Anpassung von Aspergillus niger Morphologie durch Zugabe von Talkum Mikropartikel

Diese Methode erzeugt und charakterisiert mikropartikelabhängige morphologische Strukturen von filamentösen Pilzen, Aspergillus, Niger, um die Pilzmorphologie mit der Produktivität zu korrelieren. Kultivieren Sie acht Niger mit oder ohne Mikropartikel in einem Drei-Liter-Rührkessel und Bioreaktor für 72 Stunden, um die spezifische Produktivität zu berechnen. Entnahme von Proben zu definierten Zeitpunkten und Bestimmung der Biomasse, des Trockengewichts und der Veto-Fructo-Sase-Aktivität.

Nach 72 Stunden die Pilzmorphologie mikroskopisch untersuchen und durch digitale Bildanalyse charakterisieren. Kombinieren Sie dann relevante Parameter der Bildanalyse zu einer Morphologiezahl, die mathematisch mit der spezifischen Produktivität korreliert. Letztendlich kann diese Methode die Morphologie von Aspergillus Niger präzise generieren und umfassend charakterisieren, um die Morphogenese filamentöser Mikroorganismen besser zu verstehen.

Aspergillus Nigel ist seit vielen Jahrzehnten ein wichtiges industrielles Arbeitspferd in der Biotechnologie. Eine der faszinierendsten und oft unkontrollierbarsten Eigenschaften von Asper, Nigel und verwandten Arten ist die komplexe Morphologie, die je nach Kulturbedingungen von dichten kugelförmigen Pellets bis hin zu viskosen Myzelien reicht. Der Hauptvorteil unseres Verfahrens besteht darin, dass wir durch die Zugabe von Mikropartikeln nun in der Lage sind, die Pilzmorphologie speziell auf die Prozessanforderungen zuzuschneiden.

Bisher wurde keine andere Methode für eine solche Anpassung der Pilzmorphologie beschrieben. Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen zur Kultivierung filamentöser Mikroorganismen zu beantworten. Denn für die industrielle Anwendung ist es entscheidend, die Pilzmorphologie zu kontrollieren und auch zwischen einer gut und einer schlecht produzierenden Pilzmorphologie zu unterscheiden.

Unser Protokoll bietet die Mittel für die wünschenswerte Anpassung und Charakterisierung der Pilzmorphologie. Obwohl diese Methode einen Einblick in die Morphologie von Aspergillus Nigel geben kann, kann sie auch auf andere filamentöse Mikroorganismen wie Penicillium oder Streptostämme angewendet werden. Einrichtung von vier Bioreaktoren für sterile Kulturen, wie im beigefügten Protokoll beschrieben.

Text basierend auf Mikropartikelzugabe, kultivieren Sie Aspergillus Niger mit unterschiedlicher Morphologie. Nach 72 Stunden 50 Milliliter übertragen. Proben der Kulturbrühe in ein Falcon-Röhrchen geben.

Biomasseproben sind nach dem Trocknen im Trockenmittel mindestens in zweifacher Vervielfältigung zu entnehmen, einen Zellulosefilter mit der Mikroskala zu wiegen. Platzieren Sie den Filter in einem Buchner-Trichter mit angeschlossener Wasserstrahl-Vakuumpumpe, filtern Sie 10 Milliliter Probe, gefolgt von 10 Millilitern. Deionisiertes Wasser, um mittlere Verbindungen aus der Biomasse zu entfernen, zerknittern Sie den Filter einmal in der Mitte.

Legen Sie es in eine Petrischale aus Glas und in einen Fachtrockner, bis das Gewicht konstant ist. Den Filter in ein Trockenmittel geben und abkühlen lassen. Messen Sie dann das Gewicht.

Berechnen Sie das Biomasse-Trockengewicht pro Liter durch Berechnung des Gewichts, der Differenz der Filter und der anschließenden Division durch das Probenvolumen für die Glukoseoxidase- und Peroxidase-Enzymassays. Lagern Sie die Proben mit einem Spritzenpass von 1,5 Millilitern auf Eis. Kultursuspension durch einen Celluloseacetat-Filter in ein Reaktionsröhrchen Führt den Beta-Fructo-SASE-Assay durch.

