Name: Retrograde Perfusion und Abfüllung von Maus Koronargefäße als Vorbereitung für die Mikro-Computertomographie Imaging (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: Lernen Sie die retrograde Perfusion und Abfüllung von Maus-Koronargefäßen mit radiopakem Silikonkautschuk als Vorbereitung für die Mikro-CT-Bildgebung. Diese Methode ermöglicht die detaillierte Visualisierung koronarer Gefäßstrukturen.

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Wir danken Dr. Kelly Stevens für erste Versuche des Protokolls, Dr. Michael Simons, Dr. Kip Hauch, und die Mitglieder der beiden ihre Labore für allgemeine Diskussionen. Diese Arbeit ist die Unterstützung durch Zuschüsse NIH HL087513 und P01 HL094374.

1. Vorbereitungen vor dem Start <ol><li> Füllen jeder Seite der Druck-Perfusion mit Vasodilator-Puffer (4 mg / l Papaverin + 1 g / l Adenosin in PBS) oder 4% Paraformaldehyd (PFA) in PBS, jeweils. </li><li> Bereiten Sie eine 1/2cc Insulinspritze (mit einer dauerhaft befestigten 29G ½ &quot;Nadel) durch Füllen mit 0,1 ml der 1:100 Heparin (5000 E Lager) und Biegen der Nadel auf ~ 120-Grad-Winkel mit der Fase auf. Haben die dasselbe mit einer 1 ml Spritze (mit einer 26G ½ &quot;Nadel) mit 0,3 ml gesättigter KCl-Lösung gefüllt. </li></ol> 2. Aussetzen des Herzens und Kanülierung der Aorta <ol><li> Betäuben die Maus mit Ihrer Narkose der Wahl. (Wir verwenden eine Überdosis eines Ketamin / Xylazin Mischung:. IP-Injektion von 130 mg / kg Ketamin und 8,8 mg / kg Xylazin in Kochsalzlösung) </li><li> Stecken Sie die narkotisierten Maus auf das Sezieren Tablett, ventralen Seite nach oben. Öffnen Sie die Bauchhöhle mit einem Einschnitt an der Mittellinie zurückziehen und die Hautum die Organe zu entlarven. Bewegen Sie den Darm zu einer Seite, um einen Bereich der hinteren Hohlvene (PVC) freizulegen. </li><li> Injizieren Sie Heparin-Lösung in das PVC. Wie Sie die Nadel zu extrahieren, decken Sie die Nadel Loch mit einem Wattestäbchen zu verhindern undicht und halten Sie ihn für einige Sekunden, bis die PVC-Wand Blutgerinnsel und Dichtungen. 2-3 Minuten warten für Heparin auf der ganzen Maus Umlauf zu zerstreuen. </li><li> Präparieren Sie das Zwerchfell und Brustkorb, so dass Sie das schlagende Herz zu beobachten. Langsam injizieren KCl-Lösung in der PVC bis das Herz Verhaftungen. </li><li> Löschen aller Organe unter der Membran und den Verbrauchsteuern der hintere Teil der Maus, so dass der Bereich der vorderen Membran intakt. Entfernen der Membran, wobei darauf geachtet, die PVC in der Nähe der Membran geschnitten, so dass die proximalen Abschnitt zum Herzen ist leicht in den nachfolgenden Schritten zu lokalisieren. </li><li> Suchen Sie das abgeschnittene Ende des Aorta. Setzen Sie einen langen Länge von 6-0 geflochtene Seidenfaden unter der Aorta wenige Millimeter vorderen herm das abgeschnittene Ende, so dass die Naht auf sich selbst zurück verdoppelt. Schneiden Sie diesen länger Naht in der Mitte so gibt es 2 Stück der Naht unter der Aorta sind. Legen Sie die Angiokatheter in das abgeschnittene Ende der Aorta (Abb. 1A, B) und binden jede Naht mit einem Doppel-Knoten, um die Angiokatheter in Position zu halten und verhindern, dass Rücken-Druck in der Aorta ein Auslaufen. </li></ol> 3. Perfusion und Microfil Injektion <ol><li> Schließen Sie das Angiokatheter dem Druck Perfusionsapparatur (Abb. 2) und beginnen Perfusion der Gefäße mit gefäßerweiternden Puffer (Abb. 1C) durch Pumpen des Perfusionsapparatur zu einem treibenden Druck von 100-110 mmHg. Überprüfen, dass Puffer wird durch Perfusion der Koronararterien, indem sichergestellt wird Flüssigkeit aus dem PVC austritt. Weiter für mindestens 3 Minuten oder bis die Perfusion Flüssigkeit aus der PVC-frei ist. (Mit den nächsten Schritten fortfahren, während Perfusion.) </li><li> Sezieren die Rippen und Stift zurück (oder entfernen) der Brustkorb