsmodul zu extrahieren, liefern die Ergebnisse eine 2D-Karte der Zellsteifigkeit, die mit dem Force-Mapping-Modus erhalten wurde, bei dem jedes Pixel eine einzelne erzwungene Abstandskurve darstellt. Das Verfahren wird von Guen Thomas, einem Doktoranden aus meinem Labor, demonstriert. Um diesen Vorgang zu starten, reinigen Sie den Auslegerhalter mit 70 % Ethanol und lassen Sie ihn trocknen.

Laden Sie dann einen Bru DNP 10 Ausleger gemäß den Herstellerangaben in den A FM. Kalibrieren Sie als Nächstes die inverse Empfindlichkeit des optischen Hebels. Dieser Parameter beschreibt die Menge der Photodiodenreaktion in Volt pro Nanometer Cantilever-Auslenkung.

Laden Sie dazu zunächst einen sauberen Objektträger auf den Probentisch. Installieren Sie den FM-Kopf und stellen Sie den Laserstrahl und die Ausrichtung gemäß den Anweisungen des Herstellers ein. Nach dem Ausrichten die A FM-Spitze mit zurückgezogenem P acht O auf dem Glasschlitten einrasten.

Richten Sie den Spiegel auf eine Fotodiode mit minus zwei Volt aus. Führen Sie dann eine kraftspektroskopische Messung mit einer maximalen Photodiodenreaktion oder einem Triggerpunkt von positiven zwei Volt durch. Vergrößern Sie nach Abschluss der Datenerfassung den festen Kontaktbereich der Kraftkurve, und führen Sie eine lineare Anpassung an diesen Bereich durch.

Um die Steigung in Volt pro Nanometer zu ermitteln, setzen Sie die Spiegelausrichtung auf eine freie Auslenkung von null Volt zurück. Als nächstes kalibrieren Sie die Cantilever-Federkonstante mit der von Levy und Malam beschriebenen thermischen Abstimmungsmethode. Heben Sie den Scanner zunächst vom Probentisch weg, so dass es keine Wechselwirkungen zwischen der Spitze und der Probe gibt.

Erfassen Sie dann die thermischen Daten, indem Sie die thermische Schwingung des Auslegers aufzeichnen. Die A FM Software analysiert ein Leistungsspektrum einer solchen thermischen Schwingung und stellt es in einem Datenfenster dar. Führen Sie als Nächstes eine Anpassung an das Datensegment durch, das bei der niedrigsten Frequenz zentriert ist, die auch als fundamentale Resonanzspitze bezeichnet wird, um die Federkonstante zu bestimmen.

Um das a FM für die Kulturplatten vorzubereiten, installieren Sie ein Geschirrspülzubehör auf dem a FM Tisch und stellen Sie die Temperatur auf 37 Grad Celsius ein. Warten Sie 20 Minuten, bis das System ein stabiles thermisches Gleichgewicht erreicht hat. Stellen Sie nach dem Vorheizen eine Kulturschale auf den FM-Tisch und befestigen Sie sie mit der mit dem Schalenerhitzer gelieferten Klemme. Für Messungen von mehr als 30 Minuten sollte ein kohlendioxidunabhängiges Medium verwendet werden, um das normale Kulturmedium zu ersetzen.

Tragen Sie als Nächstes einen kleinen Tropfen 37 Grad Celsius heißes Kulturmedium auf die Spitze des A FM Cantilevers auf und senken Sie den A FM-Kopf, bis die Spitze gerade in Flüssigkeit eingetaucht ist. Mit einer CCD-Kamera aus der Vogelperspektive richten Sie den Laserstrahl auf dem Ausleger neu aus. Die Ausrichtung in einer Flüssigkeit unterscheidet sich von der in Luft aufgrund der Änderung des Brechungsindex des Mediums.

Nach dem Ausrichten setzen Sie die A FM-Spitze auf einen zellfreien Bereich der Kulturschale und führen Sie eine Kalibrierung der Empfindlichkeit des inversen optischen Hebels in der flüssigen Umgebung durch. Um mit der Messung der mechanischen Eigenschaften von Zellen zu beginnen, positionieren Sie die Cantilever-Spitze mit Hilfe eines Lichtmikroskops über der Perle-Augenregion einer Zelle. Eine präzise Einstellung der Position der Ausleger wird durch das Anwenden von Offsets auf die X- und Y-Scanner erreicht.

Schalten Sie dann den a FM in den Vier-Spektroskopie-Modus und stellen Sie die Eindringrate auf fünf Mikrometer pro Sekunde ein, was niedrig genug ist, um hydrodynamische Effekte zu vermeiden. Stellen Sie als Nächstes den Ablenkungstriggerpunkt auf zwei Nano-Newton ein. Um eine Beschädigung der Zellen zu vermeiden, passen Sie diesen Wert entsprechend der Probensteifigkeit an.

