Sub-Nanometer Auflösung Belichtung mit Amplituden-Modulation der Rasterkraftmikroskopie in Liquid

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, mit einem handelsüblichen Rasterkraftmikroskop im Amplitudenmodulationsmodus, auch bekannt als Tapping-Modus, die höchstmögliche Auflösung bei der Bildgebung in Flüssigkeit zu erreichen. Diese Methode hilft dabei, die Grenzen des Standardbetriebs eines Rasterkraftmikroskops in Flüssigkeit zu erweitern, indem die optimale Kombination von Parametern für eine hohe Auflösung verwendet wird. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie mit den meisten handelsüblichen Rasterkraftmikroskopen eingesetzt werden kann und daher keine speziellen Geräte erfordert.

Die hier vorgestellte Methode richtet sich an Wissenschaftler und Techniker, die bereits über grundlegende Kenntnisse der AFM verfügen, aber mehr aus der Technik herausholen möchten. Diese Methode zielt nicht auf eine bestimmte Art von Probe ab und kann allgemein auf Proben aus Physik, Biologie, Chemie, Materialwissenschaften und Ingenieurwissenschaften angewendet werden. Im Allgemeinen werden Personen, die neu in dieser Technik sind, Schwierigkeiten haben, da es etwas Geduld erfordert, die besten Parameter für eine gegebene Probe zu finden.

Die Instrumente und die Scheibe, die das Substrat trägt, jeweils 10 Minuten lang im Ultrapure-Wasser im Ultraschallbad behandeln. Anschließend mit Isopropanol und erneut mit Ultrapure-Wasser, jeweils 10 Minuten. Wenn eine hohe Auflösung angestrebt wird, können Verunreinigungen nachteilige Folgen haben.

Tragen Sie stets Handschuhe und stellen Sie sicher, dass alle Oberflächen oder Instrumente, die mit der Probe, dem Cantilever oder der AFM-Zelle in Kontakt kommen, gründlich gereinigt werden. Trocknen Sie nach der Beschallung jedes Instrument und die Probenscheibe unter einem Strom von Stickstoff. Verwenden Sie eine Stahlscheibe als Träger für Glimmer, um einzelne adsorbierte Metallionen abzubilden.

Reinigen Sie die Oberflächen, die nicht durch Beschallung gereinigt werden können, physikalisch, indem Sie sie nacheinander mit einlagigen, wenig fusselnden Tüchern abwischen, die in ultrareinem Wasser, Isopropanol und erneut in ultrareinem Wasser getränkt sind. Lassen Sie die Oberfläche bis zu 30 Minuten lang an der Luft trocknen. Bereiten Sie anschließend eine kleine Menge Epoxidkleber vor, indem Sie die Reagenzien gründlich mischen, und geben Sie etwa 10 Mikroliter des Epoxids auf die saubere Stahlprobenplatte.

Platzieren Sie das Glimmer-Substrat auf dem Epoxidharz und befestigen Sie es durch Ausüben von Druck am Stahlplättchen. Lassen Sie das Epoxidharz gemäß den Herstellerangaben mehrere Stunden bei erhöhter Temperatur aushärten. Anschließend drücken Sie ein 2,5 cm breites Stück Klebeband fest auf das Substrat, sodass die gesamte Oberfläche bedeckt ist, und ziehen Sie die Deckschicht gleichmäßig ab.

Wiederholen Sie diesen Vorgang zwei bis drei Mal, bis die Glimmeroberfläche optisch spiegelglatt ist. Tauchen Sie den Cantilever-Chip nacheinander 60 Minuten lang in ein Bad aus Isopropanol und dann in ultrareines Wasser. Anschließend setzen Sie die Spitze bis zu fünf Minuten lang UV-Licht aus, um die Bildung stabiler Hydratationsstellen zu begünstigen.

