Visualization of Vascular Ca ^{2 +} Signaling Ausgelöst durch Parakrine Derived ROS

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die vaskuläre Kalziumsignalgebung sichtbar zu machen, die durch perikrine abgeleitete reaktive Sauerstoffspezies (r os) ausgelöst wird. Dies wird erreicht, indem zunächst R os mit oxidationsempfindlichen Farbstoffen in aktiven Makrophagen sichtbar gemacht wird. ROS kann auch in Endothelzellen mit Hilfe von plasmidbasierten Fluoreszenzsensoren sichtbar gemacht werden.

Fahren Sie dann fort, um gleichzeitig die rot markierten aktivierten Makrophagen und die Grippe von vier markierten Endothelzellen in einem Co-Kulturmodell zu visualisieren. Messen Sie schließlich die Kalzium-Signalübertragung in Endothelzellen, die durch Makrophagen-abgeleitete R os ausgelöst wird. Durch die Verwendung eines konfokalen Bildgebungssystems.

Diese Ergebnisse können sowohl unabhängig voneinander die Rs-Spiegel nachweisen als auch gleichzeitig die intrazelluläre Kalziummobilisierung beurteilen, die durch von Peregrine abgeleitete ROS ausgelöst wird. Diese Methode ermöglicht die gleichzeitige Beurteilung von zwei verschiedenen Signalmolekülen, die ein pathophysiologisches Setting für vaskuläre Signale und Simulatoren hervorrufen. Zwei Postdocs in meinem Labor, Karthik und Raj, werden das Verfahren an Roh- und Kalziummessungen und Interaktionen mit Makrophagen-Endothelzellen demonstrieren.

Kultivieren Sie von Monozyten abgeleitete Makrophagen aus der Maus auf 35-Millimeter-Schalen mit Glasboden. Fordern Sie dann die Zellen mit Toll-like-Rezeptor-Agonisten heraus und inkubieren Sie sechs Stunden lang bei 37 Grad Celsius. Zur Visualisierung des Zytosolischen.

ROS fügen oxidationsempfindlichen Farbstoff hinzu und inkubieren die Zellen 20 Minuten lang. Visualisieren Sie nun die Zellen auf einem temperaturkontrollierten Tisch eines konfokalen Bildgebungssystems. Um die mitochondriale ROS in TLR-aktivierten Zellen sichtbar zu machen, fügen Sie alternativ den mitochondrialen Superoxid-Indikator hinzu und inkubieren Sie die Zellen 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius.

Behandeln Sie die Zellen für eine Negativkontrolle entweder mit PBS oder DMSO für eine Positivkontrolle. Behandeln Sie die Zellen mit zwei millimolaren Antimycinen. Ein Verfahren zur Visualisierung aller Zellen auf dem temperaturkontrollierten Tisch eines konfokalen Bildgebungssystems.

Analysieren Sie mit der Image J-Software alle Bilddaten. Der Fluoreszenzsensor erfasst hyperspezifisch submikromolare Konzentrationen von Peroxid und basierend auf der Säugetierexpression kann das Vektordesign entweder auf das Zytoplasma oder auf die Mitochondrien ausgerichtet werden. Mittels Elektroporation erzeugen Sie stabile Linien von pulmonalen mikrovaskulären Endothelzellen der Maus, die ein ingeeignetes Hyperexpressionsplasmid tragen.

Um das Wachstum von Kolonie-Plattenzellen bei geringer Dichte in vollständiger TMEM zu erleichtern und 48 Stunden lang zu inkubieren, ersetzen Sie das Medium durch vollständiges Kulturmedium, das mit einem Auswahlantibiotikum ergänzt wird. Untersuchen Sie Klone auf den höchsten Prozentsatz hyperpositiver Zellen und amplifizieren Sie die Kultur, um in einzelnen Experimenten stabile hyperpositive Linien zu erzeugen. Samenzellen auf 0,2 %-gelatinebeschichteten Deckgläsern und über Nacht auf 80 %-Konfluenz kultivieren.

Aktivieren Sie nun die Zellen mit TLR-Liganden und inkubieren Sie sechs Stunden lang bei 37 Grad Celsius. Für den Nachweis von zytoplasmatischer ROS montieren Sie die Deckgläser der Zellen auf eine Adelo-Zellkammer. Fügen Sie einen Milliliter Vorwärmbecken hinzu, balancieren Sie die Salzlösung aus und stellen Sie die Kammer auf eine temperaturkontrollierte Stufe des konfokalen Bildgebungssystems.

