Sub-Nanometer Auflösung Belichtung mit Amplituden-Modulation der Rasterkraftmikroskopie in Liquid

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die höchstmögliche Auflösung der Bildgebung in Flüssigkeit zu erreichen, mit einem kommerziellen AFM-Betrieb und Amplitudenmodulation, auch bekannt als Klopfmodus. Diese Methode trägt dazu bei, die Grenzen des Standard-AFM-Betriebs in Flüssigkeiten zu erweitern, indem die beste Kombination von Parametern für eine hohe Auflösung verwendet wird. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie mit den meisten kommerziellen Rasterkraftmikroskopen verwendet werden kann und daher keine spezielle Ausrüstung erfordert.

Die hier vorgestellte Methode richtet sich an Wissenschaftler und Techniker, die bereits über einige Grundkenntnisse in der AFM verfügen, aber mehr aus der Technik herausholen möchten. Diese Methode ist nicht auf eine bestimmte Art von Probe ausgerichtet und kann breit auf Proben aus Physik, Biologie, Chemie, Material- und Dienstleistungswissenschaften angewendet werden. Im Allgemeinen werden Personen, die mit dieser Technik noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten haben, da es etwas Geduld erfordert, die besten Parameter für eine bestimmte Probe zu finden.

Die Instrumente und die Scheibe, die das Substrat stützt, werden im Bad in Reinstwasser beschallt. Gefolgt von Isopropanol und wieder ultrareinem Wasser, jeweils 10 Minuten lang. Wenn eine hohe Auflösung angestrebt wird, kann jede Kontamination nachteilige Folgen haben.

Tragen Sie immer Handschuhe und stellen Sie sicher, dass alle Oberflächen oder Instrumente, die mit der Probe, dem Cantilever oder der AFM-Zelle in Berührung kommen, gründlich gereinigt werden. Trocknen Sie nach der Beschallung jedes der Instrumente und die Probenscheibe unter einem Stickstoffstrom. Verwenden Sie eine Stahlscheibe als Träger für Glimmer, um einzelne absorbierte Metallionen abzubilden.

Reinigen Sie die Oberflächen, die nicht durch Ultraschall gereinigt werden können, physisch, indem Sie sie nacheinander mit einlagigen, fusselarmen Taschentüchern abwischen, die in ultrareinem Wasser, Isopropanol und ultrareinem Wasser getränkt sind. Lassen Sie die Oberfläche bis zu 30 Minuten an der Luft trocknen. Bereiten Sie anschließend eine kleine Menge Epoxidkleber vor, indem Sie die Reagenzien gründlich mischen, und geben Sie etwa 10 Mikroliter des Epoxidharzes auf die Probenscheibe aus sauberem Stahl.

Legen Sie das Glimmersubstrat auf das Epoxidharz und befestigen Sie es mit Druck auf das Substrat auf der Stahlscheibe. Lassen Sie das Epoxidharz mehrere Stunden bei erhöhter Temperatur gemäß den Herstellerangaben aushärten. Drücken Sie dann ein 2,5 Zentimeter breites Stück Klebeband fest auf den Untergrund, so dass das gesamte Gesicht bedeckt ist, und ziehen Sie die oberste Schicht glatt ab.

Wiederholen Sie diesen Vorgang zwei- bis dreimal, bis der Glimmer für das Auge spiegelglatt ist. Tauchen Sie den Cantilever-Chip für jeweils 60 Minuten in ein Bad mit Isapropanol, gefolgt von ultrareinem Wasser. Setzen Sie die Spitze dann bis zu fünf Minuten lang UV-Licht aus, um die Bildung stabiler Hydratationsstellen zu begünstigen.

Längere Überbelichtungszeiten können die Spitze beschädigen oder ihren Krümmungsradius vergrößern. Setzen Sie den Ausleger in den Auslegerhalter des AFM ein und pipettieren Sie 25 Mikroliter der Bildgebungsflüssigkeit auf den Ausleger und die Spitze, um die Oberfläche vorzubefeuchten. Dadurch wird das Auftreten von Luftblasen reduziert, wenn man sich der Probe nähert.

Schmelzen Sie die Probenscheibe und das Substrat auf dem Probentisch und geben Sie einen Tropfen der Bildgebungsflüssigkeit auf die Probe. Verbinden Sie dann den Auslegerhalter mit dem AFM. Der Cantilever, die Probe und die Probe sind so nahe beieinander zu bringen, dass eine Kapillarbrücke zwischen den Flüssigkeiten an der Cantilever-Spitze und denen an der Probe entsteht.

Verwenden Sie die AFM-Software, um den Messlaser nahe am Spitzenende des Auslegers auszurichten. Ermitteln Sie als Nächstes die Verweilfrequenz des Cantilevers vom Hauptpeak in seinem thermischen Spektrum. Wenn die Auslenkung des Auslegers kalibriert ist, ergibt sich durch die Anpassung der Verweilspitze an ein einfaches harmonisches Oszillatormodell die Federkonstante des Auslegers.

Stimmen Sie dann den Cantilever, indem Sie seinen Amplitudengang ermitteln, wenn er extern über einen Frequenzbereich angesteuert wird, der nahe der im thermischen Spektrum identifizierten Resonanzfrequenz liegt. Stellen Sie die Ansteueramplitude so ein, dass die freie Schwingungsamplitude etwa fünf Nanometer beträgt. Dies entspricht typischerweise 0,2-0,8 Volt bei den meisten AFMs.

Stellen Sie dann den Amplitudensollwert auf etwa 80 % der freien Amplitude ein. Stellen Sie als Nächstes die Feedback-Verstärkungen relativ hoch ein. Nachdem Sie sichergestellt haben, dass keine Instabilität oder Klingeleffekte auftreten, stellen Sie die anfängliche Abtastrate auf etwa ein Hertz und die Abtastgröße auf 10 Nanometer ein.