Akribisch stellen wir den Erfolg mit zwei dreifachen Stichproben für statistische Robustheit sicher. Um den Assay zu starten, geben Sie 20 Mikroliter Probe in das Reagenzglas, um die pH- und temperaturabhängige Spaltung von Saccharose zu Glukose zu kontrollieren, verwenden Sie 20 Mikroliter deionisiertes Wasser anstelle von 20 Mikrolitern Probe. Außerdem ist für jede Probe eine Negativkontrolle für Restglukose in der Kulturbrühe durch Assay vorzubereiten.

20 Mikroliter hitzeinaktivierte Probe Um die Reaktion von Saccharose zu Glukose einzuleiten, fügen Sie 200 Mikroliter 1,65 molare Saccharoselösung hinzu. Bei einem pH-Wert von 5,4 bis 20 Mikrolitern inkubieren Sie alle Reaktionsgefäße 20 Minuten lang in einem 40 Grad Celsius heißen Heizblock. Stoppen Sie die Reaktion, indem Sie nach dem Abkühlen der Röhren auf Eis 10 Minuten lang auf 95 Grad Celsius erhitzen.

Zentrifugieren Sie die Proben, falls erforderlich, und verdünnen Sie die Proben für den Assay so, dass die gemessene Absorption im kalibrierten Wertebereich liegt. Geben Sie nun für jede Reaktion zwei Mikroliter Probe in eine Mikrotiterplatte. Führen Sie Probenmessungen in dreifacher Ausfertigung durch.

Bereiten Sie auch eine Standardkurve für 10 Glukoselösungen vor, die von einem Millimolar bis 15 Millimolar reichen. Für die Nullpunktkalibrierung verwenden Sie zwei Mikroliter entionisiertes Wasser. Fügen Sie als Nächstes jeweils 200 Mikroliter der Reagenzlösung hinzu.

10 Minuten bei Raumtemperatur gut inkubieren. Messen Sie die Absorption bei 450 Nanometern mit einem 96-Well-Sunrise-Mikroplatten-Reader und der Magellan-Datenabrufsoftware. Öffnen Sie das Ergebnisdiagramm mit einer Tabelle, und erstellen Sie eine Standardkurvenkalibrierungslinie.

Berechnen Sie die Aktivität für jede Probe. Berechnen Sie dann die Beta-Fructo-Tase-Aktivität, indem Sie die Werte der entsprechenden Negativkontrolle von der Stichprobenaktivität subtrahieren. Berechnen Sie schließlich die spezifische Produktivität, indem Sie das Trockengewicht der Biomasse und die Beta-Fructo-Sase-Aktivität berücksichtigen.

Geben Sie drei Milliliter Kultursuspension in eine Petrischale aus Kunststoff und verdünnen Sie sie mit physiologischer Natriumchloridlösung, um die morphologischen Strukturen zu trennen. Die Qualität der mikroskopischen Bilder ist von außergewöhnlicher Bedeutung. Für die anschließende Bildanalyse ist während des Verdünnungsschritts Vorsicht geboten.

Platzieren Sie die Petrischale unter einem Mikroskop, das über eine integrierte Kamera verfügt. Erfassen und speichern Sie etwa 100 Bilder morphologischer Strukturen pro Probe, um sicherzustellen, dass mindestens ein Objekt auf jedem Bild vollständig abgebildet ist. Fahren Sie auf die gleiche Weise mit Schalen fort, die Proben aus verschiedenen Reaktoren enthalten, und nehmen Sie jedes Mal neue Bilder auf.

Zu beachten ist die unterschiedliche morphologische Wachstumsform von Proben aus verschiedenen Reaktoren, die mit unterschiedlichen Mengen an zugesetztem Talkumpuder angebaut wurden. Öffnen Sie dann alle Bilder der gleichen Probe im Bildbearbeitungsprogramm. Bild J.Mit dem Prozesswerkzeug binär machen.

