Erstellung von Qualitäts-Inositol Pyrophosphate
September 3rd, 2011
Inositol Pyrophosphate spielen eine wichtige Rolle in der menschlichen Krankheiten wie Krebs, Diabetes und Fettleibigkeit, jedoch ist der genaue Wirkungsmechanismus umstritten. Das Fehlen von kommerziell erhältlichen Inosit Pyrophosphate macht detaillierte Studien problematisch. Hier beschreiben wir ein einfaches Protokoll, zu produzieren und zu isolieren Milligramm Inosit Pyrophosphate.
Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist die Erzeugung und Reinigung von hochwertigem und Noolpyrophosphat. Dies wird erreicht, indem zunächst IP sechs als Substrat für die IP sechs Kinase verwendet wird, ein Enzym zur Erzeugung von IP sieben. Als nächstes werden die enzymatischen Reaktionen auf ein Polyamidgel geladen und die Bande, die IP sieben entspricht, herausgeschnitten.
Das IP seven wird dann durch nachfolgende Dehydratations-Hydratationszyklen isoliert. Der letzte Schritt des Verfahrens besteht darin, die Reinheit des Produkts zu bestätigen und die Konzentration zu bestimmen. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die die biologische Aktivität von IP sieben durch Inkubation von IP sieben zeigen.
Mit VIP einer Kinase und mit der IP sieben Phosphatase DDP eins erzeugen diese Reaktionen IP acht bzw. IP sechs. Tun Sie dies, Met kann Einblicke in die IP-Sieben-Signalisierung geben. Es kann auch auf andere Systeme angewendet werden, z. B. in Teilen von Phosphaten wie IP acht oder dem von IP fünf abgeleiteten PPIP vier.
Dieses Protokoll beginnt mit der Vorbereitung enzymatischer Reaktionen, bei denen IP sechs Kinase eins oder VIP eins IP sechs in die pyrophosphoverwandten Isoformen umwandelt. Für diese Demonstration wurden Histamin-markierte IP 6-, Kinase-Eins- und GST-markierte VIP-Eins-Enzyme gemäß einem zuvor beschriebenen Verfahren von E-coli aufgereinigt. Zu Beginn bereiten Sie 10 bis 20 unabhängige enzymatische Reaktionen vor, die IP sechs und seine IP sechs Kinase eins oder GST VIP enthalten, wie im schriftlichen Protokoll beschrieben.
Stellen Sie das Volumen auf 50 Mikroliter mit milli Q doppelt destilliertem Wasser ein. Nach kurzem Drehen der Röhrchen werden die Reaktionen über Nacht bei 37 Grad Celsius mit Rotation inkubiert. Bereiten Sie das Polyacrylamid-Gel-Gerät mit 24 Zentimeter langen, 18 Zentimeter breiten Glasplatten, 1,5 Millimeter breiten Zwischenräumen und einem Kamm mit 16 Bahnen vor.
Gießen Sie anschließend eine zuvor vorbereitete Gellösung mit einem Volumen von 50 Millilitern pro Gel zwischen die vorgegossenen Glasplatten. Führen Sie den Kamm ein und lassen Sie das Gel 30 bis 60 Minuten bei Raumtemperatur polymerisieren. Sobald das Gel polymerisiert ist, bringen Sie das Gerät in den Kühlraum.
Lassen Sie das Gel in einmal FSME für ca. 30 bis 60 Minuten bei 200 bis 300 Volt vorlaufen, währenddessen einmal orangefarbenen G-Farbstoff. Für jede Reaktion ist eine Standardkontrollprobe vorzubereiten, die zwei mol IP sechs enthält. Nach dem Vorlauf jede Mulde gründlich mit Laufpuffer waschen.
Verwenden Sie eine Spritze, die an einer 21-Gauge-Nadel befestigt ist, um Niederschlag zu entfernen. Laden Sie dann die Proben in das Gel, um zu vermeiden, dass die ersten beiden und letzten beiden Spuren des Gels geladen werden. Lassen Sie das Gel schließlich über Nacht mit sieben Milliampere pro Gel laufen, bis sich das orangefarbene G-Farbstoffband innerhalb der letzten 10 Zentimeter vom Boden des Gels befindet.
Um mit der Isolierung von IP sieben zu beginnen, zerlegen Sie das Gelgerät und entfernen Sie vorsichtig eine Glasplatte, wobei das Gel auf der anderen verbleibt. Schneiden Sie einen kleinen Teil des Gels von knapp oberhalb des orangefarbenen GD-Bandes nach unten, einschließlich des IP Six-Standards und einer Probenspur. Färben Sie den abgeschnittenen Teil des Gels einige Minuten lang mit Toluidinblau, bis das Anatol-Pyrophosphat-Band erscheint.
Legen Sie in der Zwischenzeit die zuvor entfernte Glasplatte wieder auf das Gel, um ein Austrocknen des fleckenfreien Gels zu verhindern. Übertragen Sie den gefärbten Teil des Gels für einige Minuten in eine DES-Färbelösung, um überschüssiges Toluidinblau wegzuwaschen, und positionieren Sie dann das Gel mit dem ungefärbten Gel neu. Das IP-Siebenband sollte sichtbar sein, da es etwas langsamer läuft als der IP-Sechs-Standard. Ein TP, der schneller als IP sechs läuft, sollte ebenfalls sichtbar sein.
