Name: Anpassung von Aspergillus niger Morphologie durch Zugabe von Talkum Mikropartikel (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 51 s
Description: Erfahren Sie eine Methode zur Morphologieanpassung von Aspergillus niger durch Talkum-Mikropartikel in Bioreaktoren. Diese Technik ermöglicht die Korrelation zwischen Pilzmorphologie und Produktivität für biotechnologische Anwendungen.

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Die Autoren danken für die finanzielle Unterstützung durch die Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) durch den Sonderforschungsbereich SFB 578 &quot;Vom Gen zum Produkt&quot; an der Technischen Universität Braunschweig, Deutschland zur Verfügung gestellt.

1. Reactor-Setup und Beginn der Kultivierung 4 Bioreaktor-Kultivierungen insgesamt durchgeführt werden. <ol><li> Verwenden Sie ein 3 L Rührkessel-Bioreaktor mit einem Arbeitsvolumen von 2,2 L für die Kultivierung von A. niger SKAn1015. </li><li> Gießen 72,6 g Glucose-Monohydrat in den Reaktor und füllen Sie ihn mit 1,9 l entionisiertem Wasser. </li><li> Installieren des Reaktors Geräte wie 3 Schikanen, zwei Sechs-beschaufelten Scheibe Turbinenrades, eine pH-Elektrode, einen Gaseinlaß mit Luftfilter, ein Kühlfinger, einem Abgas-Luft-Kühler mit Luftfilter, ein Tauchrohr zur sterilen Probenahme mit Luftfilter und Zulaufschläuche für mittlere, Inokulum, Säure und Base. </li><li> Autoklav den Reaktor bei 121 ° C für 20 min. </li><li> Verbinden Sie den Reaktor mit dem Säure-Basen-Reservoir (2 M HCl, 2 M NaOH) und den entsprechenden Pumpen und die Einrichtung eines pH-Wert von 5,0 ± 0,05 pH-Wert mit dem Steuergerät. </li><li> Verknüpfen Sie den Reaktor mit dem Kühlwasser-System und setzen Sie den Heizmantelin den Reaktor. </li><li> Installieren Sie den Temperaturfühler mit entsprechender Steuerung und Einrichtung einer Temperatur von 37 ± 0,1 ° C bei der Temperatur Steuereinheit. </li><li> Montieren Sie den Motor Agitation der Spitze des Reaktors und bringen sie in Betrieb mit einer Rührgeschwindigkeit von 200 min -1. </li><li> In dem sterilen ein minimales Wachstum Medium 11 Trog einem der sterilen Zulaufschläuche (250 ml). Für mittlere Vorbereitung alle Komponenten wurden bei 121 ° C für 20 min autoklaviert und miteinander vermischt. Drei Kulturen die Komponenten umfassen Talkum (3MgO • 4SiO 2 • H 2 O) in den Konzentrationen von 1 g / l (Reaktor 2), 3 g / l (Reaktor 3) und 10 g / l (Reaktor 4). Vor der Verwendung erneut zu suspendieren die Mikropartikel in 50 mM Natriumacetat-Puffer (pH 6,5) und fügen sie in den sterilen Medium. In Kontrollkulturen (ohne Partikel) ersetzen Sie den Mikro-Suspension mit 50 mM Natriumacetat-Puffer (pH 6,5). </li><li> Fügen Sie die Sporensuspension (Inokulum) eines vorbereitet in Wucherpfennig et. al (2011) 11 Trog einem der sterilen Zulaufschläuche (50 ml), so dass die Konzentration von Sporen beträgt 1x10 6 ml -1. Die Impfung stellt den Beginn des Anbaus (h = 0 h). </li><li> Starten Sie die Belüftung mit einer Rate von 1,0 L min -1. </li></ol> 2. Sterile Probenahme nach 24, 48 und 72 h Kultivierung <ol><li> Nehmen 50 ml sterilem Kulturbrühe in einem Flakon Rohr. </li><li> Verwenden Probe zur Bestimmung der Biomasse Trockengewicht, β-Fructofuranosidase Aktivität und mikroskopische Analyse. </li></ol> 3. Bestimmung des Biomasse-Trockengewicht nach 24, 48 und 72 h Kultivierung <ol><li> Biomasse Proben zu mindestens doppelt gemacht werden. </li><li> Gewicht ein Cellulose-Filter mit einem Mikro-Skalen nach dem Trocknen im Exsikkator und platzieren Sie den Filter in einem Büchner-Trichter mit angeschlossenem Wasserstrahl-Vakuumpumpe. </li><li> Filtern sie ein definiertes Probenvolumen (zB 10 ml) einenND spülen Sie den Filter mit 10 ml destilliertem Wasser auf Medium Verbindungen aus der Biomasse zu entfernen. </li><li> Falten der Filter einmal in der Mitte, legen Sie sie in einem Glas-Petrischale und steckte es in ein Fach Trockner bis zur Gewichtskonstanz (mindestens 24 h). </li><li> Kühlen Sie den Filter in einem Exsikkator und Bestimmung des Gewichts. </li><li> Berechnen Sie die Biomasse Trockengewicht als die Differenz zwischen dem Gewicht des Filters mit und ohne getrocknete Biomasse von der verwendeten Probe dividiert. </li></ol> 4. Die Bestimmung der enzymatischen Aktivität der extrazellulären β-Fructofuranosidase von GOD / POD-Essay nach 24, 48 und 72 h Kultivierung Lagern Sie die Proben auf Eis ständig während der Arbeit mit ihnen. <ol><li> Filter 1,5 ml Kultur Suspensionstrog ein Celluloseacetat-Filter durch Drücken der Kultursuspension mit einer Spritze durch den Filter in ein Reaktionsrohr. Bewahren Sie das Reaktionsrohr bei -20 ° C bis zur Verwendung. </li><li> Für die Reaktionsmischung verwenden 20ul-Probe und mit 200 ul von 1,65 M Saccharose in 0,05 M Phosphatpuffer (pH 5,4) aufgelöst, um die Reaktion von Saccharose zu Glucose zu initiieren. Cary aus der