Aufzeichnung von Fluoreszenzänderungen in Zellen zum Nachweis von Mitochondrien. ROS. Fügen Sie eine Positivkontrolle von zwei mikromolaren Antimycin A hinzu. Bereiten Sie dann die Deckgläser der behandelten Zellen für die konfokale Mikroskopie vor. Führen Sie eine Bildanalyse mit der Image J-Software durch.

Beginnen Sie mit Endothelzellen, die auf gelatinebeschichtete Glasdeckgläser gezüchtet wurden, um intrazelluläre Kalziumveränderungen sichtbar zu machen und zu messen. Inkubieren Sie Zellen im Fluoreszenzfarbstoff Grippe oh 4:00 Uhr bei Raumtemperatur für 30 Minuten, um den Farbstoffverlust zu minimieren Waschzellen mit experimenteller Bildgebungslösung, die die Suen-Pyrozone enthält. Montieren Sie nun die Deckfolien auf eine Adelo-Zellkammer mit 800 Mikrolitern vorgewärmter experimenteller Bildgebungslösung und positionieren Sie die Zellen auf einem temperaturkontrollierten Tisch des konfokalen Bildgebungssystems in einem separaten Röhrchen.

Verwenden Sie 15 Minuten lang 500 Nanogramm pro Milliliter Cell Tracker red C-M-T-P-X, um die untersuchte Makrophagenpopulation zu markieren, Zellen zu waschen und Pellets in 200 Mikrolitern experimenteller Bildgebungslösung zu resuspendieren. Nun gibst du die markierten Makrophagen auf die Grippe oh 4:00 AM geladen. Endothelzellen in der konfokalen Kammeranordnung zeichnen die grüne und rote Fluoreszenz alle drei Sekunden für 10 Minuten auf.

In diesem Experiment wurden J 7 74 0,1 Zellen sechs Stunden lang mit TLR zwei, drei und vier Liganden provoziert. Repräsentative konfokale Bilder zeigen ein erhöhtes zytosolisches R os, gemessen mit DCF. Interessanterweise zeigt die rote Fluoreszenz der Mitosen einen ähnlichen Anstieg der mitochondrialen ROS an.

Diese Fluoreszenzänderungen sind quantitativ. Daher müssen die Ergebnisse normalisiert und als relative Faltungsänderung pro Behandlung ausgedrückt werden, das Antimycin-A-Signal validiert eine positive Kontrolle für die mitochondriale ROS-Produktion. Diese Abbildung zeigt Bilder der endothelialen, zytosolischen und mitochondrialen Peroxidspiegel bei stabiler Expression von Hyper-Cyto oder Hyper-D-Mito.

MP ECS stimuliert mit TLR-Agonisten. Die Quantifizierung der mittleren Fluoreszenzänderung zeigt eine Zunahme der Hyper-Cyto- und Hyper-D-Mito-Fluoreszenz nach sechsstündiger Stimulation in einem Co-Kultur-System. Zur Beurteilung des Peregrine-ROS-Signalwegs wurden frisch isolierte Mirin-Makrophagen sowohl von Wildtyp- als auch von GP 91 Fox-Nullmäusen sechs Stunden lang mit einem Mikrogramm pro Milliliter LPS aktiviert.

Makrophagen wurden mit C-M-T-P-X rot markiert und zu grüner Grippe vier hinzugefügt. Geladen. MPM ecs. Interessanterweise lösten LPS-aktivierte Makrophagen, die aus Wildtyp-Mäusen isoliert wurden, eine große und schnelle Kalziummobilisierung im MPM ECS aus, verglichen mit Makrophagen von GP 91 Fox Null-Mäusen.

Während LI versucht, dieses Verfahren durchzuführen, ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass entweder längeres Herunterladen oder Laserbelichtung zu einer Autooxidation von DCF führen. Es ist wichtig, das Photobleaching von Hyper-Cyto und Hyper-D-Mitral zu vermeiden. Einmal gemeistert, kann die RA-Messung sowohl in Makrophagen als auch in Endothelzellen in sieben Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig durchgeführt wird.