Name: Visualization of Vascular Ca 2 + Signaling Ausgelöst durch Parakrine Derived ROS (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 33 s
Description: Erfahren Sie, wie vaskuläre Calcium-Signalübertragung durch parakrine ROS in einem Ko-Kulturmodell aus Makrophagen und Endothelzellen visualisiert wird. Diese Methode nutzt oxidationsempfindliche Farbstoffe und konfokale Bildgebung.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health Grant (R01 HL086699, HL086699-01A2S1, 1S10RR027327-01) zu MM unterstützt. Unser Artikel ist teilweise von Carl Zeiss MicroImaging GmbH unterstützt.

Reaktive Sauerstoffspezies können in lebende Zellen mit Oxidations-Farbstoffen (1 &amp; 2) oder unter Verwendung von Plasmid-Sensoren (3 &amp; 4) durch konfokale Mikroskopie gemessen werden. 1. Visualisierung der cytosolischen ROS in J774-Zellen <ol><li> Wachsen J774.1 Maus Monozyten-Makrophagen (10 6 Zellen / ml) auf Glasboden 35-mm-Platten (Harvard Apparatus) für 48 h. </li><li> Challenge-Zellen mit TLR-Agonisten (2 pg / ml, Lipo-Teichonsäure-TLR2-Agonist, 10μg/ml, Poly (I: C)-TLR3 Agonist, 1 pg / ml LPS-TLR4-Agonist) für 6 h bei 37 ° C. Hinweis: Makrophagen unter ähnlichen Bedingungen behandelt wurden, für die Co-Kultur-Modell Ca 2 + Mobilisierung eingesetzt. </li><li> Fügen Sie die Oxidations-Farbstoff H 2 DCF-DA (Invitrogen) in einer Endkonzentration von 10 uM in ECM (extrazelluläre Medium zu geben: 121 mM NaCl, 5 mM NaHCO 3, 10 mM Na-HEPES, 4,7 mM KCl, 1,2 mM KH 2 PO 4, 1,2 mM MgSO 4, 2 mM CaCl 2, 10mM Glucose und 2,0% Dextran, pH 7,4; alle von Sigma) mit 2% BSA, Gerichte und inkubieren Zellen für 20 min vor der Anzeige unter der konfokalen Mikroskopie. </li><li> Nach Farbstoff Laden, visualisieren Zellen auf eine Temperatur gesteuerte Phase der eine entsprechende Imaging-System gelegt. Wir verwenden Carl Zeiss LSM 510 Meta konfokalen Imaging-System mit Argon-Ionen-Laser-Quelle bei einer Anregung von 488 nm für die DCF-Fluoreszenz mit 40x Öl-Objektiv 13 (Abb. 1A und D) gekoppelt. </li><li> Analysieren von Bildern mit ImageJ Software (1,44), frei verfügbare Software von der National Institutes of Health (Rasband, WS, ImageJ, US National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, <a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/">http://rsb.info.nih.gov/ij /</a> , 1997-2009). </li></ol> 2. Visualisierung der MROS in J774-Zellen <ol><li> Wachsen J774.1 Maus Monozyten-Makrophagen (10 6 Zellen / ml) auf Glasboden 35-mm-Platten (Harvard Apparatus) für 48 h. </li><li>Fordern Sie die Zellen mit TLR-Liganden an die Meldestelle zu induzieren (2 pg / ml, Lipo-Teichonsäure-TLR2, 10μg/ml, Poly (I: C)-TLR3, 1 pg / ml LPS-TLR4) für 6 h bei 37 ° C. </li><li> Add mitochondrialen Superoxid-Indikator MitoSOX Red (Invitrogen) in einer Endkonzentration von 5 uM in ECM mit 2% BSA, Gerichte und inkubieren Zellen für 30 min bei 37 ° C, damit geben Laden MitoSOX Red. </li><li> Nach Farbstoff Laden, visualisieren Zellen auf eine Temperatur gesteuerte Phase eines Carl Zeiss LSM 510 Meta konfokalen Imaging-System Paar mit Argon-Ionen-Laser-Quelle bei einer Anregung von 561 nm für MitoSOX Red-Fluoreszenz mit 40x Öl-Objektiv (Abb. 1B und E). </li><li> Zur Kontrolle Experimente nach Farbstoff zum Laden PBS oder DMSO (negative Kontrolle) oder 2 um Antimycin A (als mitochondriale Superoxid-Generator-positive Kontrolle), um Zellen vor der Bild der Probe in 2,4 (Abb. 1C) beschrieben. </li><li> Analysieren Sie die Bilder mit ImageJ Software (1,44). </li></ol> 3. Visualizatiauf der cytosolischen ROS in stabilen Hyper-Zyto MPMVECs <ol><li> Wir verwenden Phyper-Zyto (Evrogen) eine Säugerexpressionsvektor Kodierung eines fluoreszierenden Sensor HyPer, dass in das Zytoplasma und speziell Sinne submikromolaren Konzentration von H 2 O 2 14 lokalisiert. </li><li> Transfizieren