Messung der mechanischen Eigenschaften von lebenden Zellen mit Atomic Force Microscopy

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, den elastischen Modul lebender Zellen mithilfe eines Rasterkraftmikroskops zu messen. Dazu werden zunächst FM-Kraftspektroskopie-Messungen an verschiedenen Positionen auf der Zelle durchgeführt. Im zweiten Schritt wird jede Kraft-Abstand-Kurve analysiert, um den Punkt zu bestimmen, an dem die AFM-Spitze erstmals mit der Zelle in Kontakt kommt.

Als Nächstes werden die ersten 200 bis 300 Nanometer der Eindringtiefe-Daten ausgehend vom Kontakt­punkt an das Hertz-Modell angepasst. Um den elastischen Modul zu ermitteln, liefern die Ergebnisse eine zweidimensionale Karte der Zellsteifigkeit, die mithilfe des Kraft­abbildungs­modus erstellt wurde, wobei jedes Pixel eine einzelne Kraft-Abstand-Kurve darstellt. Den Ablauf dieses Verfahrens demonstriert Guen Thomas, ein Doktorand aus meinem Labor. Um dieses Verfahren zu beginnen, reinigen Sie den Cantilever-Halter mit 70 %igem Ethanol und lassen Sie ihn trocknen.

Danach einen bru DNP 10 Cantilever gemäß den Herstelleranweisungen in das A FM einsetzen. Anschließend die Empfindlichkeit des inversen optischen Hebelarms kalibrieren. Dieser Parameter beschreibt die Reaktion des Photodetektors in Volt pro Nanometer Cantileverauslenkung.

Um dies zu erreichen, laden Sie zunächst einen sauberen Glasobjektträger auf die Probenhalterung. Bringen Sie den FM-Kopf an und justieren Sie den Laserstrahl und die Ausrichtung gemäß den Herstelleranweisungen. Nach der Ausrichtung bringen Sie die FM-Spitze mit dem Glasobjektträger in Kontakt, wobei P acht O zurückgezogen ist.

Richten Sie den Spiegel so aus, dass das Photodiodensignal bei minus zwei Volt liegt. Führen Sie anschließend eine Kraftspektroskopiemessung mit einem maximalen Photodiodensignal oder Auslösepunkt von plus zwei Volt durch. Sobald die Datenaufnahme abgeschlossen ist, zoomen Sie in den Bereich des festen Kontakts der Kraftkurve hinein und führen Sie eine lineare Anpassung für diesen Bereich durch.

Um die Steigung in Volt pro Nanometer zu ermitteln, stellen Sie danach die Spiegeljustierung auf eine freie Auslenkung von null Volt zurück. Kalibrieren Sie anschließend die Federkonstante des Cantilevers mit der von Levy und Malam beschriebenen thermischen Abstimmungsmethode. Beginnen Sie damit, den Scanner vom Probenhalter wegzubewegen, sodass keine Wechselwirkungen zwischen der Spitze und der Probe auftreten.

Zeichnen Sie anschließend die thermischen Daten auf, indem Sie die thermische Schwingung des Kragträgers erfassen. Die AFM-Software analysiert ein Leistungsspektrum dieser thermischen Schwingung und stellt es in einem Datenfenster dar. Führen Sie danach eine Anpassung an den Datenabschnitt durch, der um die niedrigste Frequenz zentriert ist – auch bekannt als fundamentale Resonanzspitze –, um die Federkonstante zu bestimmen.

Um das a FM für die Kulturschalen vorzubereiten, installieren Sie ein Schalenheiz-Zubehör auf dem a FM-Objekttisch und stellen Sie die Temperatur auf 37 Grad Celsius ein. Warten Sie 20 Minuten, bis das System ein stabiles thermisches Gleichgewicht erreicht hat. Nach dem Vorheizen wird eine Kulturschale auf den a FM-Objekttisch gestellt und mit der mitgelieferten Klammer des Schalenheizers fixiert. Für Messungen, die länger als 30 Minuten dauern, sollte ein Kohlendioxid-unabhängiges Medium verwendet werden, um das normale Kulturmedium zu ersetzen.

Als Nächstes einen kleinen Tropfen Kulturmedium mit 37 Grad Celsius auf die Spitze des A FM-Kantas anbringen und den a FM-Kopf so absenken, dass die Spitze gerade unter die Flüssigkeitsoberfläche taucht. Mithilfe einer CCD-Kamera von oben den Laserstrahl auf dem Kanta ausrichten. Die Ausrichtung in Flüssigkeit unterscheidet sich von der in Luft aufgrund der Änderung des Brechungsindex des Mediums.

Nach der Ausrichtung platzieren Sie die A-FM-Spitze auf einem zellfreien Bereich der Kulturschale und kalibrieren die Empfindlichkeit der inversen optischen Hebelanordnung in der Flüssigumgebung. Um die Messungen der mechanischen Eigenschaften von Zellen zu beginnen, positionieren Sie die Cantileverspitze mithilfe eines optischen Mikroskops über dem Perle-Augen-Bereich einer Zelle. Präzise Anpassungen der Cantileverposition werden durch Anlegen von Versätzen an die X- und Y-Scanner erreicht.