um das Herz freizulegen. Einmal ausgesetzt, CA seinumsichtig nicht zu lassen das Herz austrocknen durch Quetschen Tropfen Puffer auf das Herz aus einem Puffer-getränkten Stück Gaze. Räumen Sie den Thymus, um den Aortenbogen aussetzen. Ligieren der drei wichtigsten Aortenäste mit 6-0 geflochtene Seidenfaden, um Flüssigkeit zu gewährleisten wird durch die Koronarien und nicht durch diesen größeren, mit geringem Widerstand Gefäße (Abb. 1D) umgeleitet. </li><li> Perfundieren das Herz mit Fixativ für 15 Minuten, dann mit Vasodilatation Puffer spülen für mindestens 2 Minuten. Unterdessen ligieren sowohl anterior Hohlvene zu Microfil austritt aus dem Herzen nach der Injektion (Abb. 1E) zu verhindern. Ort Nähte rund um die PVC-und der Aorta, aber nicht festziehen, bis sie nach dem Befüllen. </li><li> Bereiten Sie die Microfil (wie in der Tabelle der Reagenzien angegeben) und laden Sie sie in einer 1 ml Spritze. Füllen der Dissektion Tablett mit genügend Wasser, um den Katheter (um die Einführung von Luft zu verhindern, wenn von dem Infusionsschlauch Microfil Spritze) bestimmt. Trennen Sie die Perfusion apparatus aus dem Katheter und verbinden Sie das vorbereitete Microfil Spritze. </li><li> Spritzen Sie die Microfil in die Aorta bis gute Füllung der Koronararterien ist offensichtlich (Abb. 1F, 3A): Die Arterien werden zuerst zu füllen, und dann die Microfil wird &quot;Spill&quot; in die Kapillaren, wie die Gewebe spült mit der Farbe des Microfil. Wenn auf der venösen Seite, bewirkt, dass die hydrophobe Natur des Microfil es zunächst als eigenständige Sphären erscheinen, wie es von den kleineren Gefäßen austritt. Halten Sie die Microfil injizieren, bis eine kontinuierliche Spalte füllt die Adern. Vollständige Füllung wird offensichtlich sein, wenn die Microfil stetig in den Gefäßen, und es wird durch das PVC beendet. </li><li> Nach dem Füllen abgeschlossen ist, schnell ziehen die Fäden, die zuvor in der PVC und Aorta platziert wurden, um die elastischen Eigenschaften des Herzgewebes nicht mehr gequetscht die Microfil aus den Gefäßen zu verhindern. </li><li> Decken Sie das Herz mit feuchter Gaze (getränkt mit Wasser aus dem Sezieren Tablett) Zur Verhinderung seiner Austrocknung, und lassen Sie ihn für etwa 1 Stunde bei Raumtemperatur sitzen, bis der Microfil hat polymerisiert. Vermeiden Sie Druck von außen auf das Herz während der Polymerisation, wie das Anheben oder Drehen des Herzens in einem Versuch, einen frühen Blick auf die gefüllten Gefäße auf der Rückseite des Herzens zu bekommen. Dies kann Microfil von einigen Gefäßen gezielt in einer elastischen Bereich des Herzens, was Brüche in der Microfil. </li><li> Entfernen Sie das Herz und die Post-fix it in 4% PFA über Nacht bei 4 ° C. Dann in 70% Ethanol bei 4 ° C Das Herz Gefäßsystem ist nun bereit für μCT Bildgebung. </li></ol> 4. Repräsentative Ergebnisse Schiffe, die von einer Microfil perfundiert werden müssen kontinuierlichen, ununterbrochenen Microfil in den Gefäßen (3A). Das Ausmaß der Befüllung der Herzkranzgefäße können mit dem Auge beurteilt werden; Venen werden epikardial 18 befindet, und kann leicht beobachtet werden (Abb. 3A, Pfeilspitze); Arterien,die mehr intramyokardialen 18, sind auch über die Oberfläche des Herzens (3A, Pfeil) sichtbar. Kapillare Befüllung ist auch ersichtlich, wie Herz-Gewebe hat eine sehr hohe Dichte von Kapillaren, und daher, wenn die Kapillaren Füllung, das Herzgewebe mit der Farbe des Microfil (3A, Stern) zu spülen. Somit werden alle Gefäßnetze, die zu füllen nicht wahrnehmbar sein aufgrund des Fehlens der Microfil (3B, C). Brüche in der Microfil (Sternchen in Abb. 3B) erscheinen oft, weil die hydrophobe Natur des Microfil dazu führt das er in sich selbst zusammenziehen und verursachen &quot;Pausen&quot; im gefüllten Gefäße. Diese &quot;Pausen&quot; kann reduziert werden, wenn der Druck innerhalb der Gefäße