Infektion von Zebrafischlarven mit Aspergillus Sporen zur Analyse von Wirts-Pathogen-Wechselwirkungen

Dieses Protokoll demonstriert ein Larven-Zebrafisch-Aspergillus-Infektionsmodell, mit dem wir die angeborene Immunantwort auf diesen Pilz untersuchen können. Der Hauptvorteil des Zebrafischlarvenmodells besteht darin, dass wir die Interaktionen zwischen Immunzellen und Krankheitserregern und den Infektionsverlauf in einem lebenden Wirtstier während einer mehrtägigen Infektion sichtbar machen können. Die Erkenntnisse aus diesem Modell könnten auf die Entdeckung neuer therapeutischer Ziele zur Behandlung von invasiver Aspergillose bei immungeschwächten Patienten anwendbar sein.

Die Mikroinjektion von Sporen in Zebrafischlarven ist eine schwierige Technik, die viel Übung erfordert, bevor konsistente und reproduzierbare Ergebnisse erzielt werden können. Verwenden Sie für die Durchführung von Mikroinjektionen das mit einem Druckinjektor, einer Vakuumdruckeinheit, einem Fußschalter, einem Mikropipettenhalter, einem Mikromanipulator sowie einem Magnetständer und einer Magnetplatte. Alle sind mit einer Druckluftquelle verbunden.

Öffnen Sie das Druckluftventil. Und schalten Sie den Mikroinjektor ein. Stellen Sie den Druck auf etwa 25 psi, die Verstärkung auf 60 Millisekunden und die Vakuumdruckeinheit auf 1 psi ein.

Verwenden Sie eine Mikrolader-Pipettenspitze, um die Mikroinjektionsnadel mit drei bis fünf Mikrolitern PBS oder Sporensuspension mit Phenolrot zu beladen. Montieren Sie dann die Nadel auf den Mikromanipulator. Aspergillus fumigatus ist ein opportunistischer Erreger des Menschen.

Es besteht die Gefahr einer Hautdurchstichung mit der geladenen Nadel. Die Nadel sollte sehr fest mit dem Mikroinjektor verbunden sein, und Forscher sollten immer Handschuhe tragen und genau auf ihre Handbewegungen um die Nadel herum achten, um eine Punktion zu vermeiden. Positionieren Sie den Mikromanipulator so, dass das Ende der Nadel unter dem Stereomikroskop bei geringster Vergrößerung sichtbar ist.

Zoomen Sie auf 4-fache Vergrößerung, wobei Sie die Nadel im Blick behalten. Schneide dann mit einer scharfen Pinzette das Ende der Nadel ab. Drücken Sie das Einspritzpedal, um die Größe des Tröpfchens zu visualisieren.

Und schneiden Sie die Nadel so lange ab, bis etwa drei Nanoliter Sporensuspension herauskommen. Wenn Sie fertig sind, schieben Sie den Mikromanipulator und die Nadel aus dem Weg, um zu vermeiden, dass Sie versehentlich auf die Nadel treffen, während Sie die Larven auf der Injektionsplatte anordnen. Gießen Sie E3 Tricain von der Injektionsplatte.

Und übertragen Sie etwa 24 betäubte zwei Tage alte Larven mit so wenig E3 wie möglich auf die Platte. Ordnen Sie dann die Larven entsprechend der Richtung an, in die sie zeigen, indem Sie alle Larven in einer Reihe nach rechts und alle nach links in einer Reihe darunter platzieren. Stellen Sie das Mikroskop auf die niedrigste Vergrößerung ein und bringen Sie den Mikromanipulator zurück, so dass sich die Nadel in einem Winkel von 30-60 Grad nahe an den Larven befindet.

Zoomen Sie in die höchste Vergrößerung. Und verwenden Sie die Feineinstellknöpfe, um die Position der Nadel weiter einzustellen. Injizieren Sie die Sporensuspension in die Flüssigkeit neben den Larven, um sicherzustellen, dass 30-70 Sporen aus der Nadel kommen.

Bewegen Sie dann die Platte so, dass sich die Nadel direkt über und in der Nähe der ersten Larven befindet. Beginnend mit den Larven, die zur Nadel zeigen. Führen Sie die Nadel durch das Gewebe um das Vesikel oticus und stechen Sie sie in den Hinterhirnventrikel ein, wobei Sie die Platte nach Bedarf bewegen, um die richtige Ausrichtung der Larve zu erhalten.

Vergewissern Sie sich visuell, dass sich das Ende der Nadel in der Mitte des Hinterhirnventrikels befindet. Drücken Sie dann das Fußpedal, um Sporen zu injizieren, und ziehen Sie die Nadel vorsichtig zurück. Nachdem Sie alle Larven in beiden Reihen injiziert haben, schieben Sie die Nadel wieder aus dem Weg.

Und zoomen Sie auf eine niedrigere Vergrößerung. Der Farbstoff Phenolrot sollte im Hinterhirn jeder Larve noch sichtbar sein. Entsorgen Sie alle Larven mit erfolglosen Injektionen und geben Sie die verbleibenden Larven in eine Petrischale, indem Sie sie vom Teller mit frischem E3 abwaschen. Spülen Sie die Larve zweimal mit E3 aus und stellen Sie sicher, dass sie sich von der Narkose erholt.

Unmittelbar nach der Injektion werden acht der Larven in einzelne 1,7-Milliliter-Röhrchen überführt und eingeschläfert. Bereiten Sie 1 ml PBS mit Ampicillin und Kanamycin vor. Entferne so viel Flüssigkeit wie möglich aus den Röhrchen mit den Larven.