Murine Pulmonary mikrovaskulären Endothelzellen (MPMVECs) mit Phyper-Zyto-Vektor entweder Elektroporation oder Transfektionsreagenzien. Wir verwenden 10 x 10 6 Zellen und transfizieren mit 10 ug von Phyper-Zyto via Elektroporation mit BioRad Gene Pulser Elektroporator System (250V, 500 mF). Kultur MPMVECs in DMEM Medium mit 10% FBS, essentielle Aminosäuren, endothelial growth ergänzen und Antibiotika. Hinweis: Nach der Transfektion Platte Zellen bei geringer Dichte Kolonie Wachstum zu erleichtern. </li><li> Ersetzen Medium mit komplettem Kulturmedium mit 500 pg / ml G418, 48 Stunden nach Transfektion ergänzt. Screen für Klone, die höchsten Prozentsatz von H haben yper positive Zellen und Passage HyPer positive Klone, die Anzahl von Hyper-positiven Zellen (Abb. 2) zu erhöhen. Hinweis: Wir verwenden Verdünnungsreihe von Zellen für die klonale Selektion einzelner Zellen und Bildschirm für eine stabile Zellen hochexprimierenden HyPer. </li><li> Wachsen stabil Hyper-Zyto MPMVECs auf 0,2% Gelatine beschichtete Deckgläser (80% Konfluenz). Am nächsten Tag Herausforderung Zellen mit TLR-Liganden (2 pg / ml, Lipoteichonsäure-TLR2, 10μg/ml, Poly (I: C)-TLR3, 1 pg / ml LPS-TLR4) für 6 h bei 37 ° C. Unbehandelte Zellen dienen als Kontrolle. </li><li> Nach der Behandlung, montieren Sie die Deckgläser auf Attofluor Zellkammer (Invitrogen). 1ml von pre erwärmt Hanks balanced salt solution (HBSS) in die Kammer und Ort der Kammer auf eine Temperatur gesteuerte Phase der Carl Zeiss LSM 510 Meta konfokalen Imaging-System. Visualisieren und Bild Fluoreszenz ändern bei einer Anregung von 488 nm mit 40x Öl-Objektiv (Abb. 3A und D). </li><li> Analysieren von Bildern mit ImageJ Software (1.44) (siehe Abschnitt 6). </li></ol>itel "&gt; 4. Visualisierung der mitochondrialen ROS in stabilen Hyper-dMito MPMVECs <ol><li> Wir verwenden Phyper-dMito (Evrogen) eine Säugerexpressionsvektor Kodierung Mitochondrien gezielte HyPer, dass in den Mitochondrien und speziell Sinne submikromolaren Konzentration von H 2 O 2 lokalisiert. </li><li> Transfizieren MPMVECs mit Phyper-dMito und generieren stabile Hyper-dMito MPMVECs folgenden Schritte in Abschnitt 3,2-3,3 beschrieben. </li><li> Wachsen stabil Hyper-dMito MPMVECs auf 0,2% Gelatine beschichtete Deckgläser (80% Konfluenz). </li><li> Am nächsten Tag Herausforderung Zellen mit TLR-Liganden (2 pg / ml, Lipoteichonsäure-TLR2, 10μg/ml, Poly (I: C)-TLR3, 1 pg / ml LPS-TLR4) für 6 h bei 37 ° C. Unbehandelte Zellen dienen als negative Kontrolle. Add 2 um Antimycin A (mitochondriale Superoxid-Induktor-positive Kontrolle) vor der Visualisierung Probe. </li><li> Nach der Behandlung, montieren Sie die Deckgläser auf Attofluor Zellkammer (Invitrogen). Add 1 ml vorgewärmten Hanks balanced salt solution (HBSS) in die KammerOrt und die Kammer auf eine Temperatur gesteuerte Phase der Carl Zeiss LSM 510 Meta konfokalen Imaging-System. Visualisieren und Bild Fluoreszenz ändern bei einer Anregung von 488 nm mit 40x Öl-Objektiv (Abb. 3B, C und E). </li><li> Analysieren von Bildern mit ImageJ Software (1.44) (siehe Abschnitt 6). </li></ol> 5. Co-Kultur-Modell zur Visualisierung von parakrine-derived ROS ausgelöst Ca 2 +-Signalisierung in Endothelzellen Für die Visualisierung und Messung von [Ca 2 +] i Änderungen, die wir verwenden eine Ca 2 + Fluoreszenzfarbstoff Fluo-4 AM (Invitrogen). <ol><li> Wachsen MPMVECs auf 0,2% Gelatine beschichtete 25 mm Deckgläser (80% Konfluenz). </li><li> Inkubieren Sie die Zellen auf Deckgläsern bei Raumtemperatur gewachsen für 30 min in ECM mit 2% BSA und 0,003% Pluronsäure mit 5 uM Fluo-4 AM (Invitrogen) Endkonzentration zu ermöglichen Beladung von Fluo-4 AM. Nach dem Laden, waschen Sie die Zellen mit experimentellen Imaging-Lösung (ECM mit 0.25% BSA) mit Sulfinpyrazon zu färben Verlust zu minimieren. </li><li> Nach dem Laden