durch die richtige Krawatte-offs der vaskulären Ausspeisepunkte aus dem Herzen aufrechterhalten wird. Andere Unterbrechungen können durch Luftblasen innerhalb der Mikrofiltration verursacht werden. Um das Eindringen von Luft zu verhindern, stellen Sie sicher das Angiokatheter vollständig in Wasser getaucht, wenn das Umschalten von der Durchblutung ap<html> paratus dem Microfil Spritze. Wenn eine Luftblase eingeführt wird, kann es oft einfach nur durch die Fortsetzung des Microfil Perfusion bis die Blase wurde durch und schob aus der Herzkranzgefäße entfernt werden. Vaskuläre Netzen kann nicht vollständig ausfüllt, wenn ein Teil der Strombahn blockiert (3B, Pfeil). Während Heparin hemmt die Bildung von Blutgerinnseln, kann gelegentlich noch Blockaden aufgrund von unvollständigen Heparin Perfusion vor dem Beginn des Verfahrens oder durch andere unbekannte Faktoren auftreten. Wenn eine Verstopfung auftritt, gibt es nach unserem Wissen kein Verfahren zum Lösen der Blockierung des vaskulären Füllung abzuschließen. Unvollständige Füllung kann auch auftreten, wenn zu wenig Druck während der Befüllung, die Microfil nicht in allen Gefäßbetten und Kapillarnetzwerke (3C) gezwungen werden verwendet wird. Umgekehrt kann zu viel Druck verursachen die Kapillaren zu platzen und extravasieren Microfil in das umgebende Gewebe (Abb. 3D). files/ftp_upload/3740/3740fig1.jpg &quot;alt =&quot; Bild 1 &quot;/&gt; Abbildung 1. Übersicht über die Perfusion Microfil Schema. (A) Die Aorta und die PVC etwa auf Höhe der Membran geschnitten. (B) Die aufsteigende Aorta ist mit einem Angiokatheter kanüliert. (C) Vasodilatation Puffer wird durch die Gefäße, durch den Druck Perfusionsapparatur (nicht abgebildet) angetrieben, während perfundiert (D) die drei wichtigsten abzweigt des Aortenbogens ligiert werden. (D) 4% PFA wird durch die Koronarien perfundiert, während die beiden vorderen Vena Cava ligiert werden. (F) mit einer Spritze wird durch die Koronararterien Microfil perfundiert, bis es wird beobachtet, Austritt aus der PVC. <img src="/files/ftp_upload/3740/3740fig2.jpg" alt="2"/> Abbildung 2. Perfusionsapparatur. Zwei Erlenmeyerkolben, die jeweils entweder mit Vasodilatation Puffer oder 4% PFA gefüllt ist, verbunden sind und unter Druck durch Rohre verbunden, um ihre Seitenarme. Das System ist unter Druck durch manuelles Pumpen derGlühlampe und ein Manometer einem der Kolben verbunden ist für die Überwachung und Aufrechterhaltung des Drucks zu ermöglichen. Kleine Rohre erstrecken sich durch Gummistopfen und nach unten in die Flüssigkeit in jeder Flasche. Der Druck der Eingabe von den Seitenarmen pumpt die Flüssigkeit aus jedem Kolben aus dieser kleineren Röhren. Die Rohre dann verschmelzen zu einem Hahn, die nur erlaubt, um von einer Flüssigkeit Kolben zu einem Zeitpunkt, zu fließen. <img src="/files/ftp_upload/3740/3740fig3.jpg" alt="Abbildung 3"/> Abbildung 3. Probieren Sie Mikrogefüllte Herzen. (A) Schiffe, die gut gefüllt sind, haben nur wenige (wenn überhaupt) Brüche in der Microfil, und das Herzgewebe wird färbte die Farbe des Microfil aufgrund der gefüllten Kapillaren (Stern, und vergleichen Sie mit C) sein. Beide Arterien (Pfeil - Ramus interventricularis anterior) und Venen (Pfeilspitze - Left Koronarvene) sind sichtbar durch das Herz Oberfläche. (B) Ein Herz mit Brüchen in der Microfil (Sternchen) sowie Blockaden in einigen Gefäßen, die komplette Mic verhindertRofil Penetration. Die blockierten Schiffe bleiben rot (Pfeil), wie das Blut nicht erfolgte während der Perfusion Prozess gespült. (C) Ein Herz mit Schiffen, die unvollständig ausgefüllt wurden. Beachten Sie, das Gewebe nicht auf die gelbe Farbe des Microfil genommen, was auf die Microfil nicht in die Kapillaren eindringen. (D) ein Herz, in dem die Kapillaren Burst während der Befüllung, wodurch die Microfil in das umgebende Gewebe (Pfeil) auslaufen.