Reaktion mindestens in zweifacher Ausführung. </li><li> Inkubieren der Reaktionsmischung bei 40 ° C für 20 min in einem Heizblock. Stoppen der Reaktion durch Inkubation bei 95 ° C für 10 min in einem Heizblock. Das Reaktionsgemisch wird durch Lagerung auf Eis und Spin-down das kondensierte Wasser durch Zentrifugieren bei 13.000 g für 10 min bei 4 ° C </li><li> Um den pH-Wert und Temperatur abhängige Spaltung von Saccharose zu Glukose ausmachen, führen Sie eine leere Wert mit 20 ul entionisiertem Wasser anstelle von 20 ul Probe. </li><li> Um restliche Glucose in der Kulturbrühe zu berücksichtigen, Durchführung einer negativen Kontrolle für jede Probe. Zu diesem Zweck Verwendung von 20 ul der Probe zu inaktivieren und β-Fructofuranosidase durch Erhitzen bei 95 ° C für 10 min vor der Saccharose hinzugefügt und die Platte wie in Schritt 4.3 beschrieben. </li><li> Verdünnen der Proben, so dass die folgenden Maßnahmenured Adsorption ist in der kalibrierten Wertebereich. </li><li> Führen Sie alle enzymatischen Assays in dreifacher Ausfertigung. Bewerben 2 ul verdünnte Probe in eine Mikrotiterplatte gut. Tragen Sie einen Standard für die Kalibrierung auf der Mikrotiterplatte durch jede Verwendung von 2 ul von zehn Glukose-Lösungen mit zehn unterschiedlichen Know-Konzentrationen (ab 1 mm bis 15 mm) anstelle von 2 ul Probe. Für Null-Punkt-Kalibrierung verwenden 2 ul entionisiertem Wasser anstelle von 2 ul Probe. </li><li> Fügen Sie 200 ul der Reagenzlösung in jede Vertiefung mit Hilfe einer Multi-Pipette. </li><li> Inkubieren des Gemisches für 10 min bei Raumtemperatur. </li><li> Bewahren Sie die Mikrotiterplatte bei 6 ° C bis zur Messung (ein paar Stunden bei den meisten). </li><li> Messen Sie die Absorption bei 450 nm mit einer 96-well Mikrotiterplatten-Photometer Sonnenaufgang und die Magellan Datenwiederherstellung Software. Stellen Sie die Mischzeit bis zu 5 sek. und der Ruhezeit bis zu 1 sek. </li><li> Öffnen Sie das Ergebnis Tabelle mit einem Tabellenkalkulationsprogramm und erstellen Sie eine Eichgerade mit dem Standard-Sortiment: glucose Konzentration X = a + b-Absorption </li><li> Berechnen Sie die Aktivität: Aktivität = (Absorption x Verdünnungsfaktor-Blindwert) X a + b </li><li> Finde heraus, die β-Fructofuranosidase Aktivität durch Berechnung der Differenz zwischen den Aktivitäten der Probe und der entsprechenden negativen Kontrolle. </li><li> Berechnen Sie die spezifische Produktivität für folgende Verwendung unter Berücksichtigung Biomasse Trockengewicht und β-Fructofuranosidase Tätigkeit 11. </li></ol> 5. Mikroskopie und automatisierte Bildanalyse nach 72 h Kultivierung <ol><li> Platz in 3 ml-Suspension in einer Kunststoff-Petrischale undverdünnen mit physiologischer Kochsalzlösung, bis die morphologischen Strukturen getrennt sind. </li><li> Situieren die Petrischale unter dem Mikroskop, das eine integrierte oder angeschlossene Kamera verfügt. Erfassen und Speichern des etwa 100 Bilder (Abbildung 2) von morphologischen Strukturen pro Probe. Beachten Sie, dass für jedes Bild wenigstens ein Objekt vollständig abgebildet. </li><li> Öffnen Sie alle Bilder von der gleichen Probe mit dem Bildverarbeitungsprogramm ImageJ 12. Konvertieren Sie die Bilder auf schwarz und weiß mit der Prozess-Tool &quot;Make Binary&quot; (Abbildung 2). Für die Anwendung des Befehls an die ganze Reihe von Bildern mit einem Makro-Code wie folgt. laufen (,, Machen Sie Binary &quot;) </li><li> Öffnen Sie die bearbeiteten Bilder mit binären ImageJ wieder. Berechnen Sie die Formfaktoren Feret-Durchmesser, projizierte Fläche, Umfang, Rundheit, Seitenverhältnis, Rundheit und Solidität für jedes Bild mit dem Analysetool &quot;Set Measurement&quot;. Zum Aufbringen der Befehl zu einer ernstES von Bildern mit einem Makro-Code wie folgt. laufen (&quot;8-Bit&quot;); ausgeführt werden (&quot;Make Binary&quot;); laufen (&quot;Set Scale ...&quot;, &quot;Abstand = X bekannt = 1000 Pixel = 1 VE = um globale&quot;); laufen (&quot;Set Maße ...&quot;, &quot;Bereich Umfangsform Feret-Limit-Anzeige redirect = None dezimal = 3&quot;); laufen (&quot;Analyze Particles ...&quot;, &quot;size = 10000-Infinity Zirkularität = 0,00-1,00 show = Outlines Display&quot;); Bestimmen X die Anzahl der Pixel, die 1000 um korreliert, indem er eine gerade Linie in einem Maßstab. Korrelieren der Anzahl von Pixeln aus der geraden Linie mit der Länge der Balken in um. </li><li> Öffnen Sie das Ergebnis Diagramm mit Formfaktor Werte für jedes Bild mit einem Tabellenkalkulationsprogramm. Berechnen Sie eine Morphologie-Nummer wie folgt für jedes Bild. <img alt="Gleichung 1" src="/files/ftp_upload/4023/4023eq1.jpg" /></li><li> Berechnen Sie Mittelwert und Standardabweichung für die Morphologie Zahl unter Berücksichtigung aller Bilder einer Probe. </li&gt; <li> Verwenden Sie eine Graphik-und Datenanalyse-Programm für graphische Korrelation der Morphologie, die dem spezifischen