Protokolle für Vaginal Inokulation und Probenahme in der Experimental-Maus-Modell der Candida Vaginitis

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, spezifische prozedurale Aspekte beim Einsatz des experimentellen Tiermodells der vaginalen Candidiasis zur Quantifizierung der vaginalen Pilzlast zu demonstrieren und außerdem vaginale oder lymphoide Zellen in bestimmten Assays wie immunologischen und histologischen Assays zu verwenden. Dies wird erreicht, indem zunächst die Technik der vaginalen Inokulation an östrogenbehandelten Mäusen gezeigt wird. Anschließend wird nach der Tötung der Maus eine Vaginalspülung durchgeführt, um Candida zu gewinnen.

Anschließend werden das Vaginalgewebe und/oder die vaginale drainierende Lymphknoten entnommen. Die Lavageflüssigkeit kann mikroskopisch untersucht werden, um Candida in Verbindung mit vaginalen Epithelzellen nachzuweisen, oder auf Agar ausgestrichen werden, um die vaginale Pilzlast zu quantifizieren. Ein Abstrich der zellulären Fraktion kann ebenfalls verwendet werden, um Epithelzellen und lymphoide Zellen anzufärben.

Der Hauptvorteil bei der Demonstration dieser Technik besteht also darin, dass die Anwender des Tiermodells der Vaginitis diese möglichst effizient und effektiv durchführen können. Die mittels dieser Technik beantworteten zentralen Fragen liegen im Bereich der Vaginitis und Ökologie und betreffen Schlüsselfragen wie die Immunantwort des Wirts, die zelluläre Verteilung, die Wirksamkeit von Arzneimitteln, die Effektivität immuntherapeutischer Ansätze sowie die Auswirkungen von Immunisierungen und die Demonstration der Technik selbst. Heute wird eine Doktorandin in meinem Labor, Junco Yano, eine Maus drei Tage nach der Verabreichung einer Injektion mit Beta-Estradiol mit C. albicans infizieren.

Beginnen Sie damit, die Maus auf einer flachen, roten Oberfläche zu stabilisieren, an der sie Halt finden kann. Halten Sie dann die Schwanzwurzel mit zwei Fingern fest und heben Sie die Hüfte leicht an, sodass die Vaginalöffnung zu Ihnen zeigt. Führen Sie die Pipettenspitze etwa fünf Millimeter tief in das Vaginallumen ein und pipettieren Sie bis zu 20 Mikroliter der Inokulum-Suspension hinein.

Führen Sie diesen Schritt so schnell und schonend wie möglich durch, um die Belastung der Maus zu minimieren. Nach der gewünschten Inkubationszeit euthanasieren Sie das Tier gemäß dem Protokoll Ihrer Einrichtung. Halten Sie die Maus anschließend mit zwei Fingern am Schwanzansatz fest, sodass die Vaginalöffnung mit einer Pipette zugänglich ist.

Geben Sie 100 Mikroliter sterile PBS in das Vaginallumen ein und führen Sie unter wiederholter Aspiration und Vortexen eine Lavage durch. Wenn die Pipettenspitze mit Zellen verstopft, geben Sie die verstopfenden Zellen ab und setzen Sie die Lavage mit der verbleibenden PBS fort. Sammeln Sie die Lavageflüssigkeit in einem Mikrozentrifugenröhrchen.

Nach dem Vaginalabstrich legen Sie die Maus auf den Rücken und benetzen Sie den Leistenbereich mit 70 % Ethanol. Heben Sie mit einer Pinzette die Harnöffnung nach oben, sodass die Vaginalöffnung freigelegt wird. Führen Sie eine gebogene Pinzette in das Vaginallumen ein und ertasten Sie den Muttermund, wobei Sie einen festen Griff mit der Pinzette beibehalten.

Extrahieren Sie den Gebärmutterhals durch die Vaginalhöhle, excidieren Sie die Vagina an der Basis der Vaginalöffnung und entfernen Sie anschließend den Gebärmutterhals mit einer chirurgischen Schere von der Vagina. Da das Vaginalgewebe invaginiert ist, stülpen Sie es um, um die ursprüngliche Orientierung beizubehalten, oder öffnen Sie es durch einen lateralen Schnitt zu einem Blatt, um die Entfernung der Lymphknoten im Lendenbereich bei rückwärts liegendem Tier durchzuführen. Benetzen Sie den Bauchbereich vollständig mit 70 % Ethanol.

