Induktion einer nekrotisierenden Enterokolitis im humanen epithelialen enteroiden Modell

Erhalten Sie aus menschlichem Dünndarmgewebe gewonnene Krypten – röhrenförmige Einstülpungen, die Stammzellen und verschiedene Arten von Epithelzellen enthalten.

Gib die Darmkrypten in eine gekühlte Kellermatrix.

Übertragen Sie diese Mischung in eine Multiwell-Platte, wodurch eine dreidimensionale Kuppel entsteht.

Wachstumsmedium hinzufügen und inkubieren.

Stammzellen organisieren sich selbst, vermehren sich und differenzieren sich in mehrere Arten von Darmzellen, die Enterosphären bilden.

Im Laufe der Zeit reifen die Enterosphären zu Enteroiden heran – dreidimensionale, sich selbst erneuernde Strukturen, die den Darmkrypten ähneln.

Geben Sie Lipopolysaccharide oder LPS, ein bakterielles Endotoxin, in die enteroidhaltige Vertiefung und inkubieren Sie.

LPS-Moleküle binden an den Toll-like-Rezeptor im Enteroid und initiieren eine entzündungsfördernde Reaktion, die zur Akkumulation reaktiver Sauerstoffspezies führt. Dies löst eine Kaskade von Ereignissen aus, die zur Apoptose führen.

Infolgedessen ist die Integrität des Enteroids beeinträchtigt, was zum Eindringen von LPS in das Lumen führt, was die Entzündungsreaktion weiter verstärkt.

Dies ahmt die Entwicklung der nekrotisierenden Enterokolitis nach, einer schweren Entzündung im Darm von Frühgeborenen.

Zum Zeitpunkt der Entnahme in der Operationskammer ist die menschliche Dünndarmgewebeprobe in kaltes DPBS zu legen. Waschen Sie die Probe im kalten DPBS, bis sie frei von Blut und Stuhl ist.

Lagern Sie die Probe in RPMI 1640 Medium bei vier Grad Celsius, bis sie für die Kryptenisolierung bereit ist. Wenn Sie fortfahren möchten, überprüfen Sie erneut, ob die Probe frei von Stuhl und Blut ist. Entfernen Sie mit einer feinen Präparierschere überschüssiges Fett oder chirurgische Klammern und Klammern. Wiegen Sie die Probe und streben Sie ein Stück an, das etwa 0,75 bis 2,5 Gramm wiegt.

Schneiden Sie dann das Gewebe in 0,5 Zentimeter große Stücke und legen Sie sie in ein Röhrchen mit 30 Millilitern Chelatpuffer #1. Bei niedriger Geschwindigkeit 15 Minuten bei vier Grad Celsius schütteln. Filtrieren Sie dann das Gewebe durch ein 100-Mikrometer-Zellensieb und verwerfen Sie den Durchfluss.

Geben Sie das gefilterte Gewebe in ein Röhrchen mit 30 Millilitern Chelatpuffer #2. Bei niedriger Geschwindigkeit 15 Minuten bei vier Grad Celsius schütteln. Filtern Sie das Gewebe durch einen 100-Mikrometer-Filter und entsorgen Sie den Durchfluss.

Tauen Sie danach 500 Mikroliter Basalmembranmatrix für die spätere Verwendung auf Eis auf. Geben Sie etwas Taschentuch zu 10 Millilitern kaltem DMEM in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen und schütteln Sie es 10 Sekunden lang kräftig mit der Hand. Filtrieren Sie diese Suspension durch ein 100-Mikrometer-Zellensieb und sammeln Sie den Durchfluss. Halten Sie diese Tube auf Eis.

Geben Sie etwas Taschentuch zu weiteren 10 Millilitern kaltem DMEM in ein separates konisches 50-Milliliter-Röhrchen und schütteln Sie es 10 Sekunden lang kräftig mit der Hand. Filtrieren Sie diese Suspension durch ein 100-Mikrometer-Zellensieb und sammeln Sie den Durchfluss.

Wiederholen Sie diesen Vorgang zwei weitere Male, bis vier konische Röhrchen mit Durchfluss vorhanden sind, die mit eins bis vier beschriftet sind. Filtrieren Sie dann die Lösung im Röhrchen Nummer eins durch ein 100-Mikrometer-Zellensieb und überführen Sie den Durchfluss in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen, das ebenfalls mit Nummer eins beschriftet ist. Wiederholen Sie diesen Vorgang für die Röhrchen zwei bis vier.

Zentrifugieren Sie die 15-Milliliter-Röhrchen bei 200 mal g und bei vier Grad Celsius für 15 Minuten. Entfernen Sie in einer Laminar-Flow-Haube den Überstand von jedem Rohr und entsorgen Sie ihn. Vermeiden Sie es, die Gewebewolke unmittelbar über dem Pellet zu stören, auch wenn das bedeutet, dass ein Überstand zurückbleibt. Pipettieren Sie in jedem Röhrchen langsam auf und ab, um das Pellet mit dem übrig gebliebenen Überstand zu vermischen.

Die Mischung aus jedem Röhrchen wird in ein konisches 2-Milliliter-Röhrchen überführt und 20 Minuten lang bei 200 g und vier Grad Celsius zentrifugiert. Entfernen Sie danach den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 500 Mikrolitern voraufgetauter Basalmembranmatrix.

Verwenden Sie eine gekühlte Pipettenspitze, um 50 Mikroliter dieser Suspension in der Mitte einer Vertiefung in einer 24-Well-Platte aufzutragen. Diese Probe sollte kuppelförmig erscheinen. Wiederholen Sie diesen Anwendungsvorgang neunmal, um insgesamt 10 Vertiefungen zu füllen.

Bringen Sie die 24-Well-Platte für 30 Minuten in einen 5%igen Kohlendioxid-Inkubator bei 37 Grad Celsius, um die Polymerisation zu ermöglichen. Geben Sie dann 500 Mikroliter humanes Mini-Darm-Medium vollständig in jede Vertiefung. Setzen Sie die Inkubation unter den gleichen Bedingungen fort und stellen Sie sicher, dass dieses Medium alle zwei Tage ausgetauscht wird.