Fluo-4, mount Deckgläser auf Attofluor Zellkammer (Invitrogen). Fügen Sie 800μl der pre erwärmt experimentellen Imaging-Lösung in die Kammer und legen Sie es auf eine Temperatur gesteuerte Phase der Carl Zeiss LSM 510 Meta konfokalen Imaging-System. </li><li> Mäuse (Behandlung mit LPS für 6 Stunden) mit Zell-tracker rot CMTPX (500ng/ml) (Invitrogen) in ECM mit 2% BSA - In einem separaten Röhrchen beschriften Sie die aktivierten oder aktivierte Makrophagen entweder von Wildtyp-oder gp91 phox-/ isoliert und 0,003% Pluronsäure. Waschen und die Zellen mit 200 ul der experimentellen Imaging-Lösung. </li><li> Add gekennzeichnet Makrophagen an fluo-4 AM beladen MPMVECs in die Kammeranordnung. </li><li> Notieren Sie die grüne und rote Fluoreszenz alle 3s für 10-20 min mit Carl Zeiss LSM510 Meta konfokalen Imaging-System mit einem Argon-Ionen-Laser-Quelle mit einer Anregung bei 488 und 561 nm für die Fluo-4 AM-und Zell-tracker rote Fluoreszenz respectively (Abb. 4 AC). Hinweis: Alternativ J774.1 Zelllinie verwendet werden, um MPMVECs Ca 2 + Mobilisierung auslösen werden. </li><li> Analysieren Fluo-4 Fluoreszenz-Intensität Änderungen mit ImageJ Software (1.44) (siehe Abschnitt 6). </li></ol> 6. Datenanalyse mit ImageJ Software Übertragen Sie die Bilder aus dem konfokalen System als. Lsm Formatdatei für die Datenanalyse erhalten. ZEN 2009 und ZEN 2010 Software mit LSM 510 Meta konfokalen Mikroskop LSM oder zur Verfügung gestellt 710 Multiphotonen konfokalen Mikroskop bzw. speichert Dateien in. Lsm Format. Wir empfehlen, diese native. Lsm Dateien für die Bildanalyse als ursprüngliche Qualität erhalten bleibt. Dieses Dateiformat kann direkt in der Bildanalyse-Programm Bild J. geöffnet werden Die folgenden Schritte bieten ein Beispiel quantitative Analyse der einzelnen Bildes. Keine zusätzlichen Plugins sind für diese Datenanalyse benötigt. <ol><li> Open. Lsm oder. TIFF-Datei in Image J-Programm mit Datei&gt; Öffnen </li><li> Klicken Sie auf die Registerkarte BILD&gt; COLOR&gt; SPLIT Kanäle und spaltete die grüne und DIC-Kanäle. Verwenden Sie das Bild aus dem grünen Kanal für die spätere Analyse. </li><li> Doppelklicken Sie auf und wählen Sie die "elliptische Pinsel Auswahl" und stellen die Pixel-Wert auf 20. </li><li> Für Hyper-Zyto Bilder, auf einer einzigen Zelle, um die kreisförmige Fläche von Messung zu definieren klicken. Dann drücken Sie "M"-Taste, um die Intensität des ausgewählten Bereichs zu messen. Die Werte werden in einem neuen Fenster Ergebnisse erhalten. </li><li> Next by holding "Shift"-Taste klicken Sie auf eine andere Zelle in einen anderen Bereich, mit der Taste "M"-Taste gefolgt wählen. Die Intensität wird in das Ergebnis-Fenster aufgezeichnet. Wiederholen Sie die Schritte 4-5 auf 50 verschiedenen Zellen. </li><li> Für Hyper d-mito Bilder, stellen Sie die Pixel-Wert auf 10 in den Elliptical Pinsel Auswahl. Region of Interest (ROI) muss manuell mit den Mitochondrien von bestimmten Zellen zurückgeführt werden. </li><li> Mit Freehand, verfolgen Sie die Region rund um den Mitochondrien und drücken Sie dann die "M". Wiederholen Sie die Schritte 6-7 auf 50 verschiedenen Zellen. </li><li> Kopieren Sie die mich und Werte aus dem Ergebnis-Fenster und fügen Sie ihn in einem Excel-Sheet oder eine Software, um die Ergebnisse Grundstück. Wir verwenden entweder SigmaPlot oder Graphpad PRISM, um die Daten als Grafik Grundstück. </li></ol> 7. Repräsentative Ergebnisse Abbildung 1 zeigt zytosolischen und mitochondrialen ROS-Produktion nach Herausforderung mit TLR-Liganden. Vertreter konfokalen Aufnahmen zeigen Zunahme von DCF (cytosolische) und MitoSOX Red (Mitochondrien) Fluoreszenz nach 6 h Stimulation. Fluoreszenz-Änderungen wurden normalisiert und als facher ausgedrückt. Abbildung 2 zeigt die Erzeugung von stabilen Hyper-Zyto-und Hyper-dMito