Produktivität und bestimmen Sie die mathematische Beziehung durch mathematische Regression. </li></ol> 6. Repräsentative Ergebnisse Durch Zugabe von Talkum Mikropartikel A. niger SKAN 1015 Morphologie wird von einem echten Pelletmorphologie zu einem verteilten oder sogar Myzel Morphologie verändert. Während Pelletmorphologie unter Standardbedingungen zeigte ein Myzel Morphologie durch Ergänzung Medium mit 10 g / l Talkum Mikropartikel (4.) Erstellt. Gleichzeitig die Aktivität von β-Fructofuranosidase erhöht um 3-fach 3-5. Eine Ergänzung von 1 oder 3 g / l Talkpulver führt zu einer dispergierten Morphologie mit einer doppelten Fructofuranosidase Aktivität (4.). Die Mikro-Partikel abhängig Morphologie in umfassender Weise durch die Mor beschrieben werdenMorphologie Zahl, die anhand von Parametern automatische Bildanalyse bestimmt werden kann. Perfekt abgerundete und glatte Pellets werden in mikroskopischen Bildern erscheinen als perfekte Kreise. Für solche Teilchen die Morphologie hat einen Wert von 1. Die kleinste Fragment von Mycel Morphologie als eindimensionale Linie was eine Morphologie Zahl von 0 vereinfacht werden. Alle Zwischen-morphologische Formen wie längliche unregelmäßige Pellets oder Klumpen müssen daher Werte zwischen 0 und 1. Ziemlich große Partikel werden in einem hohen, Pilz-Partikel mit einer großen Oberfläche oder längliche Partikel, in einem eher niedrigen Morphologie der Nummer 11 zur Folge haben. Unter Standardbedingungen die Morphologie in Reaktor 1 weist eine Morphologie Zahl rund 0,8. Die Morphologie im Reaktor 4 mit 10 g / L Talkpulver ist mit einem Mn etwa 0,1. Die Morphologie Anzahl von Reaktoren 2 und 3, mit Talkum Puder Konzentrationen von 1 und 3 g / l, zwischen diesen Extremen liegt, zeigt eine dispergierte morphologie. Da Mikro-Partikel-Morphologie abhängig ist eng mit dem β-Fructofuranosidase Produktivität bezogen, wird eine mathematische Korrelation von Morphologie und Produktivität Zahl ähnlich wie Abbildung 5 erhalten. <img alt="1" src="/files/ftp_upload/4023/4023fig1.jpg" /> Abbildung 1. Allgemeine Systematik des experimentellen Designs und des analytischen Verfahrens. A. niger kultiviert wird (mit oder ohne Mikro-Teilchen) in einem 3 L Rührkessel-Bioreaktor für 72 h. Nach 24, 48 und 72 ha Probe zur Bestimmung der Biomasse Trockengewicht und β-Fructofuranosidase Aktivität, was wiederum zur Berechnung der spezifischen Produktivität verwendet getroffen werden. Nach 48 h wird die Pilz-Morphologie wird durch mikroskopisch untersucht und gekennzeichnet durch digitale Bildanalyse. Relevante Parameter der Bildanalyse auf eine Morphologie-Nummer, die mathematische Beziehung mit der spezifischen Produktivität kombiniert. <imgalt = &quot;Bild 2&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/4023/4023fig2.jpg&quot; /&gt; Abbildung 2. Schritte der Bildverarbeitung für die mikroskopische-generierte Bilder von morphologischen Strukturen von A. Niger. Schritt 1: Bildaufnahme mit dem Mikroskop. Schritt 2: Imageverbesserung, wenn nötig. Schritt 3: Bild Binarisierung, schwarz-weiß (binär) Bild in ImageJ erzeugt. Schritt 4: das binäre Bild wird durch verarbeitet und unerwünschte Objekt gelöscht werden. Schritt 5: morphologische Analyse wird mit der &quot;Analyze Partikel&quot;-Funktion der Open-Source-Programm ImageJ durchgeführt. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/4023/4023fig3.jpg" /> Abbildung 3. Verschiedene morphologische Formen von A. niger abhängig von der Konzentration des zugesetzten Mikropartikel. Mit zunehmender Konzentration von Mikro-Partikeln gegeben das Pellet Größe exakt verringert werden kann bis hin zu kleinen Kern-Schale-Pellets, kleine Herden und sogar frei verteilt Myzel. Morphologie Engineering Alspergillus niger SKAn1015 durch Mikro-Partikel-Supplementation in Submerskultur. Ohne Mikropartikel (A), 10 mg / L (B), 0,1 g / L (C), 0,2 g / L (D), 0,3 g / L (E), 0,6 g / L (F), 1,0 g / l (G), 1,5 g / L (H), 2,0 g / L (I), 2,5 g / l (J), 3,0 g / L (K), 3,5 g / L (L), 4,0 g / l (M ), 4,5 g / L (N), 5,0 g / L (A), 10 g / L (P), 15 g / L (Q), 20 g / L (R), 30 g / L (S) und 40-50 g / L (T). Die Bilder wurden mittels Lichtmikroskopie nach 72 h der Landwirtschaft entzogen. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/4023/4023fig4.jpg" /> 4. Fructofuranosidase Aktivität in Abhängigkeit von Talk Mikropartikel Konzentration von 1 g / l (Reaktor 2), 3 g / l (Reaktor 3) und 10 g / l (Reaktor 4). Reaktor 1 ist nicht mit Mikro-Partikel ergänzt, hier der Anbau wird unter Standard-Bedingungen durchgeführt. <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/4023/4023fig5.jpg" /> Abbildung 5. Vertreter gute Korrelation (R 2 = 0,91) der MorphologieAnzahl und die spezifische Produktivität. Die Morphologie Zahl aufgetragen (Abszisse) gegen die spezifische Produktivität (Ordinate). Nichtlineare Regression ergibt den exponentiellen Korrelation.