Längere Überbelichtungszeiten können die Spitze beschädigen oder ihren Krümmungsradius vergrößern. Setzen Sie den Cantilever in den Cantileverhalter des AFM ein und pipettieren Sie 25 Mikroliter der Abbildungsflüssigkeit auf den Cantilever und die Spitze, um die Oberfläche vorzuwickeln. Dies verringert das Auftreten von Luftblasen beim Annähern an die Probe.

Schmelzen Sie die Probenplatte und das Substrat auf der Probenhalterung auf und geben Sie einen Tropfen der Abbildungsflüssigkeit auf die Probe. Anschließend verbinden Sie den Hebelhalter mit dem AFM. Bringen Sie den Hebel und die Probe nahe zueinander, sodass eine kapillare Brücke zwischen den Flüssigkeiten an der Hebelspitze und jenen auf der Probe entsteht.

Verwenden Sie die AFM-Software, um den Messlaser nahe dem Spitzenende des Cantilevers auszurichten. Anschließend ermitteln Sie die Resonanzfrequenz des Cantilevers aus dem Hauptpeak im thermischen Spektrum. Falls die Ablenkung des Cantilevers kalibriert ist, liefert die Anpassung des Resonanzpeaks mit einem einfachen harmonischen Oszillatormodell die Federkonstante des Cantilevers.

Danach justieren Sie den Cantilever, indem Sie seine Amplitudenantwort ermitteln, wenn er über einen Frequenzbereich nahe der im thermischen Spektrum bestimmten Resonanzfrequenz extern angeregt wird. Stellen Sie die Anregungsamplitude so ein, dass die Amplitude der freien Schwingung etwa fünf Nanometer beträgt. Dies entspricht typischerweise 0,2–0,8 Volt bei den meisten AFMs.

Danach stellen Sie den Amplituden-Sollwert auf etwa 80 % der freien Amplitude ein. Anschließend stellen Sie die Rückkopplungsverstärkung relativ hoch ein. Nachdem sichergestellt ist, dass keine Instabilität oder Überschwingungen auftreten, stellen Sie die anfängliche Abtastrate auf etwa ein Hertz und die Scan-Größe auf 10 Nanometer ein.

Starten Sie die Annäherung der Spitze an die Oberfläche mithilfe der AFM-Steuerungssoftware. Beurteilen Sie, ob die Spitze die Oberfläche erreicht hat, ohne mit der Abbildung zu beginnen, indem Sie den Sollwert leicht verändern. Wenn sich die Spitze an der Oberfläche befindet, sollte sich dies nur geringfügig auf die Ausdehnung der ZPA-Zone auswirken.

Sobald die Spitze die Oberfläche erreicht hat, fahren Sie die ZPA-Zone zurück und stellen Sie den Cantilever erneut ein. Die Resonanzfrequenz hat sich wahrscheinlich auf einen niedrigeren Wert verschoben, bedingt durch Wechselwirkungen zwischen Spitze und Probe. Ändern Sie nun den Sollwert auf etwa 80 % der neu eingestellten freien Amplitude und senken Sie den Cantilever ab, um einen 10 mal 10 Nanometer großen Quadrat-Scan der Oberfläche im Amplitudenmodulationsmodus durchzuführen, um zu überprüfen, ob die Bildgebungsparameter geeignet sind.

Überprüfen Sie, ob die Vorwärts- und Rückwärtsprofile übereinander liegen. Wenn nicht, verringern Sie den Sollwert weiter und versuchen Sie, die Verstärkung zu erhöhen. Wenn das Bild verrauscht wird, senken Sie die Verstärkung.

Wiederholen Sie den Vorgang mit einem großen Bereich von einem bis fünf Quadratmikrometern der Probe, sofern dies möglich ist. Bei weichen oder biologischen Proben kann dies zu einer Kontamination der Spitze führen. Verringern Sie die Scan-Größe auf einen geeigneten Wert, um die interessierenden Strukturen sichtbar zu machen.