Endothelzellen. Maus-Endothelzellen wurden mit Phyper-Zyto oder Phyper-dMito Plasmid-Konstrukte mittels Elektroporation transfiziert. Cells stabil exprimieren Plasmide wurden mit G418 für zwei Wochen gewählt. Nach der Selektion wurden verdünnten Zellen in 96-Well-Platten ausgesät. Einzelne Kolonien wurden isoliert und bebildert für homogene Ausdruck. e_content "&gt; Abbildung 3 zeigt die Messung der Endothelfunktion zytosolischen und mitochondrialen H 2 O 2 Ebenen. Representative konfokalen Aufnahmen zeigen Zunahme der Hyper-Zyto (cytosolische) und Hyper-dMito (Mitochondrien) Fluoreszenz nach 6 h Stimulation. Fluoreszenzintensität Veränderungen normalisiert wurden und als-fache Veränderung zum Ausdruck gebracht. Abbildung 4 zeigt die Bewertung der Makrophagen-abgeleitete ROS induzierte endotheliale cytosolischen Ca 2 +-Mobilisierung. LPS-stimulierte Makrophagen wurden auf pulmonale mikrovaskuläre Endothelzellen (PMVEC), die zuvor mit der intrazellulären Ca 2 geladen hatte hinzugefügt + ([Ca 2 +] i) Indikatorfarbstoff Fluo-4. Die Anwendung des Wildtyp-LPS-aktivierten Makrophagen hervorgerufen ein [Ca 2 +] i Anstieg in PMVECs dass abgeschwächt durch Knockout von funktionellen NADPH-Oxidase wurde (gp91 phox-/ -). <img src="/files/ftp_upload/3511/3511fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Visualizatiauf der Makrophagen generiert zelluläre ROS und der mitochondrialen Superoxid. J774.1 Zellen wurden mit TLR2, 3 und 4 Liganden in Frage gestellt (2 pg / ml, Lipoteichonsäure-TLR2, 10μg/ml, Poly (I: C)-TLR3, 1 pg / ml LPS-TLR4). 6 h bei 37 ° C. Nach der Behandlung wurden die Zellen mit geladenen (A) zelluläre ROS-Indikator (H 2 DCF-DA; grüne Fluoreszenz) oder (B) mitochondrialen Superoxid-Indikator (MitoSOX Red, rote Fluoreszenz). (C) Antimycin A wurde als positive Kontrolle für mitochondriale ROS-Produktion verwendet. Fluoreszenzintensität Veränderungen wurden anhand der konfokalen Mikroskopie. (D) und (E) Quantifizierung der mittleren Fluoreszenz ändern. <img src="/files/ftp_upload/3511/3511fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Schematische Darstellung der Generierung von stabilen Expression von endothelialen Zellen zytosolischen und mitochondrialen ROS Indikatoren. <img src="/files/ftp_upload/3511/3511fig3.jpg" alt="Abbildung 3" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Abbildung 3"> Abbildung 3. V. isualisierung der endothelialen zytosolischen und mitochondrialen H 2 O 2 Ebenen MPMVECs stabil exprimieren (A) Hyper-Zyto oder (B) Hyper-dMito wurden mit TLR2, 3 und 4 Liganden (2 pg / ml, Lipoteichonsäure-TLR2 herausgefordert; 10 ug / ml, Poly (I: C)-TLR3, 1 pg / ml LPS-TLR4) für 6 h bei 37 ° C. (C) Antimycin A wurde als positive Kontrolle für mitochondriale ROS-Produktion verwendet. Nach der Behandlung wurden Fluoreszenzintensität Veränderungen beurteilt mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie. (D) und (E) Quantifizierung der mittleren Fluoreszenz ändern. <img src="/files/ftp_upload/3511/3511fig4.jpg" alt="Abbildung 4" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Abbildung 4"> Abbildung 4. Makrophagen-abgeleitete ROS entlocken beeinträchtigt Endothelzellen Ca 2 +-Mobilisierung. (A) Schematische Darstellung von Endothelzellen / Makrophagen-Co-Kultur-Modell zu studieren. (B) Frisch isolierte murine Makrophagen sowohl aus WT und gp91phox null Mäuse (The Jackson Laboratory) wurden von 1 pg / ml LPS für 6 h aktiviert MacropHages wurden mit Zell-tracker Red (rot) markiert und fügte hinzu, auf Fluo-4 beladen PMVECs (grün) bis parakrine O 2 • zu beurteilen, -. Signalisierung (C) LPS-aktivierten Makrophagen von WT Mäusen isoliert ausgelöst große und schnelle Ca 2 +-Mobilisierung in PMVECs zu Makrophagen aus gp91phox null Mäusen verglichen. Validierung von Makrophagen-Aktivierung wurde bereits unter Beweis gestellt.