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</ol>

Ich habe nichts zu offenbaren.

Die Modifizierung von Pilz-Morphologie hat Interesse an der Biotechnologie seit vielen Jahrzehnten. Verschiedene Studien haben versucht, ausgewählte Prozessparameter wie pH-Wert, Leistungsaufnahme, Temperatur, Medium Nährstoffe oder Inokulumkonzentration 1 variieren, leiden aber unter eher ungenau, unvollständig und Kontrolle der Morphologie, hohe Energiekosten, Hemmeffekte Produkt oder Instabilität, Im Gegensatz dazu Die Ergänzung von Mikropartikeln erlaubt eine präzise Konstruktion von Pilz Morphologie durch Feinabstimmung Variation der Teilchengröße und Konzentration. Dies eröffnet neue Möglichkeiten, um Mikro-Partikel zur Optimierung und zur maßgeschneiderten Entwicklung von Hochgeschwindigkeits produzierenden Morphologie verwenden in der biotechnologischen Produktion mit A. niger und andere filamentöse Mikroorganismen. Die digitale Bildanalyse ist ein leicht reproduzierbares Verfahren zur Pilz-Makro-Morphologie zu charakterisieren. Allerdings ist die Vielzahl von Parametern für die Größe, Form und Oberflächeneigenschaftenter von morphologischen Strukturen in der Literatur beschrieben ermöglicht eine schnelle Beurteilung der Pilz-Morphologie kompliziert. Das vorgestellte Morphologie Zahl als eine Kombination von relevanten Parametern, vermeidet diesen Nachteil und kann nicht nur für die umfassende Charakterisierung von morphologischen Strukturen, sondern auch für die direkte mathematische Korrelation mit der Produktivität genutzt werden. Dies wiederum macht eine Schätzung der Produktivität durch die Morphologie gegeben und damit eine Anpassung der Morphologie für Prozess muss möglich. Mit der Morphologie Zahl, ist es möglich, zwischen verschiedenen Pellets und verklumpen Morphologien 4,5 unterscheiden. Für die weitere Entwicklung der Morphologie Zahl der Betrachtung der fraktalen Dimension scheint vielversprechend zu sein. Eine fraktale Dimension ergibt eine Messung der Komplexität und der Masse füllen Eigenschaften eines Objekts 13 und ist daher für eine ganzheitliche Charakterisierung von Mycel-Morphologie prädestiniert. Die creation eines hohen produzierenden Mycel-Morphologie, könnte jedoch zu Problemen mit Prozess-Performance vor allem in großflächigen Anbau führen, weil das Myzelwachstum Formular wurde zuvor gezeigt wurde, weisen viel größere Kulturbrühe Viskositäten 2. Dies führt zu Problemen mit Wärme-und Stofftransport und die Bildung von gemischten Zonen nicht stagniert, die eine höhere Leistungsaufnahme und machen den Anbau teurer zu 1 voraussetzen. Deshalb Beziehung zwischen Pilz Morphologie und Kulturbrühe Viskosität sollte berücksichtigt werden, wenn die Änderung der Morphologie und in weiteren Modellen eingebaut werden können.

anpassung von aspergillus niger morphologie durch zugabe von talkum mikropartikel

Customization of Aspergillus niger Morphology Through Addition of Talc Micro Particles