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<li>Wagner, S., Helisch, A., Ziegelhoeffer, T., Bachmann, G., Schaper, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic+resonance+angiography+of+collateral+vessels+in+a+murine+femoral+artery+ligation+model%5BTitle%5D)+AND+%22NMR+in+Biomedicine%22%5BJournal%5D)">Magnetic resonance angiography of collateral vessels in a murine femoral artery ligation model.</a> NMR in Biomedicine. 17, 21-27 (2004).</li>
<li>Cochet, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+MR+angiography+and+velocity+measurement+in+mice+coronary+arteries+at+9.4+T%3A+assessment+of+coronary+flow+velocity+reserve%5BTitle%5D)+AND+%22Radiology%22%5BJournal%5D)">In vivo MR angiography and velocity measurement in mice coronary arteries at 9.4 T: assessment of coronary flow velocity reserve.</a> Radiology. , 254-441 (2010).</li>
</ol>

Die Mäuse wurden mit Methoden, die von der Institutional Animal Care und Use Committee der University of Washington und in Übereinstimmung mit dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren durch den US National Institutes of Health (NIH Publikation Nr. 85-23 veröffentlicht genehmigt behandelt, überarbeitet 1996).

Herzgewebe hat einen sehr hohen metabolischen Bedarf, und erfordert daher eine konstante Versorgung mit Nährstoffen und Sauerstoff aus dem Blut durch die Koronargefäße geliefert. Erkrankungen der Herzkranzgefäße, der koronaren Funktion aufgrund Gefäßstenose und Verstopfung zu verringern, kann das Gewebe Hypoxie und Ischämie führen, und setzen die betroffenen Patienten mit einem Risiko für Myokardinfarkt und zu irreparablen Schäden am Herzmuskel. Ein besseres Verständnis des erkrankten Zustand dieser Gefäße ist notwendig...