<ol><li>Madesh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+role+for+superoxide+in+InsP3+receptor-mediated+mitochondrial+dysfunction+and+endothelial+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Selective role for superoxide in InsP3 receptor-mediated mitochondrial dysfunction and endothelial apoptosis.</a> J. Cell. Biol. 170, 1079-1090 (2005).</li>
<li>Droge, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Free+radicals+in+the+physiological+control+of+cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Free radicals in the physiological control of cell function.</a> Physiol. Rev. 82, 47-95 (2002).</li>
<li>Hamanaka, R. B., Chandel, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+reactive+oxygen+species+regulate+cellular+signaling+and+dictate+biological+outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem.+Sci%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial reactive oxygen species regulate cellular signaling and dictate biological outcomes.</a> Trends Biochem. Sci. 35, 505-513 Forthcoming.</li>
<li>Hawkins, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((S-glutathionylation+activates+STIM1+and+alters+mitochondrial+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">S-glutathionylation activates STIM1 and alters mitochondrial homeostasis.</a> J. Cell. Biol. 190, 391-405 (2010).</li>
<li>Madesh, M., Hajnoczky, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VDAC-dependent+permeabilization+of+the+outer+mitochondrial+membrane+by+superoxide+induces+rapid+and+massive+cytochrome+c+release%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">VDAC-dependent permeabilization of the outer mitochondrial membrane by superoxide induces rapid and massive cytochrome c release.</a> J. Cell Biol. 155, 1003-1015 (2001).</li>
<li>Finkel, T., Holbrook, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidants+oxidative+stress+and+the+biology+of+ageing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Oxidants oxidative stress and the biology of ageing.</a> Nature. 408, 239-247 (2000).</li>
<li>Rittirsch, D., Flierl, M. A., Ward, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harmful+molecular+mechanisms+in+sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Harmful molecular mechanisms in sepsis.</a> Nat. Rev. Immunol. 8, 776-787 (2008).</li>
<li>Sanlioglu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipopolysaccharide+induces+Rac1-dependent+reactive+oxygen+species+formation+and+coordinates+tumor+necrosis+factor-alpha+secretion+through+IKK+regulation+of+NF-kappa%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Lipopolysaccharide induces Rac1-dependent reactive oxygen species formation and coordinates tumor necrosis factor-alpha secretion through IKK regulation of NF-kappa.</a> 276, 30188-30198 (2001).</li>
<li>Hawkins, B. J., Madesh, M., Kirkpatrick, C. J., Fisher, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superoxide+flux+in+endothelial+cells+via+the+chloride+channel-3+mediates+intracellular+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Superoxide flux in endothelial cells via the chloride channel-3 mediates intracellular signaling.</a> Mol. Biol. Cell. 18, 2002-2012 (2007).</li>
<li>Vliet, A. vander <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NADPH+oxidases+in+lung+biology+and+pathology%3A+host+defense+enzymes+and+more%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic.+Biol.+Med%22%5BJournal%5D)">NADPH oxidases in lung biology and pathology: host defense enzymes and more.</a> Free Radic. Biol. Med. 44, 938-955 (2008).</li>
<li>Babior, B. M., Kipnes, R. S., Curnutte, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+defense+mechanisms.+The+production+by+leukocytes+of+superoxide%2C+a+potential+bactericidal+agent%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Biological defense mechanisms. The production by leukocytes of superoxide, a potential bactericidal agent.</a> J. Clin. Invest. 52, 741-744 (1973).</li>
<li>Lambeth, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NOX+enzymes+and+the+biology+of+reactive+oxygen%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">NOX enzymes and the biology of reactive oxygen.</a> Nat. Rev. Immunol. 4, 181-189 (2004).</li>
<li>Mukhopadhyay, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+detection+of+apoptosis+and+mitochondrial+superoxide+production+in+live+cells+by+flow+cytometry+and+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Simultaneous detection of apoptosis and mitochondrial superoxide production in live cells by flow cytometry and confocal microscopy.</a> Nat. Protoc. 2, 2295-2301 (2007).</li>
<li>Niethammer, P., Grabher, C., Look, A. T., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tissue-scale+gradient+of+hydrogen+peroxide+mediates+rapid+wound+detection+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A tissue-scale gradient of hydrogen peroxide mediates rapid wound detection in zebrafish.</a> Nature. 459, 996-999 (2009).</li>
<li>Medzhitov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toll-like+receptors+and+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Toll-like receptors and innate immunity.</a> Nat. Rev. Immunol. 1, 135-145 (2001).</li>
</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Die hier beschriebene Methode ermöglicht eine schnelle und quantitative Messung von reaktiven Sauerstoffspezies in lebenden Zellen entweder durch Oxidation Farbstoffe oder Plasmid-Sensoren. Agonisten der TLRs (Toll-like-Rezeptoren) sind Verbindungen, die Zellen durch die TLRs präsentieren auf der Zelloberfläche zu stimulieren und lösen die nachgeschalteten Signalwege 15. In unserem Protokoll haben wir drei verschiedene TLR-Agonisten nämlich, Lipo-Teichonsäure-TLR2-Agonist, Poly (I: C). TLR3-Agonist, LPS-TLR4-...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagens </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td></tr><tr><td> Attofluor Zellkammer </td><td> Invitrogen </td><td> A7816 </td></tr><tr><td> Antimycin A </td><td> Sigma Aldrich </td><td> A8674 </td></tr><tr><td> DMEM Low Glucose-Medium </td><td> Invitrogen </td><td> 10567-014 </td></tr><tr><td> Endothelial Growth Factor ergänzen (ECGS) </td><td> Upstate </td><td> 02-102 </td></tr><tr><td> Fetal Bovine Serum </td><td> Invitrogen </td><td> 12662011 </td></tr><tr><td> G418 </td><td> Invitrogen </td><td> 10131-027 </td></tr><tr><td> Gelatine </td><td> Sigma Aldrich </td><td> G1393 </td></tr><tr><td> H 2 DCFDA </td><td> Invitrogen </td><td> D-399 </td></tr><tr><td> LPS </td><td> Sigma Aldrich </td><td> L4516 </td></tr><tr><td> LTA </td><td> Sigma Aldrich </td><td> L2515 </td></tr><tr><td> MitoSOX Red </td><td> Invitrogen </td><td> M36008 </td></tr><tr><td> Opti-MEM I Reduzierte Serum Medium </td><td> Invitrogen </td><td> 51985091 </td></tr><tr><td> Pen / Strep (10x) </td><td> Invitrogen </td><td> 15140163 </td></tr><tr><td> Phyper-Zyto </td><td> Evrogen </td><td> FP941 </td></tr><tr><td> Phyper-dMito </td><td> Evrogen </td><td> FP942 </td></tr><tr><td> Poly (I: C) </td><td> Sigma Aldrich </td><td> P0913 </td></tr><tr><td> Prism Software 5.0 </td><td> GraphPad Software, Inc. </td><td></td></tr><tr><td> SigmaPlot 11,0 </td><td> Systat Software, Inc. </td><td></td></tr><tr><td> Trypsin-EDTA (10x) </td><td> Invitrogen </td><td> 15400054 </td></tr><tr><td> T-25 Flaschen </td><td> Corning </td><td> 430639 </td></tr><tr><td> T-75 Flaschen </td><td> BD Falcon </td><td> 353136 </td></tr><tr><td> 96-Loch-TC Mikro-Well-Platte </td><td> BD Falcon </td><td> 353072 </td></tr><tr><td> Zen 2009 Software </td><td> Carl Zeiss 510 META konfokale Mikroskopie </td><td></td></tr></tbody></table>