Der filamentöse Pilz A. niger ist ein weit verbreitetes Stamm in einem breiten Bereich industrieller Prozesse aus der Nahrung der pharmazeutischen Industrie. Eines der faszinierendsten und oft unkontrollierbaren Merkmale dieser filamentösen Organismus ist seine komplexe Morphologie. Es reicht von dichten kugelförmigen Pellets zu zähflüssig Myzelien (Abbildung 1). Verschiedene Prozessparameter und Zutaten sind dafür bekannt, Pilz-Morphologie 1 zu beeinflussen. Da eine optimale Produktivität korreliert stark mit einer bestimmten morphologischen Form, die Pilz-Morphologie stellt oft den Engpass bei der Produktivität in der industriellen Produktion. Ein geradlinig und elegante Methode zur präzisen Steuerung morphologische Form ist der Zusatz von anorganischen unlöslichen Mikropartikel (wie wasserhaltiges Magnesiumsilikat, Aluminiumoxid oder Titan-Silikat-Oxid) zu dem Kulturmedium Beitrag zur höheren Enzymproduktion 2-6. Da es eine obvdene Korrelation zwischen Mikro-Partikel abhängig Morphologie und Enzymproduktion ist es wünschenswert, mathematisch zu verknüpfen Produktivität und morphologische Erscheinungsbild. Daher ist eine genaue quantitative und ganzheitliche morphologische Beschreibung wird angestrebt. So stellen wir eine Methode zur Erzeugung und Charakterisierung von Mikro-Partikel abhängig morphologischen Strukturen und zur Pilz-Morphologie mit der Produktivität (Abbildung 1), die möglicherweise trägt zu einem besseren Verständnis der Morphogenese von fadenförmigen Mikroorganismen zu korrelieren. Der rekombinante Stamm A. niger SKAn1015 wird 72 h in einem 3 l Rührkessel Bioreaktor. Durch Zugabe von Talk Mikropartikel in einer Konzentration von 1 g / l, 3 g / l und 10 g / l vor der Inokulation eine Vielzahl von morphologischen Strukturen reproduzierbar erzeugt. Sterile Proben werden nach 24, 48 und 72 Stunden zur Bestimmung der Wachstumsprozess und die Aktivität des hergestellten Enzyms gemacht. Diegebildete Produkt ist der hochwertige Enzym β-Fructofuranosidase, ein wichtiger Biokatalysator für neo-Zucker-Bildung in Lebensmitteln oder pharmazeutischen Industrie, die unter anderem katalysiert die Reaktion von Saccharose zu Glucose 7-9. Daher bedeutet die Quantifizierung von Glucose nach Zugabe von Saccharose die Menge des produzierten β-Fructofuranosidase. Glukose wird durch eine Quantifizierung GOD / POD-Assay-10, die für High-Throughput-Analyse in 96-well Mikrotiterplatten modifiziert wird. Pilz-Morphologie nach 72 Stunden wird durch mikroskopisch untersucht und gekennzeichnet durch digitale Bildanalyse. Dabei werden Partikelform Faktoren für Pilz-Makro-Morphologie wie Feret-Durchmesser, projizierte Fläche, Umfang, Rundheit, Seitenverhältnis, Rundheit und Solidität mit dem Open-Source-Bildbearbeitungsprogramm ImageJ berechnet. Relevante Parameter werden auf einer dimensionslosen Zahl Morphologie (Mn) 11, die eine umfassende Charakterisierung ermöglicht kombiniertPilz Morphologie. Die enge Korrelation der Morphologie Anzahl und Produktivität werden durch mathematische Regression hervorgehoben.

Verfahren genau zu erzeugen und umfassend charakterisieren Morphologie Fadenpilz<em&gt; Aspergillus niger</em&gt; Wird beschrieben, mit dessen Hilfe mathematische Korrelation von morphologischen Aussehen und Produktivität.

Anpassung von Aspergillus niger Morphologie durch Zugabe von Talkum Mikropartikel

Der filamentöse Pilz A. niger ist ein weit verbreiteter Stamm in einer Vielzahl industrieller Prozesse, von der Lebensmittel- bis zur pharmazeutischen Industrie. Einer der am meisten ...