Wählen Sie zusätzlich die Option für die relative Triggerung, die eine Drift im Ablenksignal korrigiert. Stellen Sie dann den Kraftabstand auf fünf Mikrometer ein, um sicherzustellen, dass die Spitze zwischen den Kraftmessungen vollständig von der Zelle gelöst wird. Sammeln Sie für jede Bedingung drei Kraftkurven an verschiedenen Stellen im Kernbereich von mindestens 30 Zellen.

Obwohl es von Vorteil ist, mehrere Kurven für jede Zelle zu nehmen. Für zuverlässige statistische Daten kann die Entnahme von zu vielen zu Veränderungen der Zellsteifigkeit bis hin zur Belastung durch die A FM-Sonde führen. Charakterisieren Sie die Verteilung der mechanischen Eigenschaften in einer einzelnen Zelle weiter mit dem Force-Map-Modus.

Stellen Sie im Force-Map-Modus die Scangröße auf 30 Mikrometer und die Auflösung auf 32 x 32 ein, und die Einrückungsparameter sind die gleichen wie für einzelne Kraftkurven. Der A FM nimmt dann einzelne Kraftkurven an jedem Pixel im Beispielbereich auf und stellt eine Steifigkeitskarte des gesamten Bereichs bereit. Analysieren Sie als Nächstes die aufgezeichneten Kraftkurven mit MATLAB, um die Zellsteifigkeit zu berechnen.

Beginnen Sie mit der Übernahme eines Algorithmus, der zuerst von Lynette Al veröffentlicht wurde und sowohl eine lineare Anpassung als auch eine Hertz-Anpassung von jedem Punkt aus mit matlab berechnet. Berechnen Sie den relativen RMS-Fehler beider Passungen und summieren Sie diese Werte an jedem Punkt. Der Punkt, der den minimalen Gesamtanpassungsfehler erreicht, wird als erster Kontaktpunkt ausgewählt, wobei die Lokalisierung dieses Punktes für die genaue Messung des Elastizitätsmoduls der Zellen entscheidend ist.

Berechnen Sie als Nächstes das Verformungsdelta der Probe. Bei Verwendung der folgenden Gleichungen ist die Verformung vor dem Zellkontakt gleich Null, wobei Z kleiner als Z Null ist und gleich der Differenz zwischen der Auslenkung D und dem Gesamtabstand Z nach dem Kontaktpunkt ist. Berechnen Sie dann die Einrückungskraft F mit den folgenden Gleichungen, wobei die Kraft vor dem Zellkontakt gleich Null ist, wobei Z kleiner als Z Null ist und gleich der Federkonstante K des Auslegers multipliziert mit der Auslenkung des Auslegers über den Kontaktpunkt hinaus ist.

Die Anpassung des Elise-Quadrats wird dann auf die Verformungs- und Eindringkraftdaten der Probe im Nachkontaktbereich des Hertz-Modells angewendet, um den Elastizitätsmodul der Zelle basierend auf der gezeigten Form der verwendeten Spitze zu extrahieren. Hier sind repräsentative Kraftkurven von drei T-, Drei-Faserblasten-Zellen, die auf drei verschiedenen Oberflächen kultiviert wurden. Wie Sie hier sehen können, können unterschiedliche Oberflächen die Steifigkeit des Zellzytoskeletts stark beeinflussen.

Die durchschnittliche Verformung von Zellen, die auf einer Hartplastikoberfläche kultiviert wurden, ist rot dargestellt. Diejenigen, die auf einem steifen Polyacrylamid-Gel gezüchtet wurden, sind in Lila dargestellt, und diejenigen, die auf einem elastischen Poly-Acrylamid-Gel gezüchtet wurden, sind in Blau dargestellt. Nach sorgfältiger Identifizierung der Kontaktpunkte in den Kurven können die Eindringkräfte in Abhängigkeit von der Zellverformung genau dargestellt werden.

Darüber hinaus kann das Young's Modular I aus den ersten 300 Nanometern Eindringtiefe nach dem Kontakt genau berechnet werden. Hier ist ein Fibroblast zu sehen, der mit grün fluoreszierendem Protein transfiziert wurde, das mit Menton markiert ist, einer Art Zwischenfilament. Je heller das Bild, desto mehr Menton befindet sich in diesem Bereich.

Dies kann mit der Steifigkeit des Zellzytoskeletts zusammenhängen. Unter Verwendung der hier vorgestellten A-FM-Force-Mapping-Technik ist es möglich, eine ähnliche Steifigkeitskarte eines Fiberblasts mit einer Auflösung von 32 x 32 Pixeln zu zeigen, wobei jedes Pixel 2,5 x 2,5 Mikrometer Zelloberfläche darstellt. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, haben Sie eine gute Vorstellung davon, wie Sie die Rasterkraftmikroskopie verwenden können, um die Elastizität lebender Gewebezellen zu messen.