visualization of vascular ca 2 + signaling ausgelöst durch parakrine derived ros

Visualization of Vascular Ca2+ Signaling Triggered by Paracrine Derived ROS

Oxidativer Stress ist in einer Reihe von pathologischen Bedingungen, einschließlich Ischämie / Reperfusionsschaden und Sepsis in Verbindung gebracht. Das Konzept von oxidativem Stress bezieht sich auf die abweichende Bildung von ROS (reaktive Sauerstoffspezies), die O 2 • gehören -, H 2 O 2 und Hydroxylradikale. Reaktive Sauerstoffspezies beeinflusst eine Vielzahl von zellulären Prozessen, einschließlich der Signaltransduktion, Zellproliferation und Zelltod 1-6. ROS haben das Potenzial, Gefäß-und Organ-Zellen direkt schädigen, und kann sekundäre chemische Reaktionen und genetischen Veränderungen, die letztlich zu einer Verstärkung der ersten ROS-vermittelte Gewebeschäden führen zu initiieren. Ein wichtiger Bestandteil der Verstärkung Kaskade, die irreversible Gewebeschäden verschärft wird die Rekrutierung und Aktivierung von zirkulierenden Entzündungszellen. Während einer Entzündung, entzündliche Zellen Zytokine wie Tumor-Nekrose-Faktor-α (TNF) und Interleukin-1, dieaktivieren Endothelzellen (EC) und Epithelzellen und weiteren ergänzen die entzündliche Antwort 7. Vaskuläre endotheliale Dysfunktion ist ein fester Bestandteil der akuten Entzündung. Makrophagen dazu beitragen, die endotheliale Dysfunktion bei Entzündungen, die durch Mechanismen, die unklar bleiben. Die Aktivierung von Makrophagen Ergebnisse in der extrazellulären Freisetzung von O 2 • - und verschiedene pro-inflammatorische Zytokine, die pathologischen Signalisierung in benachbarten Zellen 8 auslöst. NADPH-Oxidasen sind die wichtigsten und primären Quelle von ROS in den meisten Zelltypen. In jüngster Zeit ist es von uns und anderen gezeigt, dass 9,10 ROS durch NADPH-Oxidasen produziert der mitochondrialen ROS-Produktion bei vielen pathophysiologischen Bedingungen zu induzieren. Daher Messung der mitochondrialen ROS-Produktion ebenso wichtig ist neben der Messung cytosolische ROS. Makrophagen produzieren ROS durch die Flavoprotein Enzym NADPH-Oxidase, die eine primäre Rolle bei Entzündungen spielt. Einmal aktiviert,phagocytic NADPH-Oxidase produziert reichlich O 2 • -, die wichtig sind in der Abwehrmechanismus des Wirts 11,12. Obwohl parakrine-derived O 2 • - spielt eine wichtige Rolle in der Pathogenese von Gefäßerkrankungen, Visualisierung von parakrine ROS-induzierte intrazelluläre Signalwege wie Ca 2 +-Mobilisierung ist noch Hypothese. Um ein Signal zu benachbarten Endothelzellen transduzieren - Wir haben ein Modell, in dem aktivierten Makrophagen als Quelle von O 2 • verwendet werden entwickelt. Mit diesem Modell zeigen wir, dass Makrophagen-derived O 2 • - auf Calcium-Signalgebung in angrenzenden Endothelzellen führen.