<html><table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> 1 ml-Spritzen </td><td> <a href="http://www.bd.com/" target="_blank">Becton Dickinson</a> </td><td> BD-309.602 </td><td></td></tr><tr><td> 1/2cc Insulin Spritzen mit fest 29G ½ &quot;Nadeln </td><td> <a href="http://www.bd.com/" target="_blank">Becton Dickinson</a> </td><td> BD-309.306 </td><td></td></tr><tr><td> 2 &quot;x 2&quot; Gaze-Pads </td><td> Med101store.com </td><td> SKU 2208 </td><td></td></tr><tr><td> 24G ¾ &quot;Angiocath IV-Katheter </td><td> <a href="http://www.bd.com/" target="_blank">Becton Dickinson</a> </td><td> BD-381.112 </td><td></td></tr><tr><td> 26G ½ &quot;Gauge-Nadeln </td><td>Lank &quot;&gt; Becton Dickinson </td><td> BD-305.111 </td><td></td></tr><tr><td> Adenosin </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/" target="_blank">Sigma</a> </td><td> A9251 </td><td> 1 g / l in PBS für Vasodilatation Puffer (mit Papaverin) </td></tr><tr><td> Graefe Pinzette abgewinkelt </td><td> <a href="http://www.finescience.com/" target="_blank">Fine Science Tools</a> </td><td> 11052-10 </td><td></td></tr><tr><td> Wattestäbchen: 6 &quot;nicht-sterilen </td><td> <a href="http://www.cardinal.com/" target="_blank">Cardinal Health</a> </td><td> C15055-006 </td><td></td></tr><tr><td> Gebogene Chirurgische Schere </td><td> <a href="http://www.finescience.com/" target="_blank">Fine Science Tools</a> </td><td> 14085-09 </td><td></td></tr><tr><td> Dissecting Stereoskop und Lichtquelle </td><td> <a href="http://www.nikon.com/" target="_blank">Nikon</a> </td><td> NA </td><td> NA </td></tr><tr><td> Dissecting Tray, 11,5 x 7,5 cm </td><td> <a href="http://www.coleparmer.com/" target="_blank">Cole-Parmer</a> </td><td> YO-10915-12 </td><td> Gefüllt mit Teer für Pinning Sie die Maustaste </td></tr><tr><td> Feine einer gebogenen Pinzette </td><td> <a href="http://www.aesculapusa.com/" target="_blank">Aesculap</a> </td><td> FD281R </td><td> Brauchen Sie zwei </td></tr><tr><td> Heparin, 5000 U / ml Lager </td><td> <a href="http://www.apppharma.com/" target="_blank">APP Pharmaceuticals LLC</a> </td><td> NDC 63323-047-10 </td><td> 1:100-Verdünnung in Wasser </td></tr><tr><td> KCl </td><td> <a href="http://www.fishersci.com/" target="_blank">Fischer</a> </td><td> P217 </td><td> Gesättigte Lösung in H2O </td></tr><tr><td> Ketamin (Ketaset), 100 mg / ml Stammlösung </td><td> Fort Dodge, Overland Park, KS, USA </td><td> NDC 0856-2013-01 </td><td> Gemischt als 130 mg / kg Körpergewicht, mit Xylazin in 0,9% sAline </td></tr><tr><td> Microfil </td><td> <a href="http://www.flowtech-inc.com/" target="_blank">Flow Tech</a> </td><td> MV-122 (gelb). Andere Optionen sind ebenfalls erhältlich. </td><td> Mischen 1:1 nach Gewicht, mit 10 Vol.% Härtungsmittel. Bereiten Sie unmittelbar vor der Injektion und Wirbel zu gewährleisten, ist es gut gemischt </td></tr><tr><td> Nicht sterile Nahtmaterial: 6-0, geflochtene Seide </td><td> <a href="http://www.harvardapparatus.com/" target="_blank">Harvard Apparatus</a> </td><td> 723287 </td><td></td></tr><tr><td> Papaverin </td><td> <a href="http://www.americanregent.com/" target="_blank">American Regent Inc.</a> </td><td> NDC 0517-4010-01 </td><td> 4 mg / l in PBS für Vasodilatation Buffer (mit Adenosin) </td></tr><tr><td> Paraformaldehyd </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/" target="_blank">Sigma</a> </td><td> P6148 </td><td> Vorbereitet als 4% ige Lösung </td></tr><tr><td> Vorrichtung Perfusion </td><td></td><td></td><td> Siehe Abbildung 2 </td></tr><tr><td> Frühlings-Schere </td><td> <a href="http://www.finescience.com/" target="_blank">Fine Science Tools</a> </td><td> 15018-10 </td><td></td></tr><tr><td> Xylazin (Anased), 20 mg / gl Lager </td><td> <a href="http://www.lloydlab.com/" target="_blank">Lloyd Labs</a> </td><td> NADA # 139-236 </td><td> Gemischt als 8,8 mg / kg Körpergewicht, mit Ketamin in 0,9% iger Kochsalzlösung </td></tr></tbody></table>

retrograde perfusion und abfüllung von maus koronargefäße als vorbereitung für die mikro-computertomographie imaging

Retrograde Perfusion and Filling of Mouse Coronary Vasculature as Preparation for Micro Computed Tomography Imaging