Konvertieren Sie die Bilder in Schwarzweiß, um den Befehl auf eine ganze Reihe von Bildern anzuwenden. Verwenden eines Makrocodes Öffnen Sie als Nächstes eines der Bilder mit einer Maßstabsleiste. Erstellen Sie eine gerade Linie über die Maßstabsleiste, um die Anzahl der Pixel zu bestimmen, die 2000 Mikrometer entsprechen.

Wählen Sie das Analysewerkzeug aus, legen Sie die Messung fest, und wählen Sie die Formfaktoren, Frettchen, den Durchmesserbereich und den Umfang aus. Verwenden Sie einen Makrocode, um eine Reihe von Bildern zu verarbeiten. Öffnen Sie nun die Tabelle, in der die Ergebnisse der Formfaktorwerte dargestellt sind.

Berechnen Sie für jedes Bild eine Morphologiezahl für jedes Bild mit allen Bildern einer Probe. Berechnen Sie den Mittelwert für die Morphologiezahl. Verwenden Sie ein Grafik- und Datenanalyseprogramm, um die Morphologiezahl mit der spezifischen Produktivität darzustellen.

Bestimmung des mathematischen Zusammenhangs durch mathematische Regression durch Zugabe steigender Konzentrationen von Talkum-Mikropartikeln. Acht Niger SKAN 10 15. Die Morphologie ändert sich von einer echten Pelletmorphologie zu einer dispergierten oder sogar meine Morphologie, wie erwartet, die Pelletmorphologie zeigt sich unter Standardbedingungen.

Interessanterweise wird die Myzelmorphologie durch die Supplementierung des Mediums mit 10 Gramm Talkum-Mikropartikeln pro Liter erzeugt. Gleichzeitig steigt die Aktivität von Beto Fructo Tase etwa um das Dreifache, eine Supplementierung von einem oder drei Gramm pro Liter Talkumpuder führt zu einer dispergierten Morphologie mit einer verdoppelten Fruktoseaktivität unter Verwendung von Parametern, die durch automatische Bildanalyse bestimmt werden. Die mikropartikelabhängige Morphologie kann durch die Morphologie umfassend beschrieben werden.

Zahlennote: Perfekt rund in glatten Kügelchen erscheinen in mikroskopischen Bildern als perfekte Kreise für solche Teilchen. Die Morphologiezahl hat einen Wert, der sich dem Wert unter Standardbedingungen annähert. Die Morphologie in Reaktor eins weist eine Morphologiezahl um 0,8 auf.

Die Morphologie in Reaktor vier mit 10 Gramm pro Liter. Talkumpuder hat eine Morphologiezahl um 0,1. Die Morphologiezahl für die Reaktoren zwei und drei mit Talkumpulverkonzentrationen von einem und drei Gramm pro Liter liegt zwischen diesen Extremen, was eine dispergierte Morphologie zeigt.

Da die mikropartikelabhängige Morphologie eng mit der Produktivität der Beta-Fruktose-Zyten zusammenhängt, besteht eine gute mathematische Korrelation von Morphologie, Anzahl und Produktivität nach ihrer Entwicklung. Diese Technik ebnete den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Biotechnologie, die Morphologie von Pilzen und insbesondere ihre Beziehung zur Produktivität weiter zu erforschen. Nach diesem Verfahren der detaillierten Erstellung spezifischer morphologischer Pilzkreuzungstypen können weitere wichtige Aspekte der Kultivierung filamentöser Mikroorganismen erforscht werden.

Myzelmorphologie zum Beispiel ist dafür bekannt, dass sie viel viskoser ist als die Gaumenmorphologie. Daher wird die Gesamtproduktivität des Prozesses durch Probleme und die Reinigung des gewünschten Produkts beeinträchtigt. Unsere Morphologiezahl wird dazu beitragen, Modelle in Bezug auf Kultur, Pro-Theologie zu etablieren und unser Verständnis der Pilzmorphologie im Allgemeinen zu fördern.