Dies kann so gering wie 20 mal 20 Nanometer sein. Verringern Sie anschließend die Anregungsamplitude des Cantilevers ausreichend, damit die Rückkopplungsschleife automatisch die ZPA-Zone zurückzieht und die Spitze von der Oberfläche löst. Während sich der Cantilever von der Oberfläche entfernt, stellen Sie die Anregungsamplitude so ein, dass die Amplitude des Cantilevers ein bis zwei Nanometer von Spitze zu Spitze beträgt.

Verringern Sie den Sollwert schrittweise in kleinen Schritten, bis sich die ZPA-Zone erneut in Richtung Oberfläche ausdehnt und das ursprüngliche Bild wiederhergestellt ist. Halten Sie die Sollwertamplitude zwischen 75 % und 95 % der neuen Freien Amplitude. Stellen Sie danach die Verstärkungen erneut ein, da bei niedrigeren Amplituden höhere Verstärkungen verwendet werden können, ohne signifikantes Rauschen einzuführen.

Optimieren Sie das System, um die beste Kombination aus freier Amplitude, Sollwert und Verstärkung für eine hohe Auflösung zu finden. Die optimalen Systembedingungen hängen von der Probe, den Benetzungseigenschaften der Flüssigkeit und auch vom verwendeten Cantilever ab. Verwenden Sie für solvophile Grenzflächen Cantilever mit einer Federkonstante von 0,5 bis zwei Newton pro Meter.

Mithilfe dieser Technik wurden über einen breiten Bereich von Proben hinweg Bilder mit subnanometrischer Auflösung erhalten. Zu den hier gezeigten weichen Proben gehören eine Lipiddoppelschicht, purpurne Membranen von Halobacterium salinarum, ein selbstassemblierter Monolayer amphiphiler Dimoleküle und Aquaporin-Kristalle aus einer Rinderlinsenmembran. In jedem Fall sind die interessierenden Strukturen hervorgehoben.

Die kleinen Schwingungsamplituden und hohen Sollwerte minimieren die Kraft, die die Spitze auf die Probe ausübt, wodurch die empfindlichen Selbstassemblierungen von Lipiden in der Doppelschicht, Proteinen in nativen Biomembranen und amphiphilen Molekülen in Lösung ohne Beschädigung abgebildet werden können. Hartere kristalline Materialien wie Calcit, Strontiumtitanat, Siliciumcarbid und einzelne Metallionen, die auf einer Glimmeroberfläche adsorbiert sind, können mit diesem Ansatz abgebildet werden, da in jedem Fall effektiv die Grenzflüssigkeit abgebildet wird, nicht der Kristall selbst. Sobald die Technik beherrscht ist, liefert sie nahezu jedes Mal bei korrekter Durchführung eine Auflösung auf molekularer oder atomarer Ebene in Flüssigkeit.

Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig zu beachten, dass die Grenzflüssigkeit abgebildet wird. Dies erfordert schonende Bildgebungsbedingungen. In der Regel ist die Kontamination der Spitze, der Probe oder der Flüssigkeit die Hauptursache dafür, dass keine hohe Auflösung erzielt wird.

Falls Zweifel bestehen, ist es oft ratsam, alle Oberflächen, die mit der Flüssigkeit in Kontakt kommen, zu reinigen und die Abbildungslösungen erneut zu verwenden. Externe Störgeräusche beeinträchtigen ebenfalls die hohe Auflösung. Ein Boden mit geringen Vibrationen, der sich fern eines Lüftungskanals befindet, ist besser geeignet.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie Ihre Bildgebungsparameter optimieren können, um eine hochauflösende Rasterkraftmikroskopie (AFM) zu erzielen. Wie bei jeder modernen Technik kann es natürlich mehrere Versuche erfordern, um herauszufinden, wie eine Probe am besten abgebildet wird; daher ist Geduld entscheidend.