Schneiden Sie anschließend mit einer Rasierklinge das IP Seven-Band auf dem fleckenfreien Teil des Gels ab. Nutzen Sie die mit dem Fleckengel ermittelte IP sieben-Migrationsposition aus. Um die Position der IP-Sieben-Bande zu schätzen, geben Sie die IP-Sieben-Bande, die aus dem Gel geschnitten wurde, in ein 15-Milliliter-Röhrchen und fügen Sie 10 Milliliter Milli Q doppelt destilliertes Wasser hinzu.
Die Röhrchen nach der Inkubation 10 Minuten lang bei Raumtemperatur drehen, die Flüssigkeit durch Dekantieren verwerfen, um überschüssige FSME- und mikroskopisch kleine Acrylamidpartikel zu entfernen. Führen Sie anschließend zwei Dehydratisierungs-Hydratationszyklen durch, indem Sie zuerst fünf Milliliter 50%Methanol in das Röhrchen mit dem IP Seven-Gel geben. Drehen Sie die Probe zwei Stunden lang bei Raumtemperatur.
Füllen Sie dann die Gelscheibe in ein neues 15-Milliliter-Röhrchen mit fünf Millilitern Milli Q doppelt destilliertem Wasser und drehen Sie sie zwei Stunden lang bei Raumtemperatur. Bewahren Sie das methanolhaltige Röhrchen für die weitere Verwendung nach der Inkubation auf. Wiederholen Sie den Hydratationszyklus der Dehydrierung noch einmal, um die eluierte IP sieben zu konzentrieren.
Kombinieren Sie die zuvor hinzugefügten fünf Milliliter Wasser und fünf Milliliter 50%Methanol. Trocknen Sie die kombinierte Lösung mit einem auf 60 Grad Celsius erhitzten Speedvac. Sobald die Proben fast trocken sind, geben Sie die restliche Flüssigkeit in ein 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen.
Drehen Sie das Rohr zwei Minuten lang mit 5.000 Umdrehungen pro Minute. Sammeln Sie das SUP-Natant und lassen Sie die unteren 20 bis 30 Mikroliter übrig, da es Acrylamidpartikel enthalten kann. Übertragen Sie die Probe in ein frisches 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen.
Setzen Sie den Trocknungsprozess bei Bedarf mit einem unbeheizten Geschwindigkeitssauger fort. Die Wiederfindung von IP sieben wird drastisch reduziert, wenn die Proben vollständig trocknen. Daher ist es zwingend erforderlich, den Trocknungsprozess zu beenden, wenn die Proben ein Volumen von 100 bis 300 Mikrolitern erreichen.
Sobald die isolierte IP sieben geborgen wurde, laden Sie zwei bis fünf Mikroliter der Probe auf ein Page-Gel, um ihre Konzentration und Reinheit zu bestimmen. Laden Sie mehrere Verdünnungen von IP sechs als Konzentrationsstandards und vier mol Polypmarker. Nachdem Sie das Gel ausgeführt haben, visualisieren Sie die anfänglichen Pyrophosphat-Isoformen, indem Sie das gesamte Gel mit Toluidinblau-Lösung färben und entfärben.
Nach dem eben beschriebenen Verfahren nach der Toluidin-Färbung können die Konzentrationen bestimmt werden, indem das Gel gescannt und die Intensitätsunterschiede zwischen IP sechs und IP sieben verglichen werden. Mit Hilfe von Bildgebungssoftware wie Image J wird die präparative enzymatische Umwandlung von IP sechs in IP sieben durchgeführt. Mit IP six kinase one und VIP one können Enzyme durch Seitenanalyse leicht aufgelöst werden.
Die Beladung mit IP sechs als Größenkontrolle zusammen mit der Toluidinblau-Gel-Färbung ermöglicht die Identifizierung der pyrophosphorylierten Derivate. Da sie je nach Anzahl der auf der Initiale vorhandenen Phosphatgruppen langsamer laufen, führte das oben beschriebene Verfahren zu einer einfachen Aufreinigung von IP sieben. Darüber hinaus ergab die seitenweise Analyse des gereinigten Anatolpyrophosphats die Reinheit des IP Seven.
Interessanterweise wandert das eine Drei-Pyrophosphat-IP-Fünf-Isomer des IP-Sieben-Produkts von VIP eins etwas langsamer als das Fünf-Pyrophosphat-IP-Fünf-Isomer von VIP sieben, das von IP sechs Kinase eins erzeugt wird. Die Verwendung der IP-Sechs-Standards ermöglicht eine einfache Quantifizierung der Konzentration des gereinigten IP sieben vor dem Einsatz von IP sieben. Für weitere Experimente kann seine biologische Aktivität beurteilt werden. Fünf.
