Interferenzreflexionsmikroskopie zur markierungsfreien Visualisierung der Mikrotubuli-Dynamik

Die Interferenzreflexionsmikroskopie ermöglicht die Abbildung von Mikrotubuli, die dynamisch wachsen und schrumpfen.

Befestigen Sie Paraffinstreifen auf einem Deckglas und legen Sie ein etwas kleineres Deckglas darauf. Erhitzen Sie, um das Paraffin zu schmelzen und einen versiegelten Kanal zu bilden. Pipettieren Sie eine antikörperhaltige Lösung durch den Kanal. Die Antikörper heften sich an die Deckglasoberfläche. Fügen Sie eine Blockierungslösung hinzu, die die ungebundenen Antikörperregionen blockiert und eine unspezifische Proteinbindung verhindert.

Legen Sie das Deckglas auf den Mikroskoptisch. Stellen Sie die Probenheizung auf eine Temperatur ein, die das Wachstum der Mikrotubuli erleichtert.

Pipettieren Sie Mikrotubuli-Samen, die mit einem nicht hydrolysierbaren Guanosintriphosphat, GTP, stabilisiert wurden. Die Samen binden an das mit Antikörpern beschichtete Deckglas. Fügen Sie einen Puffer hinzu, der unmarkiertes Tubulin, GTP und Reduktionsmittel enthält.

Bei optimalen Temperatur- und Pufferbedingungen fungieren die Seeds als Keimbildungsstellen und ermöglichen eine unmarkierte Tubulinbindung und das Wachstum von Mikrotubuli.

Beginnen Sie mit der Bildgebung. Das einfallende Licht wird durch eine Aperturblende auf einen Strahlteiler fokussiert, der das Licht teilweise zum Objektiv reflektiert und die Probe beleuchtet. Die Glas-Puffer-Schnittstelle des Deckglases reflektiert das einfallende Licht teilweise. Das verbleibende einfallende Licht dringt durch und wird an den Grenzflächen zwischen Puffer und Mikrotubuli reflektiert.

Basierend auf dem Mikrotubuli-Deckglas-Abstand interferieren die reflektierten Strahlen von den beiden Grenzflächen und erzeugen konstruktive Interferenz – Strahlen, die sich zu einem hellen Signal verbinden, oder destruktive Interferenz – Strahlen, die sich aufheben, um ein dunkles Signal zu erzeugen.

Visualisieren Sie die Mikrotubuli als kontrastreiche Bilder. Nehmen Sie Zeitrafferbilder auf und erkennen Sie das Wachstum und die Schrumpfung von Mikrotubuli.

Setzen Sie zunächst einen 50/50-Spiegel mit einem entsprechenden Filterwürfel in das Filterrad eines Leuchtstoffmikroskops ein. Gehen Sie vorsichtig mit den Spiegeln um, da sie oft eine Antireflexbeschichtung haben. Wenden Sie sich an ein Objektiv mit hoher Vergrößerung, das auch eine hohe numerische Apertur hat. Das hier gezeigte ist ein 100-fach Ölobjektiv mit einer numerischen Apertur von 1,3.

Verwenden Sie anschließend eine Rasierklinge und einen Objektträger als gerade Kante, um 3 Millimeter breite Streifen aus Kunststoffparaffinfolie zu schneiden. Legen Sie zwei der Paraffinfolienstreifen aus Kunststoff im Abstand von 3 Millimetern auf ein sauberes Deckglas von 22 x 22 Millimetern. Legen Sie dann ein 18 x 18 Millimeter großes Deckglas auf die Streifen, um einen Kanal zu bilden.

Übertragen Sie das Deckglas für 10 bis 30 Sekunden auf einen Heizblock bei 100 Grad Celsius, damit die Paraffinfolie einen versiegelten Kanal bildet. Mit einer Pipette 50 Mikrogramm pro Milliliter eines Anti-Rhodamin-Antikörpers durch Perfusion einfließen lassen und den Objektträger 10 Minuten lang inkubieren.