Visualisierung des Gefäßsystems wird immer wichtiger für das Verständnis von vielen verschiedenen Krankheitsstadien. Während verschiedene Techniken zum Abbilden Gefäßsystem vorhanden sind, sind einige fähig, die Blutgefäße als Ganzes zu visualisieren, während sich bis zu einer Auflösung, die den kleineren Gefäßen 1,2 umfasst. Außerdem zerstören viele Gefäßsystem Gusstechniken das umliegende Gewebe, wodurch eine weitere Analyse der Probe 5.3. Eine Methode, die diese Probleme umgeht ist Mikro-Computertomographie (μCT). μCT Bildgebung kann bei einer Auflösung &lt;10 Mikron zu scannen, ist in der Lage, 3D-Rekonstruktionen des Gefäßnetz, und verlässt das Gewebe intakt für die anschließende Analyse (zB Histologie und Morphometrie) 11.06. Allerdings erfordert Bildgebung Schiffe, die von Ex-vivo-Methoden μCT dass die Gefäße mit einem röntgendichten Verbindung gefüllt werden. Als solche ist die genaue Darstellung des Gefäßsystems durch μCT Bildgebung erzeugt abhängigzuverlässige und vollständige Füllung der Gefäße. In diesem Protokoll beschreiben wir eine Technik zum Füllen Maus Herzkranzgefäße in Vorbereitung auf μCT Bildgebung. Zwei vorherrschenden Techniken existieren zum Füllen der Koronargefäße: in vivo über Kanülierung und retrograde Perfusion der Aorta (oder eine Abzweigung des Aortenbogens) 12-14, oder ex vivo über eine Langendorff-Perfusion System 15-17. Hier beschreiben wir eine In-vivo-Methode, die Aorten-Kanülierung wurde speziell entwickelt, um sicherzustellen, Füllung aller Schiffe. Wir verwenden eine niedrige Viskosität radiopake Verbindung als Microfil die durch die kleinsten Gefäße versorgen kann, um alle Kapillaren sowie sowohl die arteriellen und venösen Seiten des vaskulären Netzes zu füllen. Schiffe werden mit Puffer mit einem unter Druck Perfusionssystem perfundiert und dann mit Microfil gefüllt. Um sicherzustellen, dass Microfil füllt die kleinen Gefäße höheren Widerstand, ligieren wir die großen Äste emanating aus der Aorta, die die Microfil lenkt in die Koronarien. Sobald die Befüllung abgeschlossen, um die elastischen Eigenschaften des Herzgewebes nicht mehr gequetscht Microfil von einigen Gefäßen zu verhindern, unterbinden wir zugänglich vaskulärer Ausgänge unmittelbar nach dem Füllen. Daher wird unsere Technik zur vollständigen Füllung und maximale Retention des Füllmittels optimiert und ermöglicht die Visualisierung des gesamten koronaren vaskulären Netzwerk - Arterien, Kapillaren und Venen gleichermaßen.

Visualisierung der Herzkranzgefäße ist entscheidend für die Erweiterung der Kenntnisse über Herz-Kreislauf-Erkrankungen. Hier beschreiben wir ein Verfahren zum Perfundieren murinen Koronargefäße mit einem röntgendichten Silikonkautschuk (Microfil), in Vorbereitung für die Mikro-Computertomographie (μCT) Bildgebung.

Retrograde Perfusion und Abfüllung von Maus Koronargefäße als Vorbereitung für die Mikro-Computertomographie Imaging

Die Visualisierung der Gefäßsysteme gewinnt für das Verständnis vieler verschiedener Krankheitszustände zunehmend an Bedeutung. Während verschiedene Techniken für ... existieren,