Eine effiziente Methode, um Einblicke in die Visualisierung der parakrine-derived ROS-Induktion von endothelialen Ca2 + Signal-Verstärkung wird beschrieben. Diese Methode nutzt die Vorteile der Messung parakrine abgeleitete ROS ausgelöst Ca2 +-Mobilisierung in vaskulären Endothelzellen in einer Co-Kultur-Modell.

Visualization of Vascular Ca 2 + Signaling Ausgelöst durch Parakrine Derived ROS

Oxidativer Stress wird mit einer Reihe pathologischer Zustände in Verbindung gebracht, darunter Ischämie-Reperfusionsschäden und Sepsis. Das Konzept des oxidativen ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, vaskuläre Kalziumsignale sichtbar zu machen, die durch perikrin gebildete reaktive Sauerstoffspezies oder r os ausgelöst werden. Dies wird erreicht, indem zunächst r os mit oxidationsempfindlichen Farbstoffen in aktiven Makrophagen visualisiert werden. R os können auch in endothelialen Zellen mithilfe plasmidbasierter fluoreszierender Sensoren dargestellt werden. Anschließend erfolgt die simultane Visualisierung von mit Cell Tracker Red markierten aktivierten Makrophagen und fluoreszenzmarkierten Endothelzellen in einem Kokultursystem. Schließlich wird die durch Makrophagen-abgeleitete ROS ausgelöste Kalziumsignalisierung in Endothelzellen mittels eines konfokalen Abbildungssystems gemessen.Diese Ergebnisse können ROS-Spiegel unabhängig voneinander sowie gleichzeitig die durch Peregrine-induzierte ROS-vermittelte intrazelluläre Calciummobilisierung nachweisen. Diese Methode ermöglicht die simultane Erfassung von zwei verschiedenen Signalmolekülen, die eng miteinander eine vaskuläre Signalgebung und eine pathophysiologische Simulatorsituation auslösen. Zwei Postdocs in meinem Labor, Karthik und Raj, werden das Verfahren anhand

visualization-vascular-ca2-signaling-triggered-paracrine-derived

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dieser Artikel beschreibt ein einfaches Modell für die Stimulierung der Angiogenese im Rattengekröse. Das Modell stellt eine dramatische Steigerung der Kapillare sprießen, vaskulären Bereich und vaskuläre Dichte über einen relativ kurzen Zeit natürlich in einem Gewebe, das en face Visualisierung der gesamten mikrovaskulären Netzwerken bis auf die Ebene einzelner Zellen ermöglicht.

Rattengekröse Exteriorisation: Ein Modell für die Untersuchung der Zelluläre Dynamik an der Angiogenese beteiligt

Wir beschreiben einen Matrigel-Plug-Assay, um das angiogene Potenzial eines Pools von Faktoren zu veranschaulichen, die von Krebszellen sezerniert werden, unter Verwendung von zwei komplementären Bildgebungsmodalitäten, Ultraschall und Endomikroskopie. Das Matrigel, ein extrazelluläres Matrix (ECM)-Imigel, wird verwendet, um den Wirt (die Maus) mit angiogenen Faktoren vertraut zu machen, die an das konditionierte Medium (C.M.) sezerniert werden.

Überwachungsfunktionen und Morphologie der Gefäßversorgung von Faktoren durch schnell wachsende Tumor erzeugende Zellen sezerniert rekrutiert

Hier beschreiben wir einen semi-invasiven optischen Mikroskopie-Ansatz zur Induktion eines photothrombotischen Gerinnsels in der somatosensorischen Hirnrinde einer Maus in vivo.  Es werden die technischen Aspekte des bildgebenden Verfahrens von der Induktion eines photothrombotischen Ereignisses über die Anwendung bis hin zur Datenerhebung beschrieben.