Pyrophosphat IP fünf wird routinemäßig mit FIP eins und mit IP sieben Phosphatase DDP eins inkubiert. Die gereinigte IP sieben wird von VIP one in IP acht und von DDP one in IP sechs umgewandelt. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden, wie z.B. eine verlängerte Tolin-in-Blau-Färbung, durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen wie die Isolierung von IP 8 oder anderen phosphorylierten in Isoformen zu beantworten.
Übersicht
Dieser Artikel präsentiert ein Protokoll für die Herstellung und Isolierung von Inositolpyrophosphaten, insbesondere IP sieben, die bei verschiedenen menschlichen Pathologien wichtig sind. Die Methode beinhaltet enzymatische Reaktionen und Gelelektrophorese zur Reinigung der Verbindung.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Biochemie
- Zellbiologie
- Neurowissenschaften
Hintergrund
- Inositolpyrophosphate sind an Krankheiten wie Krebs, Diabetes und Fettleibigkeit beteiligt.
- Die Wirkungsmechanismen dieser Verbindungen bleiben unklar.
- Kommerziell erhältliche Inositolpyrophosphate fehlen, was die Forschung erschwert.
- Diese Studie zielt darauf ab, ein zuverlässiges Protokoll für deren Isolierung bereitzustellen.
Zweck der Studie
- Entwicklung einer einfachen und effektiven Methode zur Herstellung und Isolierung von Inositolpyrophosphaten.
- Erleichterung weiterer Forschung zu den biologischen Rollen dieser Verbindungen.
- Ermöglichung der Untersuchung von Signalwegen, die IP sieben beinhalten.
Verwendete Methoden
- Enzymatische Umwandlung von IP sechs zu IP sieben unter Verwendung spezifischer Kinasen.
- Polyacrylamid-Gelelektrophorese zur Trennung und Reinigung.
- Färbe- und Visualisierungstechniken zur Bestätigung der Produktreinheit.
- Quantifizierung isolierter Verbindungen mittels Bildgebungssoftware.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Isolierung von IP sieben aus enzymatischen Reaktionen.
- Überprüfung der Reinheit und Konzentration durch Gelanalyse.
- Demonstration der biologischen Aktivität von IP sieben.
- Erkenntnisse zu den Signalmechanismen, die Inositolpyrophosphate beinhalten.
Schlussfolgerungen
- Das entwickelte Protokoll ermöglicht eine effiziente Herstellung von Inositolpyrophosphaten.
- Diese Methode kann das Verständnis ihrer biologischen Bedeutung verbessern.
- Zukünftige Studien können dieses Protokoll nutzen, um verwandte Verbindungen zu untersuchen.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Reliable access to high-purity inositol pyrophosphates such as IP7 is critical for elucidating their regulatory roles in cellular signaling and post-translational modification. The described PAGE-based isolation method addresses a key bottleneck in early discovery by enabling reproducible production and quantification of these signaling molecules. This capability supports mechanistic de-risking and target validation in pathways relevant to metabolic regulation, vesicular trafficking, and disease-associated signaling.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of inositol pyrophosphate-mediated signaling pathways for target validation.
- Facilitates mechanistic studies of post-translational modifications involving pyrophosphate transfer.
- Supports predictive confidence in pathway modulation by providing pure, quantifiable analytes.
Screening & Assay Development
- Provides standardized, high-purity IP7 for use as a control or substrate in biochemical assays.
- Enables reproducible quantification and purity assessment via PAGE and staining.
- Supports assay development for enzymes such as kinases and phosphatases acting on inositol pyrophosphates.
Translational & Preclinical Research
- Allows investigation of disease-relevant processes regulated by inositol pyrophosphates, such as insulin secretion and phosphate homeostasis.
- Facilitates continuity from discovery to preclinical validation by enabling functional studies of purified analytes.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by clarifying molecular mechanisms in disease models.
Pipeline & Workflow Integration
This PAGE-based isolation method integrates into the discovery continuum from target validation through assay development and translational research.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling direct study of inositol pyrophosphate function.
- Screening: Provides assay-ready, quantifiable standards for evaluating enzyme activity and substrate specificity.
- Analytics: Delivers quantitative purity and concentration data via gel-based imaging and densitometry.
- Translational Research: Enables mechanistic studies in disease-relevant systems where inositol pyrophosphates modulate key cellular processes.
- Enterprise Reuse: Establishes a reproducible workflow for generating multiple inositol pyrophosphate isoforms for diverse R&D needs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in signaling pathway studies.
- Operational Value: Standardizes production and quantification of inositol pyrophosphates for cross-lab reproducibility.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making by enabling robust target validation and pathway de-risking.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of targets and pathways for further development.
Implementation Considerations
- Requires expertise in enzymatic reaction setup and PAGE operation.
- Needs access to polyacrylamide gel electrophoresis and imaging infrastructure.
- Demands rigorous cross-team standardization for reproducible quantification and purity assessment.
- Adaptable to different inositol pyrophosphate isoforms with protocol modifications as supported by the source.
- Recovery and purity depend on careful control of dehydration and staining steps as described.