Diese Methode erzeugt und charakterisiert mikropartikelabhängige morphologische Strukturen des fadenförmigen Pilzes Aspergillus niger, um die Pilzmorphologie mit der Produktivität zu korrelieren. Kultivieren Sie acht Aspergillus niger-Stämme mit oder ohne Mikropartikel in einem dreiliter Rührkessel-Bioreaktor über einen Zeitraum von 72 Stunden, um die spezifische Produktivität zu berechnen. Entnehmen Sie Proben zu definierten Zeitpunkten und bestimmen Sie die Biomasse, die Trockenmasse sowie die Veto-Fructo-Sase-Aktivität.Nach 72 Stunden untersuchen Sie die Pilzmorphologie mittels Mikroskopie und charakterisieren Sie diese durch digitale Bildanalyse. Kombinieren Sie anschließend relevante Parameter der Bildanalyse zu einer Morphologiekennzahl, die mathematisch mit der spezifischen Produktivität korreliert ist. Letztendlich ermöglicht diese Methode die präzise Erzeugung und umfassende Charakterisierung der Morphologie von Aspergillus niger, um das Verständnis der Morphogenese fadenförmiger Mikroorganismen zu verbessern.Aspergillus niger ist seit mehreren Jahrzehnten ein wichtiges industrielles Arbeitstier in der Biotechnologie. Eine der faszinierendsten und oft schwer beherrschbaren Eigenschaften von Aspergillus, niger und verwandten Arten ist ihre komplexe Morphologie, die je nach Kulturbedingungen von dichten sphärischen Pellets bis hin zu viskosen Mycelien reicht. Der Hauptvorteil unseres Verfahrens liegt darin, dass wir durch die Zugabe von Mikropartikeln nun in der Lage sind, die Pilzmorphologie gezielt an die jeweiligen Prozessanforderungen anzupassen.Bisher wurde keine andere Methode für eine derartige Anpassung der Pilzmorphologie beschrieben. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen zur Kultivierung filamentöser Mikroorganismen zu beantworten. Denn für die industrielle Anwendung ist es entscheidend, die Pilzmorphologie zu kontrollieren und zudem zwischen einer gut und einer schlecht produzierenden Pilzmorphologie unterscheiden zu können.Unser Protokoll bietet die Möglichkeit einer gezielten Anpassung und Charakterisierung der Pilzmorphologie. Obwohl diese Methode Einblicke in die Morphologie von Aspergillus niger ermöglicht, kann sie ebenso auf andere fadenförmige Mikroorganismen wie Penicillium- oder Strepto-Stämme angewendet werden. Richten Sie vier Bioreaktoren für sterile Kulturen gemäß des begleitenden Protokolls ein.Text basierend auf der Zugabe von Mikropartikeln, kultivieren Sie Aspergillus niger mit unterschiedlicher Morphologie. Überführen Sie nach 72 Stunden 50 Milliliter Kulturbrühe in ein Falcon-Röhrchen.Biomasseproben sind nach dem Trocknen im Exsikkator mindestens im Duplikat zu entnehmen; wiegen Sie einen Zellulosefilter mit der Mikrowaage. Setzen Sie den Filter in ein Büchner-Trichter ein, verbinden Sie ihn mit einer Wasserstrahlpumpe und filtrieren Sie 10 Milliliter Probe, gefolgt von 10 Milliliter entionisiertem Wasser, um Mediumsbestandteile von der Biomasse zu entfernen; falten Sie den Filter danach einmal in der Mitte. Legen Sie es in eine Glas-Petri-Schale und in einen Trockenschrank, bis Gewichtskonstanz erreicht ist. Überführen Sie den Filter in einen Exsikkator und lassen Sie ihn abkühlen. Anschließend bestimmen Sie das Gewicht.Berechnen Sie das Trockengewicht der Biomasse pro Liter durch Ermittlung des Gewichtsunterschieds der Filter und anschließende Division durch das Probenvolumen für die Glucose-Oxidase- und Peroxidase-Enzymassays. Lagern Sie die Proben auf Eis unter Verwendung einer Spritzenpassage, 1,5 Milliliter. Kultur-Suspension durch einen Celluloseacetat-Filter in ein Reaktionsröhrchen leiten, um den Beta-Fructo-SASE-Assay durchzuführen.Sorgfältig stellen wir die statistische Robustheit mit zwei Proben im Triplikat sicher. Um den Assay zu starten, geben Sie 20 Mikroliter Probe in das Reagenzglas. Als Kontrolle für die pH- und temperaturabhängige Spaltung von Saccharose zu Glukose verwenden Sie 20 Mikroliter deionisiertes Wasser anstelle von 20 Mikroliter Probe. Bereiten Sie außerdem für jede Probe eine negative Kontrolle für verbleibendes Glukose im Kulturmedium durch den Assay vor.20 Mikroliter hitzeinaktivierte Probe. Um die Umsetzung von Saccharose zu Glukose einzuleiten, 200 Mikroliter einer 1,65-molaren Saccharoselösung hinzufügen. Bei pH 5,4 die 20 Mikroliter Probe ansatzweise in einem Heizblock bei 40 Grad Celsius 20 Minuten lang inkubieren. Die Reaktion durch 10-minütiges Erhitzen auf 95 Grad Celsius nach Abkühlen der Röhrchen auf Eis beenden.Zentrifugieren Sie die Proben nach Bedarf und verdünnen Sie die Proben für den Assay so, dass die gemessene Absorption im kalibrierten Wertebereich liegt. Geben Sie nun für jede Reaktion zwei Mikroliter Probe in eine Mikrotiterplatte. Führen Sie die Probemessungen im Triplikat durch.Bereiten Sie außerdem eine Standardkurve für 10 Glucoselösungen im Bereich von einem Millimolar bis 15 Millimolar vor. Verwenden Sie für die Kalibrierung des Nullpunkts zwei Mikroliter entionisiertes Wasser. Geben Sie anschließend 200 Mikroliter der Reagenzlösung zu jedem Ansatz.Die Probe 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Die Absorption bei 450 Nanometern mit einem 96-Well-Sunrise-Mikroplattenreader und der Magellan-Software zur Datenauswertung messen. Das Ergebnisdiagramm mit einer Tabellenkalkulation öffnen und