Retrograde Perfusion und Abfüllung von Maus Koronargefäße als Vorbereitung für die Mikro-Computertomographie Imaging

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, das koronare Gefäßsystem mit einem röntgendichten Farbstoff zu füllen, um die Mikro-Computertomographie oder Mikro-CT-Bildgebung vorzubereiten. Zuerst wird die Bauchhöhle der Maus geöffnet und die Bauchschlagader kanüliert. Dann wird das Gefäßsystem mit einem gefäßerweiternden Puffer perfundiert, gefolgt von der Perfusion mit dem AFF-Fixiermittel.

Die Gefäße werden dann ligiert, um sowohl den PERFUSE acht zu lenken, als auch um potenzielle Leckstellen zu blockieren. Zum Schluss werden die Herzkranzgefäße mit röntgendichtem Farbstoff gefüllt. Die vollständige Füllung des Herzkranzgefäßes kann durch visuelle Analyse des Herzens oder durch Mikro-CT-Bildgebung und -Analyse beurteilt werden.

Diese Methode kann jedoch Einblicke in das koronare Gefäßsystem, Verzweigungsmuster sowie Gefäßverschlüsse und andere Erkrankungen der Herzkranzgefäße geben. Es kann auch auf andere Gefäßnetzwerke in anderen Organsystemen wie Gehirn, Niere oder Hintergliedmaßen angewendet werden. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die Schritte der Gefäßligatur schwer zu erlernen sind.

Wenn Sie mit der Gefäßanatomie nicht vertraut sind, kann es auch eine Herausforderung sein, die richtigen Gefäße im umgebenden Gewebe zu finden und abzubinden. Füllen Sie vor Beginn des Eingriffs eine Seite eines Druckperfusionsgeräts mit Vasodilatatorpuffer und die andere mit 4% Paraformaldehyd in PBS. Füllen Sie anschließend eine halbe CC-Insulinspritze mit einer 29-Gauge-Half-Inch-Nadel mit 0,1 Millilitern von einem bis 100 Heparin.

Biegen Sie dann die Nadel mit der Fase nach oben in einen Winkel von etwa 120 Grad. Füllen Sie zum Schluss eine Ein-Milliliter-Spritze mit einer 26-Gauge-Half-Inch-Nadel mit 0,4 Millilitern gesättigter Kaliumchloridlösung und biegen Sie die Nadel dann auf 120 Grad, wie gerade gezeigt. Nachdem Sie die Maus betäubt und das Tier mit der Bauchseite nach oben an die Präparierschale geheftet haben, besprühen Sie das Tier mit Ethanol, bis seine Haare nass sind.

Öffnen Sie dann die Bauchhöhle mit einem Mittellinienschnitt. Ziehen Sie die Haut zurück, um die Organe freizulegen, und bewegen Sie den Darm zur Seite, so dass die hintere Vena CVA oder PVC zugänglich ist. Reinigen Sie bei Bedarf Fett oder Bindegewebe und injizieren Sie die vorbereitete Heparinlösung in das PVC.

Während du die Nadel herausziehst. Decken Sie das Nadelloch mit einem Applikator mit Wattespitze ab, um ein Auslaufen zu verhindern, und halten Sie den Applikator einige Sekunden lang an Ort und Stelle, bis die PVC-Wand gerinnt und versiegelt ist. Nachdem Sie zwei bis drei Minuten gewartet haben, bis sich das Heparin im Mauskreislauf verteilt hat, präparieren Sie das Zwerchfell und den Brustkorb, damit die harten Schläge sichtbar gemacht werden können.

Dann die vorbereitete Kaliumchloridlösung langsam in das PVC injizieren, bis das Herz stillsteht. Schneiden Sie als Nächstes das PVC in der Nähe der Höhe des Zwerchfells ab, so dass der Teil proximal zum Herzen in den nachfolgenden Schritten leicht zu lokalisieren ist. Entfernen Sie dann alle Organe unterhalb des Zwerchfells und entfernen Sie den hinteren Teil der Maus.

Suchen Sie nun das abgeschnittene Ende der Aorta und platzieren Sie ein langes Stück geflochtene Seidennaht mit sechs Strichen Null auf sich selbst unter der Aorta, einige Millimeter vor dem abgeschnittenen Ende. Schneiden Sie dieses lange Stück Naht so ab, dass sich zwei unter der Aorta befinden. Führen Sie schließlich den Katheter in das abgeschnittene Ende der Aorta ein und binden Sie jede Naht mit einem Doppelknoten zusammen, um den Katheter an Ort und Stelle zu halten und zu verhindern, dass ein Gegendruck in der Aorta austritt.

Beginnen Sie damit, das Druckperfusionsgerät an den Katheter anzuschließen. Pumpen Sie dann den Perfusionsapparat auf einen Antriebsdruck von 100 bis 110 Millimetern Quecksilber, um die Gefäße mit Vasodilatatorpuffer zu perfundieren. Stellen Sie sicher, dass der Puffer durch die Koronargefäße durchdringt, indem Sie bestätigen, dass Flüssigkeit aus dem PVC austritt, während Sie darauf warten, dass die Flüssigkeit klar abläuft.

Präparieren Sie die Rippen und stecken Sie den Brustkorb zurück, um das Herz freizulegen. Sobald er freigelegt ist, tropft Squeeze den Puffer von einem mit Puffer getränkten Stück Gaze auf das Herz, um ihn vor dem Austrocknen zu bewahren. Den Thymus entfernen.

