Protokolle für Vaginal Inokulation und Probenahme in der Experimental-Maus-Modell der Candida Vaginitis

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, spezifische Verfahrensfragen zu demonstrieren, die mit der Verwendung des experimentellen Tiermodells der vaginalen Candidiasis als Mittel zur Quantifizierung der vaginalen Pilzlast verbunden sind, und auch die Verwendung von vaginalen oder lymphoiden Zellen in spezifischen Assays wie immunologischen und histologischen Assays. Dies wird erreicht, indem zunächst die vaginale Impftechnik an östrogenbehandelten Mäusen demonstriert wird. Als nächstes wird nach dem Einschläfern der Maus eine vaginale Spülung durchgeführt, um Candida zu gewinnen.

Dann wird das Vaginalgewebe und/oder die vaginal drainierenden Lymphknoten entnommen. Lavage-Flüssigkeit kann mikroskopisch betrachtet werden, um Candida zu zeigen, die mit vaginalen Epithelzellen assoziiert ist, oder auf Agar plattiert, um die vaginale Pilzlast zu quantifizieren. Ein Abstrich der zellulären Fraktion kann auch zur Färbung von Epithelzellen und lymphatischen Zellen verwendet werden.

Der Hauptvorteil der Demonstration dieser Technik besteht also darin, dass die Benutzer des Tiermodells der Vaginitis dies am effizientesten und effektivsten tun können. Und die Schlüsselfragen, die mit der Technik beantwortet werden, liegen im Bereich der Vaginitis und Ökologie und beantworten Schlüsselfragen wie die Immunantworten des Wirts, die zelluläre Verteilung, die Wirksamkeit von Medikamenten, die Wirksamkeit von Immuntherapeutika und auch die Auswirkungen der Immunisierung und die Demonstration der Technik. Heute wird ein Doktorand in meinem Labor, junco yano, eine Maus mit C albicans drei Tage nach der Verabreichung einer Injektion von Beta-Östradiol infizieren.

Beginnen Sie damit, die Maus auf einer flachen gRED-Oberfläche zu stabilisieren, damit sie greifen kann. Halte dann mit zwei Fingern den Ansatz des Schwanzes fest und hebe die Hüfte nach oben, sodass die Scheidenöffnung zu dir zeigt. Führen Sie die Pipettenspitze etwa fünf Millimeter tief in das Vaginallumen ein und pipettieren Sie bis zu 20 Mikroliter der Inokulumsuspension.

Führen Sie diesen Schritt so schnell und schonend wie möglich aus, um die Belastung der Maus zu minimieren. Nach der gewünschten Inkubationszeit euthanasieren Sie das Tier gemäß dem Protokoll für Ihre Einrichtung. Halten Sie dann die Maus mit zwei Fingern an der Basis des Schwanzes nach unten, so dass die Vaginalöffnung mit einer Pipette freigelegt wird.

Führen Sie 100 Mikroliter steriles PBS in das Vaginallumen ein und führen Sie unter wiederholter Aspiration und Bewegung eine Spülung durch. Wenn die Pipettenspitze mit Zellen verstopft ist, geben Sie die blockierenden Zellen ab und fahren Sie mit dem restlichen PBS fort. Sammeln Sie die Spülflüssigkeit in einem Mikrozentrifugenröhrchen.

Legen Sie die Maus nach der vaginalen Spülung auf den Rücken und sättigen Sie die Leistengegend mit 70 % Ethanol. Heben Sie mit einer Pinzette die Harnöffnung nach oben, so dass die Vaginalöffnung freiliegt. Führen Sie eine gebogene Pinzette in das Vaginallumen ein und lokalisieren Sie den Gebärmutterhals, während Sie die Pinzette fest greifen.

Ziehen Sie den Gebärmutterhals durch die Vaginalhöhle heraus, entfernen Sie die Vagina an der Basis der Vaginalöffnung und entfernen Sie dann den Gebärmutterhals mit einer chirurgischen Schere aus der Vagina. Da das Vaginalgewebe involutiert ist, drehen Sie es um, um die ursprüngliche Ausrichtung beizubehalten, oder öffnen Sie es zu einem Blatt, indem Sie einen seitlichen Schnitt für die Entfernung des Lendenknotens machen, während das Tier auf dem Rücken liegt. Tränken Sie den Bauch mit 70% Ethanol.