eine Kalibriergerade für die Standardkurve erstellen.Berechnen Sie die Aktivität für jede Probe. Anschließend ermitteln Sie die Beta-Fructo-tase-Aktivität, indem Sie die Werte der entsprechenden Negativkontrolle von der Probenaktivität subtrahieren. Schließlich berechnen Sie die spezifische Produktivität unter Berücksichtigung des Trockengewichts der Biomasse und der Beta-Fructo-sase-Aktivität.Geben Sie drei Milliliter Kultur-Suspension in eine Plastik-Petrischale und verdünnen Sie mit physiologischer Kochsalzlösung, um morphologische Strukturen zu separieren. Die Qualität der mikroskopischen Aufnahmen ist von außerordentlicher Bedeutung. Achten Sie bei der anschließenden Bildanalyse sorgfältig auf den Verdünnungsschritt.Platzieren Sie die Petrischale unter einem Mikroskop mit integrierter Kamera. Nehmen Sie etwa 100 Bilder morphologischer Strukturen pro Probe auf und speichern Sie diese, wobei sichergestellt werden muss, dass auf jedem Bild mindestens ein Objekt vollständig abgebildet ist. Setzen Sie die Aufnahme auf dieselbe Weise mit Schalen fort, die Proben aus verschiedenen Reaktoren enthalten, und fertigen Sie jedes Mal neue Bilder an.Beachten Sie die unterschiedlichen morphologischen Wachstumsformen von Proben aus verschiedenen Reaktoren, die mit unterschiedlichen Mengen an zugesetztem Talkumpulver gezüchtet wurden. Öffnen Sie dann alle Bilder derselben Probe im Bildverarbeitungsprogramm Image J. Verwenden Sie das Werkzeug „Prozess“, um ein Binärbild zu erstellen.Wandeln Sie die Bilder in Schwarzweiß um, um den Befehl auf eine ganze Bilderserie anzuwenden. Verwenden Sie anschließend einen Makrocode und öffnen Sie eines der Bilder, das einen Maßstabsbalken enthält. Zeichnen Sie eine gerade Linie über den Maßstabsbalken, um die Anzahl der Pixel zu bestimmen, die 2000 Mikrometer entsprechen.Wählen Sie das Analysewerkzeug aus, legen Sie die Messung fest und wählen Sie die Formfaktoren, Feret-Durchmesser, Fläche und Umfang. Verwenden Sie einen Makrocode, um eine Reihe von Bildern zu verarbeiten. Öffnen Sie nun die Tabelle, die die Ergebnisse der Formfaktorwerte darstellt.Berechnen Sie für jedes Bild eine Morphologie-Nummer für alle Bilder einer Probe. Ermitteln Sie den Mittelwert der Morphologie-Nummer. Verwenden Sie ein Programm zur grafischen Darstellung und Datenanalyse, um die Morphologie-Nummer gegen die spezifische Produktivität aufzutragen.Bestimmen Sie die mathematische Beziehung durch mathematische Regression mittels Zugabe steigender Konzentrationen von Talk-Mikropartikeln. Acht Niger SKAN 10 15. Die Morphologie verändert sich von einer echten Pellet-Morphologie hin zu einer dispergierten oder sogar my-Morphologie, da unter Standardbedingungen die erwartete Pellet-Morphologie auftritt.Interessanterweise wird die myceliale Morphologie durch die Zugabe von 10 Gramm pro Liter Talkum-Mikropartikeln zum Medium erzeugt. Gleichzeitig steigt die Aktivität der Beto-Fructo-Tase um etwa das Dreifache. Die Zugabe von ein oder drei Gramm pro Liter Talkumpulver führt zu einer dispergierten Morphologie mit einer verdoppelten Fructose-Aktivität, wobei die Parameter durch automatische Bildanalyse bestimmt wurden. Die mikropartikelabhängige Morphologie kann umfassend durch Morphologie beschrieben werden.Die Anzahlnotiz, die bei glatten Pellets perfekt rund ist, erscheint in mikroskopischen Aufnahmen als perfekte Kreise für derartige Partikel. Die Morphologiezahl hat unter Standardbedingungen einen Wert, der eins annähert. Die Morphologie in Reaktor eins weist eine Morphologiezahl von etwa 0,8 auf.Die Morphologie im Reaktor vier mit 10 Gramm pro Liter Talkumpulver weist eine Morphologiekennzahl von etwa 0,1 auf. Die Morphologiekennzahl für die Reaktoren zwei und drei mit Talkumpulverkonzentrationen von ein und drei Gramm pro Liter liegt zwischen diesen Extremen und zeigt eine dispergierte Morphologie.Da die von Mikropartikeln abhängige Morphologie eng mit der Produktivität der Beta-Fruktose-Zellen verknüpft ist, besteht nach ihrer Entwicklung eine gute mathematische Korrelation zwischen Morphologie, Anzahl und Produktivität. Diese Technik ebnete den Weg für Forscher im Bereich der Biotechnologie, die Pilzmorphologie und insbesondere deren Beziehung zur Produktivität weiter zu erforschen. Anhand dieses Verfahrens zur detaillierten Erzeugung spezifischer morphologischer Pilz-Kreuztypen können auch andere wichtige Aspekte der Kultivierung filamentöser Mikroorganismen untersucht werden.Die mycelielle Morphologie ist beispielsweise bekanntermaßen viel zäher als die Palisadenmorphologie. Daher wird die Gesamtproduktivität des Verfahrens durch Probleme und die Aufreinigung des gewünschten Produkts beeinträchtigt. Unsere Morphologiezahl wird dazu beitragen, Modelle im Hinblick auf Kultur, Prothetik und das allgemeine Verständnis der Pilzmorphologie weiterzuentwickeln.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Cryo Elektronenmikroskope, entweder Scanning (SEM) oder Transmission (TEM), werden häufig für die Charakterisierung von biologischen Proben oder anderen Materialien mit einem hohen Wassergehalt 1 verwendet wird. Eine SEM / Focused Ion Beam (FIB) wird verwendet, um Merkmale von Interesse in Proben zu identifizieren und extrahieren eine dünne, elektronentransparenten Lamellen für die Übertragung auf eine Kryo-TEM.