Schalten Sie dann das FM in den Vier-Spektroskopie-Modus und stellen Sie die Eindrückgeschwindigkeit auf fünf Mikrometer pro Sekunde ein, was niedrig genug ist, um hydrodynamische Effekte zu vermeiden. Stellen Sie anschließend den Auslenkungsauslösepunkt auf zwei Nano-Newton ein. Um eine Beschädigung der Zellen zu vermeiden, passen Sie diesen Wert entsprechend der Probensteifheit an.

Wählen Sie außerdem die option der relativen auslösung, um eventuelle drifte im ablenkungssignal zu korrigieren. Stellen Sie dann den kraft-abstand auf fünf mikrometer ein, um sicherzustellen, dass die spitze zwischen den kraftmessungen vollständig von der zelle gelöst wird. Erfassen Sie drei kraftkurven an verschiedenen positionen im kernbereich von mindestens 30 zellen für jede bedingung.

Obwohl es vorteilhaft ist, mehrere Kurven an jeder Zelle aufzunehmen, kann die Aufnahme zu vieler Kurven aufgrund der Belastung durch die AFM-Sonde zu Veränderungen der Zellsteifigkeit führen. Charakterisieren Sie die Verteilung mechanischer Eigenschaften innerhalb einer einzelnen Zelle mithilfe des Kraftkarten-Modus weitergehend.

Stellen Sie im Kraftkartenmodus die Scan-Größe auf 30 Mikrometer, die Auflösung auf 32 × 32 und verwenden Sie dieselben Eindrückparameter wie bei einzelnen Kraftkurven. Das AFM nimmt dann an jedem Pixel des Probenbereichs einzelne Kraftkurven auf und liefert eine Steifigkeitskarte der gesamten Region. Analysieren Sie anschließend die aufgezeichneten Kraftkurven mithilfe von MATLAB, um die Zellsteifigkeit zu berechnen.

Beginnen Sie mit einem Algorithmus, der erstmals von Lynette Al veröffentlicht wurde und mithilfe von Matlab sowohl eine lineare Anpassung als auch eine Hertz-Anpassung für jeden Punkt berechnet. Berechnen Sie den relativen RMS-Fehler beider Anpassungen und summieren Sie diese Werte an jedem Punkt. Der Punkt, der den minimalen gesamten Anpassungsfehler aufweist, wird als Ausgangspunkt des Kontakts ausgewählt; die Lokalisierung dieses Punkts ist entscheidend für die genaue Bestimmung des Elastizitätsmoduls der Zelle.

Berechnen Sie anschließend die Probendeformation Delta. Verwenden Sie dazu die folgenden Gleichungen, wobei die Deformation vor dem Zellkontakt, wenn Z kleiner als Z null ist, gleich null ist und nach dem Kontakt gleich der Differenz zwischen der Cantileverauslenkung D und der Gesamtstrecke Z jenseits des Kontakt­punkts ist. Berechnen Sie dann die Eindrückkraft F mithilfe der folgenden Gleichungen, wobei die Kraft vor dem Zellkontakt, wenn Z kleiner als Z null ist, gleich null ist und nach dem Kontakt gleich der Federkonstante K des Cantilevers multipliziert mit der Cantileverauslenkung jenseits des Kontakt­punkts ist.

Elise Quadrat-Anpassung wird anschließend auf die Daten zur Probendeformation in Abhängigkeit von der Eindrückkraft im Bereich nach dem Kontakt gemäß dem Hertz-Modell angewendet, um den Elastizitätsmodul der Zelle basierend auf der verwendeten Spitzenform zu ermitteln. Hier sind repräsentative Kraftkurven, die von drei T3-Fibroblasten-Zellen stammen, die auf drei verschiedenen Oberflächen kultiviert wurden. Wie hier zu sehen ist, können unterschiedliche Oberflächen die Steifheit des zellulären Cytoskeletts stark beeinflussen.

Die durchschnittliche Verformung von Zellen, die auf einer harten Kunststoffoberfläche kultiviert wurden, ist in Rot dargestellt. Diejenigen, die auf einem steifen Polyacrylamid-Gel gewachsen sind, sind in Lila dargestellt, und diejenigen, die auf einem elastischen Polyacrylamid-Gel gewachsen sind, sind in Blau dargestellt. Nach sorgfältiger Identifizierung der Kontaktstellen in den Kurven können die eindringenden Kräfte als Funktion der Zellverformung genau dargestellt werden.

Außerdem lässt sich ihr E-Modul genau aus den ersten 300 Nanometern der Eindringtiefe nach Kontakt berechnen. Gezeigt ist hier ein Fibroblast, der mit dem grün fluoreszierenden Protein markierten Menton, einer Art intermediären Filament, transfiziert wurde. Je heller das Bild, desto mehr Menton befindet sich in diesem Bereich.

Das kann mit der Steifigkeit des zellulären Cytoskeletts in Zusammenhang stehen. Mithilfe der hier vorgestellten Kraft-Kartierungstechnik der AKA (AFM) lässt sich eine ähnliche Steifigkeitskarte eines Fibroblasten mit einer Auflösung von 32 mal 32 Pixeln darstellen, wobei jedes Pixel einen Bereich von 2,5 mal 2,5 µm² Zelloberfläche repräsentiert. Nach dem Anschauen dieses Videos werden Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie die Rasterkraftmikroskopie (Atomic Force Microscopy) zur Messung der Elastizität lebender Gewebezellen eingesetzt wird.