Starten Sie die Annäherung der Spitze an die Oberfläche mit der AFM-Steuerungssoftware. Beurteilen Sie, ob die Spitze die Oberfläche erreicht hat, ohne mit dem Abbild zu beginnen, indem Sie den Sollwert leicht ändern. Befindet sich die Spitze an der Oberfläche, sollte die Auswirkung auf die Ausdehnung der ZPA-Zone vernachlässigbar sein.

Sobald die Spitze die Oberfläche erreicht hat, ziehen Sie die ZPA-Zone zurück und stimmen Sie den Ausleger neu ab. Die Resonanzfrequenz hat sich wahrscheinlich aufgrund von Wechselwirkungen mit der Spitzenprobe auf einen niedrigeren Wert verschoben. Ändern Sie nun den Sollwert auf etwa 80 % der neu abgestimmten freien Amplitude und aktivieren Sie den Cantilever, um einen 10 x 10 Nanometer großen quadratischen Scan der Oberfläche im Amplitudenmodulationsmodus durchzuführen, um zu überprüfen, ob die Bildgebungsparameter geeignet sind.

Stellen Sie sicher, dass die Ablaufverfolgungs- und Rückverfolgungsprofile überlagert werden. Wenn nicht, reduzieren Sie den Sollwert weiter und versuchen Sie, die Verstärkung zu erhöhen. Wenn das Bild verrauscht wird, verringern Sie die Verstärkungen.

Wiederholen Sie den Vorgang mit einem großen Bereich von ein bis fünf Mikrometern im Quadrat der Probe, sofern dies möglich ist. Bei weichen oder biologischen Proben kann dies zu einer Kontamination der Spitze führen. Reduzieren Sie die Scan-Größe auf einen Wert, der für die Visualisierung der interessierenden Features geeignet ist.

Diese kann bis zu 20 mal 20 Nanometer betragen. Reduzieren Sie als Nächstes die Antriebsamplitude des Auslegers so weit, dass die Rückkopplungsschleife die ZPA-Zone automatisch zurückzieht und die Spitze von der Oberfläche abhebt. Während der Cantilever, der von der Oberfläche entfernt ist, stellen Sie die Antriebsamplitude so ein, dass die Cantilever-Amplitude ein bis zwei Nanometer von Spitze zu Spitze beträgt.

Reduzieren Sie den Sollwert schrittweise in kleinen Schritten, bis sich die ZPA-Zone wieder in Richtung Oberfläche erstreckt und das Originalbild wiederhergestellt wird. Halten Sie die Sollwertamplitude zwischen 75 % und 95 % der neuen freien Amplitude. Passen Sie dann die Verstärkungen neu an, da höhere Verstärkungen bei niedrigeren Amplituden verwendet werden können, ohne dass erhebliches Rauschen entsteht.

Optimieren Sie das System, um die beste Kombination aus freier Amplitude, Sollwert und Verstärkung für eine hohe Auflösung zu finden. Die optimalen Systembedingungen hängen von der Probe, den Benetzungseigenschaften der Flüssigkeit und auch vom verwendeten Ausleger ab. Verwenden Sie für solvophile Grenzflächen Ausleger mit einer Federkonstante von 0,5 bis zwei Newton pro Meter.

Mit dieser Technik wurden Bilder mit einer Auflösung von unter einem Nanometerbereich über einen breiten Bereich von Proben erhalten. Zu den hier gezeigten weichen Proben gehören eine Lipiddoppelschicht, violette Membranen aus Halobacterium salinarum, eine selbstorganisierte Monoschicht aus amphophilen Dimolekülen und Aquaporinkristalle aus einer Rinderlinsenmembran. In jedem Fall werden die interessanten Merkmale hervorgehoben.

Die kleinen Schwingungsamplituden und hohen Sollwerte minimieren die von der Spitze auf die Probe ausgeübte Kraft, so dass die fragilen Selbstanordnungen von Lipiden in der Doppelschicht, Proteinen in nativen Biomembranen und amphophilen Molekülen in Lösung ohne Beschädigung abgebildet werden können. Härtere kristalline Materialien wie Calcit, Strontiumtitanit, Siliziumkarbid und einzelne Metallionen, die auf einer Glimmeroberfläche absorbiert werden, können mit diesem Ansatz abgebildet werden, da in jedem Fall die Grenzflächenflüssigkeit effektiv abgebildet wird, nicht der Kristall selbst. Einmal gemeistert, bietet diese Technik fast jedes Mal, wenn sie korrekt ausgeführt wird, eine Auflösung auf molekularer oder atomarer Ebene in Flüssigkeiten.

Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, sich vor Augen zu halten, dass es sich um die Grenzflächenflüssigkeit handelt, die abgebildet wird. Das bedeutet, dass weiche Bildgebungsbedingungen verwendet werden müssen. Die Kontamination der Spitze, der Probe oder der Flüssigkeit ist in der Regel die Hauptursache dafür, dass keine hohe Auflösung erreicht wird.

Im Zweifelsfall ist es oft eine gute Idee, alle Oberflächen, die mit der Flüssigkeit in Berührung kommen, zu reinigen und bildgebende Lösungen wiederzuverwenden. Externes Rauschen wirkt sich auch nachteilig auf eine hohe Auflösung aus. Besser ist ein vibrationsarmer Boden, der sich von einem Lüftungskanal entfernt befindet.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie Ihre Bildgebungsparameter optimieren können, um ein hochauflösendes AFM zu erzielen. Wie bei jeder hochmodernen Technik kann es natürlich mehrere Versuche erfordern, um herauszufinden, wie eine Probe am besten abgebildet werden kann, daher ist Geduld der Schlüssel.