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die koronare Gefäßversorgung mit einer röntgendichten Färbung zu füllen, um eine Mikro-Computertomographie oder Mikro-CT-Bildgebung vorzubereiten. Zunächst wird die Bauchhöhle der Maus geöffnet und die Aorta abdominalis kaniert. Anschließend wird die Gefäßversorgung mit einem vasodilatierenden Puffer durchspült, gefolgt von einer Spülung mit AFF-Fixans. Anschließend werden die Gefäße sowohl ligiert, um den PERFUSE eight zu führen, als auch, um mögliche Leckagenstellen zu verschließen. Abschließend werden die Koronararterien mit einem röntgendichten Farbstoff gefüllt. Die vollständige Füllung der koronaren Gefäße kann durch visuelle Analyse des Herzens oder mittels Mikro-CT-Bildgebung und -Analyse beurteilt werden.Obwohl diese Methode Einblicke in die koronare Gefäßversorgung, Verzweigungsmuster sowie Gefäßverschlüsse und andere koronare Gefäßerkrankungen ermöglicht, kann sie auch auf andere vaskuläre Netzwerke in anderen Organsystemen wie Gehirn, Niere oder Hintergliedmaßen angewendet werden. Eine visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend, da die Schritte zur Gefäßligatur schwer zu erlernen sind.Wenn Sie mit der Gefäßanatomie nicht vertraut sind, kann das Auffinden und Abbinden der korrekten Gefäße im umgebenden Gewebe ebenfalls schwierig sein. Bevor Sie mit dem Verfahren beginnen, füllen Sie eine Seite einer Druckperfusionsapparatur mit vasodilatatorischem Puffer und die andere Seite mit 4 % Paraformaldehyd in PBS. Füllen Sie anschließend eine halbe CC-Insulinspritze mit einer 29-Gauge-Halbzoll-Nadel mit 0,1 Milliliter Heparin im Verhältnis 1:100.Biegen Sie die Nadel anschließend auf etwa 120 Grad unter Beibehaltung der Schräge nach oben. Füllen Sie schließlich eine Ein-Milliliter-Spritze mit einer 26-Gauge-einhalb-Zoll-Nadel mit 0,4 Millilitern gesättigter Kaliumchloridlösung und biegen Sie die Nadel danach wie zuvor gezeigt auf 120 Grad. Nachdem die Maus anästhesiert und mit der Bauchseite nach oben auf dem Präparationsbrett fixiert wurde, besprühen Sie das Tier so lange mit Ethanol, bis das Fell nass ist.Öffnen Sie dann die Bauchhöhle mit einem medianen Schnitt. Ziehen Sie die Haut zurück, um die Organe freizulegen, und schieben Sie die Därme zur Seite, damit die hintere Vena CVA oder PVC zugänglich ist. Entfernen Sie bei Bedarf Fett- oder Bindegewebe und injizieren Sie die vorbereitete Heparinlösung in die PVC.Während Sie die Nadel herausziehen, bedecken Sie das Nadelloch mit einem Wattestäbchen, um ein Auslaufen zu verhindern, und halten Sie das Wattestäbchen einige Sekunden lang an Ort und Stelle, bis die PVC-Wand gerinnt und sich verschließt. Nachdem Sie zwei bis drei Minuten gewartet haben, damit sich das Heparin im gesamten Mauskreislauf verteilen kann, dissezieren Sie das Zwerchfell und den Rippenkorb, sodass das schlagende Herz sichtbar wird.Danach langsam die vorbereitete Kaliumchloridlösung in die Vena cava inferior injizieren, bis das Herz stillsteht. Anschließend die Vena cava inferior in der Nähe der Zwerchfellhöhe durchtrennen, sodass der dem Herzen nahegelegene Abschnitt in den folgenden Schritten leicht zu finden ist. Dann alle Organe unterhalb des Zwerchfells entfernen und den hinteren Teil der Maus exzidieren.Suchen Sie nun das Schnittende der Aorta und legen Sie ein langes Stück sechsfach-null geflochtenen Seidensutures, das zur Hälfte umgelegt ist, einige Millimeter vor dem Schnittende unter die Aorta. Schneiden Sie dieses lange Suturestück durch, sodass zwei Hälften unter der Aorta liegen. Führen Sie abschließend den Katheter in das Schnittende der Aorta ein und binden Sie jedes Sutureende mit einem Doppelknoten fest, um den Katheter zu sichern und ein Austreten von Rückdruck aus der Aorta zu verhindern.Verbinden Sie zunächst die Druckperfusionsapparatur mit dem Katheter. Pumpen Sie die Perfusionsapparatur dann auf einen Treibdruck von 100 bis 110 Millimeter Quecksilbersäule, um die Gefäße mit Pufferlösung unter Zusatz eines Vasodilatators zu perfundieren. Stellen Sie sicher, dass der Puffer durch die Koronararterien fließt, indem Sie überprüfen, ob Flüssigkeit aus dem PVC austritt, während Sie warten, bis die Flüssigkeit klar wird.Lösen Sie die Rippen und klappen Sie den Rippenkasten zurück, um das Herz freizulegen. Sobald es freigelegt ist, geben Sie Tropfen des Puffers auf das Herz, indem Sie einen mit Puffer getränkten Gazetupfer auspressen, um ein Austrocknen zu verhindern. Entfernen Sie den Thymus. Um den Aortenbogen freizulegen, ist die Ligatur der Gefäße der mit Abstand schwierigste Aspekt dieses Eingriffs. Für Anfänger kann es sehr frustrierend sein, die am Aortenbogen ansetzenden Gefäße zu lokalisieren, doch sobald die Anatomie der Gefäße verstanden ist, lernt man, darauf zu vertrauen, dass sie vorhanden sind, auch wenn sie aufgrund von Fettgewebe und anderem