Cryo-Elektronen-Mikroskopie-Probenvorbereitung mit Hilfe eines Focused Ion Beam

Probleme bei der Verarbeitung biologischer Proben für die Rasterelektronenmikroskopie umfassen Zellkollaps, Behandlung von Proben aus feuchten Mikroumgebungen und Zellzerstörung. Kostengünstige und relativ schnelle Protokolle, die sich für die Vorbereitung anspruchsvoller Proben wie Blütenmeristeme, Oomycetenzysten und Pilze (Agaricales) eignen, werden hier zusammengestellt und detailliert beschrieben.

Rasterelektronenmikroskopie (SEM) Protokolle für Problematische Pflanze, Oomycete und Pilzproben

Hier präsentieren wir ein Protokoll um Aspergillus Flavus Wachstum und Aflatoxin in Maiskörner mit dem Ausdruck einer antimykotischen Proteins zu analysieren.  Mit GFP exprimierenden A. Flavus Belastung überwacht wir die Infektion und die Ausbreitung des Pilzes in Reife Kerne in Echtzeit. Der Test ist schnell, zuverlässig und reproduzierbar.

Hemmung der Aspergillus Flavus Wachstum und Aflatoxin in transgenen Mais mit dem Ausdruck der α-Amylase-Inhibitor von Lablab Purpureus L.

Die Histondeaketylasen der Klasse 1 (HDACs) wie RpdA haben als potenzielle Zielscheibe zur Behandlung von Pilzinfektionen an Bedeutung gewonnen. Hier stellen wir ein Protokoll zur spezifischen Anreicherung von TAP-getagenem RpdA in Kombination mit einem HDAC-Aktivitätstest vor, der in vitro Wirksamkeitsprüfung von Histon-Deacetylase-Inhibitoren ermöglicht.

Einschaltstige Bereicherung einer TAP-Tagged-Histon-Deacetylase des Filamentous Fungus Aspergillus nidulans für Enzymatische Aktivität Assay

Hier stellen wir detaillierte Verarbeitungsprotokolle für die Abbildung empfindlicher Gewebeproben mittels Rasterelektronenmikroskopie (SEM) vor. Drei verschiedene Verarbeitungsmethoden, nämlich Hexamethyl disilazana (HMDS) chemische Trocknung, einfache Lufttrocknung und kritische Punkttrocknung werden für die Herstellung von starren Eierschalen, Embryonen in frühen Entwicklungsstadien und Pilzkulturen beschrieben.

Verarbeitung von Embryo-, Eierschalen- und Pilzkultur für die Rasterelektronenmikroskopie

Dieses Protokoll beschreibt ein Aspergillus-Infektionsmodell bei Zebrafischlarven. Aspergillus Sporen werden mikroinjiziert in das Hinterhirn von Larven, und chemische Behandlung wird verwendet, um Immunsuppression zu induzieren. Das Fortschreiten der Infektion wird über eine tägliche Bildgebung überwacht, um das Pilzwachstum und die Immunantworten sowie die Aufzählung lebender Sporen durch Koloniebildbildung zu überwachen.

Infektion von Zebrafischlarven mit Aspergillus Sporen zur Analyse von Wirts-Pathogen-Wechselwirkungen

Das CRISPR-Cas9 Genom-Editing-System ist ein benutzerfreundliches Genom-Editor, das in Modell- und Nicht-Modell-Arten verwendet wurde. Hier präsentieren wir eine proteinbasierte Version dieses Systems, die verwendet wurde, um ein vorzeitiges Stop-Codon in ein Paarungsgen eines nicht-modellischen fadenförmigen Ascomycet-Pilzes einzuführen.

CRISPR-Cas9-Vermittelte Genombearbeitung in der filamentösen Ascomycete Huntiella omanensis

Dieses Protokoll ist eine effektive, schnelle Methode, um Hefen und den Schimmelpilz Aspergillus fumigatus aus großen Sätzen von Bodenproben in nur 7 Tagen zu kultivieren. Die Methoden können leicht modifiziert werden, um eine Reihe von Inkubationsmedien und Temperaturen aufzunehmen, die für Experimente benötigt werden.

Isolierung von kultivierbaren Hefen und Schimmelpilzen aus Böden zur Untersuchung der Pilzpopulationsstruktur

Dieses Protokoll zielt darauf ab, detaillierte Verfahren zum Sammeln, Fixieren und Pflegen mykoheterotropher Pflanzenproben bereitzustellen, wobei verschiedene Mikroskopietechniken wie Raster- und Transmissionselektronenmikroskopie, Licht-, Konfokal- und Fluoreszenzmikroskopie angewendet werden, um die Pilzbesiedlung in Pflanzengeweben und Samen zu untersuchen, die mit Mykorrhizapilzen gekeimt sind.

Mikroskopische Techniken zur Interpretation der Pilzbesiedlung in mykoheterotrophen Pflanzengeweben und der symbiotischen Keimung von Samen

Hier beschreiben wir eine einfache und kostengünstige Technik zur Inokulation und Beobachtung von arbuskulären Mykorrhizapilzen in superabsorbierenden polymerbasierten autotrophen Systemen.

Inokulation und Beobachtung von arbuskulären Mykorrhizakulturen auf superabsorbierenden polymerbasierten autotrophen Systemen

Dieses Protokoll stellt eine praktische Methode am Beispiel von Methanocaldococcus jannaschii (MjsHSP16.5) vor, um eine ungleichmäßige Partikelverteilung durch Optimierung der Probenvorbereitung zu beheben, und bietet Forschern eine Referenz zur effizienten Aufklärung makromolekularer Strukturen mittels kryogener Elektronenmikroskopie (Kryo-EM).

Optimierung der Probenvorbereitung für die kryogene Elektronenmikroskopie

Erfahren Sie eine Methode zur Morphologieanpassung von Aspergillus niger durch Talkum-Mikropartikel in Bioreaktoren. Diese Technik ermöglicht die Korrelation zwischen Pilzmorphologie und Produktivität für biotechnologische Anwendungen.

Anpassung von Aspergillus niger Morphologie durch Zugabe von Talkum Mikropartikel

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