Den Aortenbogen freizulegen Die Ligatur der Gefäße ist der schwierigste Aspekt dieses Eingriffs. Die Lokalisierung der Gefäße, die am Aortenbogen befestigt sind, kann für den Anfänger sehr frustrierend sein, aber sobald man die Anatomie der Gefäße verstanden hat, lernt man, darauf zu vertrauen, dass die Gefäße vorhanden sind, auch wenn sie durch das Fett und anderes Bindegewebe nicht klar zu sehen sind. Das Platzieren der Nähte erfordert Geduld und eine ruhige Hand, aber es ist eine Fähigkeit, die mit der Übung einfacher wird.

Dann werden sechs geflochtene Seidennaht-Lige, die drei großen Aortenäste, verwendet, um sicherzustellen, dass die Flüssigkeit durch die Herzkranzgefäße und nicht durch diese größeren Gefäße mit niedrigem Widerstand umgeleitet wird. Anschließend das Herz 15 Minuten lang mit Fixiermittel durchbluten. Dann mindestens zwei Minuten lang mit Vasodilatationspuffer spülen.

Um zu verhindern, dass die Mikrofill nach der Injektion aus dem Herzen austritt, ligieren Sie in der Zwischenzeit die erste vordere Hohlvene und dann die zweite vordere Hohlvene. Legen Sie Nähte um das PVC und die Aorta, aber ziehen Sie sie erst nach dem Befüllen fest. Nachdem Sie die Mikrofüllung vorbereitet und in eine Ein-Milliliter-Spritze geladen haben, füllen Sie das Präpariertablett mit einem F-Wasser, um den Katheter zu bedecken.

Trennen Sie nun das Perfusionsgerät vom Katheter und schließen Sie die Microfill-Spritze an. Injiziere die Mikrofüllung in die Aorta. Es füllt zuerst die Arterien und gelangt dann in die Kapillaren, wodurch das Gewebe mit der Farbe der Mikrofüllung gerötet wird.

Beachten Sie, wie die hydrophobe Natur der Mikrofüllung dazu führt, dass sie zunächst als unabhängige Kugeln erscheint, wenn sie aus den kleineren Gefäßen austritt. Eine vollständige Füllung ist sichtbar, wenn die Mikrofüllung kontinuierlich in den Gefäßen verläuft und durch das PVC austritt. Nachdem die Füllung abgeschlossen ist, ziehen Sie die Nähte um das PVC und die Aorta schnell fest, um zu verhindern, dass die elastische Natur des Herzgewebes die Mikrofüllung aus den Gefäßen herdrückt.

Vermeiden Sie während des Polymerisationsprozesses äußeren Druck auf das Herz, wie z. B. das Anheben oder Drehen des Herzens, um einen frühen Blick auf die gefüllten Gefäße im hinteren Teil des Herzens zu erhalten. Tränken Sie dann etwas Gaze in Wasser aus der Präparierschale und bedecken Sie das Herz mit der Gaze, damit es nicht austrocknet. Lassen Sie das Herz etwa eine Stunde bei Raumtemperatur ruhen, bis die Mikrofüllung polymerisiert ist.

Zum Schluss entfernen Sie das Herz und fixieren es in 4%PFA über Nacht bei vier Grad Celsius. Schieben Sie dann das Herz in 70%Ethanol und lagern Sie es bei vier Grad Celsius. Gefäße, die effektiv durch Mikrofüllung durchblutet sind, haben eine kontinuierliche, ununterbrochene Mikrofüllung in den Gefäßen.

Wie in dieser ersten Abbildung gezeigt, kann das Ausmaß der Füllung der Herzkranzgefäße mit dem Auge beurteilt werden. Die Adern sind episch lokalisiert und leicht zu erkennen, wie die Pfeilspitze anzeigt. Die Arterien, die eher intramyokardial sind, sind ebenfalls durch die Oberfläche des Herzens sichtbar und hier durch den Pfeil gekennzeichnet.

Auch die Kapillarfüllung ist erkennbar. Betrachten Sie in dieser Figur einen kapillardichten Bereich des Herzens, der durch den Stern gekennzeichnet ist. Gelegentlich kann es zu Verstopfungen kommen, die die Füllung eines Teils des Gefäßbettes verhindern.

So machen sich Gefäßnetzwerke, die sich nicht füllen, aufgrund des Fehlens der Mikrofüllung bemerkbar, wie hier mit einem Pfeil angedeutet. Es kann zu weiteren Brüchen in der Mikrofüllung kommen, die beispielhaft mit einem Sternchen gekennzeichnet sind. Eine unvollständige Füllung kann auch entstehen, wenn bei der Microfill-Verabreichung zu wenig Druck ausgeübt wird, da die Microfill nicht in alle Kapillarnetzwerke gepresst wird.

Beachten Sie, dass das Gewebe die gelbe Farbe der Mikrofüllung nicht angenommen hat, was darauf hinweist, dass die Mikrofüllung nicht in die Kapillaren eingedrungen ist. Umgekehrt kann zu viel Druck dazu führen, dass die Kapillaren platzen und die Mikrofüllung in das umgebende Gewebe abgegeben wird, wie durch den Pfeil hervorgehoben. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, die Mikrofüllung nicht zu schnell oder mit zu viel Druck zu injizieren, da die Gefäße platzen und den Gefäßgips ruinieren.

Befolgen Sie das Verfahren bei der Mikro-CT-Untersuchung. Andere Methoden, wie z.B. die immunhistochemische Analyse, können durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten und die Gefäße und das umgebende Gewebe besser zu charakterisieren.