Rose Bengal Photothrombosis von konfokalen optischen Imaging<em&gt; In Vivo</em&gt;: Ein Modell des Einzelfahrzeug Stroke

Endotheliale Vorläufer, die aus induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSC-EPs) gewonnen werden, haben das Potenzial, Herz-Kreislauf-Behandlungen zu revolutionieren und die Schaffung von originalgetreueren Herz-Kreislauf-Erkrankungen zu ermöglichen. Dabei werden die Verkapselung von iPSC-EPs in dreidimensionalen (3D) Kollagen-Mikroumgebungen und eine quantitative Analyse des vaskulogenen Potenzials dieser Zellen beschrieben.

Ein In-Vitro-3D-Modell und eine Computational Pipeline zur Quantifizierung des vaskulogenen Potenzials von iPSC-derived endotheliaalen Vorläufern

In-vitro-Modelle der koronaren Angiogenese können für die Entdeckung der zellulären und molekularen Mechanismen der koronaren Angiogenese verwendet werden. In-vitro-Explantationskulturen von Sinusvenosus und Endokardgewebezeigen weisen als Reaktion auf VEGF-A ein robustes Wachstum auf und weisen ein ähnliches Muster der COUP-TFII-Expression auf wie in vivo.

In Vitro Modell der koronaren Angiogenese

Künstliche Gewebe sind stark auf geeignete vaskuläre Netzwerke angewiesen, um lebenswichtige Nährstoffe und Gase bereitzustellen und Stoffwechselabfälle zu entfernen. In dieser Arbeit erstellt ein schrittweises Seeding-Protokoll von Endothelzellen und Stützzellen hochorganisierte vaskuläre Netzwerke in einer Hochdurchsatzplattform, um das Entwicklung des Gefäßverhaltens in einer kontrollierten 3D-Umgebung zu untersuchen.

Schrittweise Zellaussaat auf tessellierten Gerüsten zur Untersuchung keimender Blutgefäße

Extrazelluläre Glutamat-ausgelöste systemische Kalziumsignalisierung ist entscheidend für die Induktion von pflanzlichen Abwehrreaktionen auf mechanische Wunden und Pflanzenfresserangriffe in Pflanzen. Dieser Artikel beschreibt eine Methode, um die räumliche und zeitliche Dynamik dieser beiden Faktoren mit Arabidopsis thaliana-Pflanzen zu visualisieren, die kalzium- und glutamatempfindliche fluoreszierende Biosensoren exprimieren.

Weitfeld-Echtzeit-Bildgebung lokaler und systemischer Wundsignale bei Arabidopsis

Dieser Assay verwendet embryonale Stammzellen der Maus, die in Embryoidkörperchen differenziert sind, die in 3D-Kollagengel kultiviert werden, um die biologischen Prozesse zu analysieren, die die Keimangiogenese in vitro steuern. Die Technik kann zum Testen von Medikamenten, zur Modellierung von Krankheiten und zur Untersuchung spezifischer Gene im Zusammenhang mit embryonal tödlichen Deletionen eingesetzt werden.

In vitro Dreidimensionaler Keimtest der Angiogenese unter Verwendung embryonaler Stammzellen der Maus für die Modellierung von Gefäßerkrankungen und Arzneimitteltests

Die vorliegende Studie skizziert eine hochgradig reproduzierbare und handhabbare Methode, um parakrine nichtkanonische Wnt-Signalereignisse in vitro  zu untersuchen. Dieses Protokoll wurde angewendet, um die Auswirkungen der parakrinen Wnt5a-Signalübertragung in murinen Neuralleistenzellen und Myoblasten zu bewerten.

Modellierung parakriner nichtkanonischer Wnt-Signalwege in vitro

In dieser Arbeit werden der zweidimensionale (2D) Scratch Wound Migration Assay und der dreidimensionale (3D) Sphäroid-Sphäroide-Assay zusammen mit ihren jeweiligen nachgeschalteten Analysemethoden, einschließlich RNA-Extraktion und Immunzytochemie, als geeignete Assays zur Untersuchung der Angiogenese in vitro vorgestellt.

Untersuchung der Angiogenese auf funktioneller und molekularer Ebene durch Nutzung des Scratch Wound Migration Assay und des Spheroid Sprouting Assay

Erfahren Sie, wie vaskuläre Calcium-Signalübertragung durch parakrine ROS in einem Ko-Kulturmodell aus Makrophagen und Endothelzellen visualisiert wird. Diese Methode nutzt oxidationsempfindliche Farbstoffe und konfokale Bildgebung.

Visualization of Vascular Ca^{2 +} Signaling Ausgelöst durch Parakrine Derived ROS

Weitere Videos entdecken