Erstellen Sie einen seitlichen Schnitt vom Unterbauch bis zum Brustkorb und legen Sie die inneren Organe mit einer Pinzette in beiden Händen frei. Bewegen Sie die Därme nach oben, sodass die zentralen Blutgefäße sichtbar werden. Lokalisieren Sie die untere Hohlvene und die Bauchaorta.

Ein Paar von Lumbal-Lymphknoten kann neben der Bauchaorta identifiziert werden, etwa auf halbem Weg zwischen der Abzweigung der Nieren- und der gemeinsamen Beckenarterie. Diese Lymphknoten lassen sich visuell von Fettgewebe durch ihre elastische Konsistenz unterscheiden und sind im Vergleich zu Fettgewebe heller und undurchsichtiger gefärbt. Bei infizierten Tieren sind sie außerdem deutlich größer als bei nicht infizierten.

Tiere entfernen die Lymphknoten, indem sie feine Pinzette unter den Knoten platzieren und vorsichtig nach oben ziehen, um sie vom umgebenden Gewebe zu lösen. Nach der Entnahme des Gewebes überführen Sie die Lymphknoten auf einen sterilen Drahtsieb, der in einer sterilen Glas-Petrischale mit etwa 10 Milliliter Hank’scher Pufferlösung (Hank's balanced salt solution) platziert ist. Zur Isolierung von lymphatischen Zellen ziehen Sie den schriftlichen Protokollhinweisen zu Rate.

Die zellulären Fraktionen der Vaginallavage-Flüssigkeit von Mäusen, die mindestens vier Tage zuvor infiziert wurden, bestehen typischerweise aus Candida-Epithelzellen und zellulären Infiltraten, wie hier durch Dunkelfeldmikroskopie gezeigt. Candida kann anhand des Vorhandenseins von PHA sowie Hefe identifiziert werden. Hier werden Ausstrichpräparationen der Vaginallavage-Flüssigkeit gefärbt.

Unter Verwendung der Abstrichtechnik wird ein Ausstrich präpariert, um Epithelzellen und infiltrierende Leukozyten zu untersuchen, wobei die hauptsächlich vorkommenden Zellen Neutrophile sind, die anhand ihrer durchscheinenden Kernteilungen identifiziert werden können. In nicht infizierten Mäusen werden, falls vorhanden, nur sehr wenige Neutrophile nachgewiesen. Diese Abbildung zeigt ein Beispiel für die vaginale Pilzlast.

Vaginale Spülflüssigkeit wird zu bestimmten Zeitpunkten gesammelt und zur Bestimmung der koloniebildenden Einheiten (CFU) kultiviert. In diesem Beispiel wurde die Flüssigkeit am fünften Tag nach der Inokulation gewonnen, seriell verdünnt, ausplattiert und 48 Stunden inkubiert. Anschließend werden die Kolonien gezählt und die vaginale Pilzlast berechnet. Eine vaginale Kolonisation oder Infektion mit Candida hält bei östrogenbehandelten, inokulierten Mäusen wochenlang an.

Während Candida bei nicht östrogenbehandelten, infizierten Mäusen keine vaginale Kolonisation etablieren kann, bleiben östrogenbehandelte, nicht infizierte Mäuse während des gesamten Zeitraums candida-negativ. Außerdem können vaginale Spülungen entweder einmalig an verschiedenen Mäusen zu jedem Zeitpunkt oder longitudinal an denselben Mäusen unter Anästhesie durchgeführt werden. Bei Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, die Tiere sicher zu fixieren, um eine Schädigung der Vagina zu vermeiden, und ausreichend Zeit für eine gründliche Spülung aufzuwenden, um eine genaue Bestimmung der vaginalen Pilzlast bei der Entnahme des Vaginalgewebes zu gewährleisten.

Verwenden Sie ruhendes PBS, um eine Austrocknung zu verhindern, und achten Sie darauf, beim Entfernen der Lymphknoten sowie bei der Aufbereitung der Lymphknotenzellen keine großen Venen und Arterien zu beschädigen; halten Sie die Proben zur Erhaltung der Zellviabilität auf Eis oder bei vier Grad. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man das experimentelle Mausmodell der Candida-Vaginitis anwendet, um die vaginale Pilzlast reproduzierbar zu quantifizieren und vaginale oder lymphoide Gewebe für spezifische immunologische oder histologische Assays zu entnehmen.