Bindegewebe nicht deutlich sichtbar sind. Das Setzen der Nähte erfordert Geduld und einen ruhigen Handsinn, doch es ist eine Fertigkeit, die mit der Übung leichter wird.Danach unter Verwendung einer sechseinhalb Zoll langen, geflochtenen Seidennahtligatur die drei großen Aortenäste verschließen, um sicherzustellen, dass die Flüssigkeit über die Koronararterien und nicht über diese größeren, widerstandsarmen Gefäße umgeleitet wird. Anschließend das Herz 15 Minuten lang mit Fixansatz perfundieren. Danach mindestens zwei Minuten lang mit Vasodilatationspuffer spülen.Unterdessen, um zu verhindern, dass das Mikrofüllmaterial nach der Injektion aus dem Herzen austritt, ligieren Sie die erste vordere Vena cava und anschließend die zweite vordere Vena cava. Legen Sie Fäden um den PVC und die Aorta, ziehen Sie diese aber erst nach dem Befüllen fest. Nachdem das Mikrofüllmaterial vorbereitet und in eine Ein-Milliliter-Spritze aufgezogen wurde, füllen Sie das Präparationsfeld mit F-Wasser, sodass der Katheter bedeckt ist.Trennen Sie nun die Perfusionsapparatur vom Katheter und verbinden Sie die Microfill-Spritze. Injizieren Sie das Microfill in die Aorta. Zunächst werden die Arterien gefüllt, anschließend tritt das Microfill in die Kapillaren über, wodurch das Gewebe die Farbe des Microfills annimmt.Beachten Sie, wie die hydrophobe Natur des Microfill-Mediums bewirkt, dass es anfangs als voneinander getrennte Kugeln erscheint, während es aus den kleineren Gefäßen austritt. Eine vollständige Füllung ist erkennbar, wenn das Microfill-Medium innerhalb der Gefäße durchgehend ist und durch das PVC austritt. Sobald die Füllung abgeschlossen ist, ziehen Sie die Nähte um das PVC und die Aorta schnell fest, um zu verhindern, dass die elastische Beschaffenheit des Herzmuskels das Microfill-Medium aus den Gefäßen herauspresst.Vermeiden Sie während des Polymerisationsprozesses äußeren Druck auf das Herz, beispielsweise indem Sie das Herz anheben oder drehen, um frühzeitig einen Blick auf die gefüllten Gefäße an der Rückseite des Herzens zu erhalten. Danach befeuchten Sie etwas Mullbinde mit Wasser aus der Präparierschale und bedecken das Herz mit der Binde, um Austrocknung zu verhindern. Lassen Sie das Herz etwa eine Stunde bei Raumtemperatur ruhen, bis sich das Microfill polymerisiert hat.Entfernen Sie abschließend das Herz und fixieren Sie es über Nacht bei vier Grad Celsius in 4 % PFA. Anschließend überführen Sie das Herz in 70 % Ethanol und lagern es bei vier Grad Celsius. Gefäße, die effektiv durch Microfill perfundiert wurden, weisen eine durchgehende, ununterbrochene Füllung mit Microfill entlang der gesamten Gefäße auf.Wie in dieser ersten Abbildung gezeigt, kann das Ausmaß der Füllung der Herzkranzgefäße visuell beurteilt werden. Die Venen liegen epikardial und sind leicht zu erkennen, wie durch den Pfeil angezeigt. Die stärker intramyo­kardial verlaufenden Arterien sind ebenfalls durch die Oberfläche des Herzens sichtbar und hier durch den Pfeil gekennzeichnet.Die kapillare Füllung ist ebenfalls erkennbar. Beobachten Sie in dieser Abbildung einen kapillardichten Bereich des Herzens, wie mit dem Stern gekennzeichnet. Gelegentlich können Verstopfungen die Füllung eines Teils des Gefäßbetts verhindern.Daher sind alle vaskulären Netzwerke, die nicht gefüllt werden, aufgrund des fehlenden Mikrofüllstoffs auffällig, wie hier mit einem Pfeil angezeigt. Weitere Unterbrechungen des Mikrofüllstoffs können auftreten, Beispiele dafür sind mit einem Sternchen gekennzeichnet. Eine unvollständige Füllung kann auch auftreten, wenn während der Applikation des Mikrofüllstoffs zu geringer Druck verwendet wird, da der Mikrofüllstoff dann nicht in alle kapillaren Netzwerke eingepresst wird.Beachten Sie, wie das Gewebe die gelbe Farbe des Mikrofüllstoffs nicht angenommen hat, was darauf hinweist, dass der Mikrofüllstoff nicht in die Kapillaren eingedrungen ist. Umgekehrt kann ein zu hoher Druck dazu führen, dass die Kapillaren platzen und Mikrofüllstoff in das umgebende Gewebe austritt, wie durch den Pfeil hervorgehoben. Bei Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, den Mikrofüllstoff nicht zu schnell oder mit zu hohem Druck zu injizieren, da die Gefäße sonst platzen und der vaskuläre Abdruck zerstört wird.Dem Verfahren beim Mikro-CT-Scannen folgend. Andere Methoden wie die immunhistochemische Analyse können durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten und die Gefäße sowie das umgebende Gewebe besser zu charakterisieren.

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Research

Forschung

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Medizin

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Retrograde Perfusion und Abfüllung von Maus Koronargefäße als Vorbereitung für die Mikro-Computertomographie Imaging

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