Waschen Sie den Kanal nach der Inkubation fünfmal mit gefiltertem BRB80. Anschließend wird 1 % Poloxamer 407 in das filtrierte BRB80 eingegossen, um die Oberfläche gegen unspezifische Bindung zu blockieren, und der Objektträger 10 Minuten lang inkubiert. Waschen Sie den Kanal erneut fünfmal mit gefiltertem BRB80.

Um ein Austrocknen der Probe zu verhindern, fügen Sie zwei Tröpfchen des gefilterten BRB80 an den Enden des Kanals hinzu und fügen Sie bei Bedarf mehr Puffer hinzu. Legen Sie die Probe auf den Mikroskoptisch und schalten Sie die Epi-Illuminationslichtquelle ein. Fokussieren Sie sich auf die Kante des Paraffinfilms, um die Probenoberfläche zu finden, und verschieben Sie dann das Feld, um die Ansicht auf die Mitte der Kammer zu verschieben. Sie werden mehrere Oberflächen beobachten, während das Objektiv aufgrund der Rückreflexion des Lichts von der Optik innerhalb des Strahlengangs auf und ab bewegt wird.

Zentrieren Sie anschließend die Feldblende im Sichtfeld, indem Sie sie halb schließen und mit den Einstellschrauben Sobald die Blende richtig ausgerichtet ist, öffnen Sie sie wieder. Schieben Sie dann das Bertrand-Objektiv ein, um die hintere Brennebene zu sehen, die auch als Austrittspupille des Objektivs bezeichnet wird.

Schließen Sie die Aperturblende über die Ränder der Austrittspupille hinaus und zentrieren Sie die Aperturblende mit den Einstellschrauben in Bezug auf die Austrittspupille. Überprüfen Sie dies erneut, indem Sie die Aperturblende öffnen und ihre Ränder mit denen der Austrittspupille abgleichen. Stellen Sie dann die Aperturblende auf etwa 2/3 der numerischen Apertur des Objektivs ein.

Um die Dynamik von Mikrotubuli mit Hilfe von Gehirntubulin abzubilden, stellen Sie zunächst die Temperatur der Probenheizung auf 37 Grad Celsius ein. Fließen Sie mit einer Pipette 10 Mikroliter GMPCPP-stabilisierter Mikrotubuli-Samen ein und überwachen Sie, wie sie an die Oberfläche binden, indem Sie die Oberfläche live abbilden. Sobald 10 bis 20 Samen im Sichtfeld gebunden sind, waschen Sie die Probe mit dem doppelten Kanalvolumen von vorgewärmtem und gefiltertem BRB80.

Als nächstes fließen 10 Mikroliter der Polymerisationsmischung ein.

Um das Wachstum der Mikrotubuli zu messen, richten Sie mit der Erfassungssoftware einen Zeitraffer ein, um 15 Minuten lang alle 5 Sekunden ein Bild aufzunehmen. Verbessern Sie den Kontrast, indem Sie zu jedem Zeitpunkt ein durchschnittliches Bild von 10 aufnehmen. Erfassen Sie Hintergrundbilder, wie im vorherigen Abschnitt gezeigt. Berechnen Sie den Median, indem Sie zu Image gehen, Stapel, dann Z-Projekt und dann Median auswählen. Subtrahieren Sie den entsprechenden Hintergrund, indem Sie zu Prozess gehen, zu Bildrechner gehen und Subtrahieren aus dem Dropdown-Menü auswählen. Stellen Sie sicher, dass die Option 32-Bit-Gleitkommaergebnis aktiviert ist.

Um die Mikrotubuli-Schrumpfung zu verringern, nehmen Sie Bilder mit 100 Bildern pro Sekunde auf, indem Sie die Zeitverzögerung auf Null setzen und die Belichtungszeit auf 10 Millisekunden begrenzen.