Machen Sie einen seitlichen Schnitt vom Unterbauch bis zur Brust und legen Sie die inneren Organe mit einer Pinzette in beiden Händen frei. Bewegen Sie den Darm nach oben, so dass die zentralen Blutgefäße sichtbar werden. Lokalisieren Sie die untere Vena cva und die Bauchschlagader.

Neben der Bauchschlagader kann ein Paar lumbaler Lymphknoten identifiziert werden, das sich etwa auf halbem Weg zwischen dem Ursprung der Nierenarterie und der Arteria iliaca communis befindet. Diese Lymphknoten sind durch ihre elastische Textur optisch vom Fettgewebe zu unterscheiden und sind im Vergleich zu Fettgewebe heller und undurchsichtiger in der Farbe. Sie sind auch bei infizierten Tieren im Vergleich zu nicht geimpften Tieren deutlich größer.

Die Tiere schnitten die Lymphknoten heraus, indem sie eine Mikrozange unter den Knoten legten und dann vorsichtig nach oben zogen, um sie vom umgebenden Gewebe zu trennen. Nach dem Exzidieren des Gewebes werden die Lymphknoten auf ein steriles Drahtgitter übertragen, das sich in einer sterilen Petrischale aus Glas befindet, die etwa 10 Milliliter Hanks ausgewogene Salzlösung enthält. Um lymphoide Zellen zu isolieren, beziehen Sie sich auf das schriftliche Protokoll.

Die zellulären Fraktionen der vaginalen Spülflüssigkeit von Mäusen, die mindestens vier Tage zuvor geimpft wurden, bestehen typischerweise aus Candida-Epithelzellen und zellulären Infiltraten, wie hier mittels Nassmikroskopie gezeigt. Candida kann sowohl durch das Vorhandensein von PHA als auch durch Hefe identifiziert werden. Hier werden Abstrichpräparate der Vaginalspülflüssigkeit gebeizt.

Mit der Pap-Abstrich-Technik werden Epithelzellen und infiltrierende Leukozyten untersucht, deren Hauptzellen Neutrophile sind, wie sie an den Traclearlappen zu erkennen sind. Bei nicht geimpften Mäusen werden, wenn überhaupt, nur sehr wenige Neutrophile nachgewiesen. Diese Abbildung zeigt ein Beispiel für eine vaginale Pilzbelastung.

Die Vaginalspülflüssigkeit wird zu bestimmten Zeitpunkten gesammelt und für die KBE-Zählung kultiviert. In diesem Beispiel wurde die Flüssigkeit am fünften Tag nach der Inokulation seriell gesammelt, verdünnt, plattiert und 48 Stunden lang inkubiert. Anschließend werden die Kolonien gezählt und die vaginale Pilzbelastung berechnet, die vaginale Besiedlung oder Infektion mit Candida bleibt bei östrogenbehandelten geimpften Mäusen wochenlang bestehen.

Während Candida bei nicht mit Östrogen behandelten geimpften Mäusen keine vaginale Besiedlung feststellen kann, bleiben mit Östrogen behandelte nicht geimpfte Mäuse während der gesamten Zeit negativ für Candida. Darüber hinaus können vaginale Spülungen entweder einmal an verschiedenen Mäusen zu jedem Zeitpunkt oder longitudinal an denselben Mäusen unter Narkose durchgeführt werden. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, die Tiere sicher zu fixieren, um ein Trauma der Vagina zu vermeiden, und nehmen Sie sich bitte die notwendige Zeit, um gründlich zu spülen, um eine genaue vaginale Pilzbelastung bei der Entnahme von Vaginalgewebe zu erhalten.

Verwenden Sie immer noch PBS, um sie vor dem Austrocknen zu bewahren, und achten Sie bitte darauf, große Venen und Arterien nicht zu beschädigen, wenn Sie Lymphknoten entfernen und Lymphknotenzellen verarbeiten, halten Sie sie auf Eis oder bei vier Grad, um die Lebensfähigkeit der Zellen zu erhalten. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie das experimentelle Mausmodell der Candida-Vaginitis einsetzen können, um die vaginale Pilzbelastung reproduzierbar zu quantifizieren und vaginales oder lymphatisches Gewebe für spezifische immunologische oder histologische Assays zu entfernen.