Fügen Sie dann 90 Mikroliter des PBS mit Antibiotika hinzu. Homogenisieren Sie die Larven in einem TissueLyser bei 1800 Oszillationen pro Minute für sechs Minuten. Drehen Sie sie dann 30 Sekunden lang mit dem 17.000-fachen G nach unten.

Pipettieren Sie die homogenisierte Suspension aus jedem Röhrchen in die Mitte einer beschrifteten GMM-Platte und verteilen Sie sie mit einem L-förmigen Einweg-Spreader. Achten Sie darauf, dass Sie sich nicht gegen die Felge ausbreiten. Inkubieren Sie die Platten kopfüber bei 37 Grad Celsius für zwei bis drei Tage.

Zählen Sie dann die Anzahl der gebildeten Völker. Teilen Sie die restlichen injizierten Larven auf zwei 3,5-Millimeter-Schalen auf. Einen für die medikamentöse Behandlung und einen für die Kontrolle.

Entfernen Sie so viel Flüssigkeit wie möglich und geben Sie E3 mit der Fahrzeugsteuerung in eine Schüssel. Und E3 mit der Behandlung von Interesse für den anderen. Verwenden Sie eine Pipette, um jede Larve in eine Vertiefung in einer 96-Well-Platte zu übertragen.

Und überwachen Sie ihr Überleben sieben Tage lang. Bereiten Sie am Tag der Bildgebung eine 3,5-Millimeter-Petrischale mit 100 mikromolaren PTU und eine mit E3-Tricain vor. Geben Sie E3-Tricain in die Kammern eines Z-Keil-E-Geräts und verwenden Sie eine P100-Mikropipette, um Luftblasen aus den Kammern und dem Rückhaltekanal zu entfernen.

Entfernen Sie dann alles überschüssige E3-Tricain außerhalb der Kammern. Pipettieren Sie eine Larve hoch und geben Sie sie mit der E3 PTU in die Schale. Übertragen Sie es dann mit so wenig Flüssigkeit wie möglich auf das E3-Tricain.

Nach 30 Sekunden werden die betäubten Larven in die Ladekammer der Verwundungs- und Einklemmvorrichtung überführt. Entfernen Sie E3-Tricain aus der Verwundungskammer und geben Sie es in die Ladekammer ab, um den Schwanz der Larven in den Restriktionskanal zu bewegen. Stellen Sie sicher, dass die Larve auf der lateralen, dorsalen oder dorsolateralen Seite positioniert ist, damit das Hinterhirn mit einer umgekehrten Objektivlinse abgebildet werden kann.

Nachdem Sie die Larve mit einem konfokalen Mikroskop abgebildet haben, geben Sie E3-Tricain in die Verwundungskammer ab, um die Larve aus dem Rückhaltekanal in die Ladekammer zu drücken. Nehmen Sie die Larve auf und geben Sie sie mit E3-Tricain zurück in die Schale. Füllen Sie es dann mit so wenig Flüssigkeit wie möglich in die Schale mit E3 PTU um.

Spülen Sie es in PTU und geben Sie es zurück in die 48-Well-Platte. Aspergillus-Sporen wurden in das Hinterhirn von Zebrafischlarven mikroinjiziert, ein Infektionsverlauf wurde überwacht. Bei den Wildtyp-Larven wurde nur ein sehr geringer Tod beobachtet, wobei 80 bis 100 % der Larven das gesamte Experiment überlebten.

Eine signifikante Verringerung des Überlebens wurde bei immunsupprimierten Larven beobachtet. Bei der Quantifizierung der koloniebildenden Einheiten aus infizierten Wildtyp-Larven wurde eine Persistenz der Sporen und eine langsame Clearance im Laufe der Zeit beobachtet. Die Anzahl der Sporen, die ein, zwei, drei, fünf und sieben Tage nach der Infektion überlebten, wurde auf die Anzahl der injizierten Sporen normalisiert, um die Persistenz und Clearance zwischen den Replikaten zu vergleichen.

Bei der Markierung von Makrophagen wurde in der Regel eine Clusterbildung von Mikrophagen bei etwa 50 % der Larven ab zwei bis drei Tagen nach der Infektion beobachtet. Die Rekrutierung von Neutrophilen war verzögert und erfolgte hauptsächlich nach einer Pilzkeimung. Während die Pilzbelastung während des gesamten Experiments bei der Mehrzahl der Larven bestehen blieb.

Bei einigen wurde eine Clearance fünf Tage nach der Infektion beobachtet. Bei einer anderen Untergruppe von Larven wurde eine Pilzausbreitung in Bereiche außerhalb des Hinterhirns beobachtet. Der Bereich um das Vesikel ist ein Ort, an dem diese Ausbreitung gefunden wurde.

Die Pilzkeimung wurde bei 60 % der Larven in der Regel nach fünf Tagen beobachtet. Die Fläche des Phagozytenclusters, die Rekrutierung von Makrophagen und die Rekrutierung von Neutrophilen variierten im Laufe der Zeit bei allen Larven. Einige zeigten im Laufe des Experiments einen Aufwärtstrend, andere lösten sich im Laufe der Zeit auf.

Dieses Verfahren kann mit genetischer Manipulation von Zebrafischen, wie z.B. mit CRISPR, kombiniert werden, um die Notwendigkeit spezifischer Wirtswege für eine erfolgreiche angeborene Immunantwort auf Aspergillus zu bestimmen. Dieses Protokoll hat es ermöglicht, die Interaktionen zwischen Aspergillus und angeborenen Immunzellen in Echtzeit in lebenden, intakten Wirten sichtbar