Rasterelektronenmikroskopie (SEM) Protokolle für Problematische Pflanze, Oomycete und Pilzproben

Das Ziel dieser Methodik ist es, empfindliche Gewebe von Pflanzen, Oomyceten und Pilzen für ihre optimale Betrachtung unter einem Rasterelektronenmikroskop (REM) zu handhaben. Diese Methode kann uns helfen, Fragen zu praktisch allen Pilzen, Mikroben und Krankheiten zu beantworten und wie sie ihren Wirt infizieren, besiedeln und sich an ihn anheften. Die Technik in unserer verbesserten Methodik dient zur Fixierung von Proben, für die die mi-toh-mins in aquatischen Ökosystemen.

Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie es uns ermöglicht, Schlüsselaspekte der Infektion mit teuren und leicht verfügbaren Mitteln zu visualisieren. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die Schritte gegenüber herkömmlichen Protokollen stark modifiziert wurden. Und veröffentlichte Methoden beschreiben allgemeine Vorgehensweisen ohne Details.

Bereiten Sie zunächst das Formol und den Essigalkohol oder das FAA-Fixiermittel in einem Abzug vor, der mit einem Aldehydfilter ausgestattet ist. Bei 85 Teilen 70 % denaturiertem Ethanol, 10 Teilen 60 % Formaldehydlösung und fünf Teilen Eisessig. Gießen Sie unter dem Abzug den Vorrat an FAA in einzelne Behälter.

Wählen Sie die zu fixierenden Blüten- oder vegetativen Meristeme aus und stellen Sie sicher, dass sie nicht durch Insekten, Pilze oder extreme Wetterbedingungen beschädigt werden. Schneiden Sie die Äste ab, entfernen Sie unerwünschtes Material und legen Sie die Probe sofort in die FAA-Lösung. Gießen Sie das FAA nach 72 bis 96 Stunden zur Chemikalienentsorgung in einen Plastikbehälter.

Waschen Sie die Proben sofort dreimal mit frischem 70%igem Ethanol, um alle FAA-Rückstände zu entfernen. Fixiertes Material kann unbegrenzt in 70%igem Ethanol gelagert werden. Präparieren Sie die Proben in eine mit Ethanol bedeckte Petrischale, um ein Austrocknen des Gewebes zu verhindern.

Verwenden Sie eine Petrischale, deren Boden mit einem trockenen, schwarzen Silikon bedeckt ist, um das kontrastierende weiße Gewebe besser sehen zu können. Füllen Sie das Gewebe in separate Behälter und tauchen Sie diese dann in eine Petrischale mit 70% Ethanol. Setzen Sie die Deckel auf die Behälter und legen Sie sie in ein Zentrifugenröhrchen aus Kunststoff mit reichlich 70% Ethanol.

Übertragen Sie das präparierte Material durch eine Ethanolserie in hermetische Gläser oder Zentrifugenröhrchen. Lassen Sie die Proben mindestens eine Stunde lang in jeder Lösung. Bewahren Sie die Proben dann über Nacht in einer 100%igen Ethanollösung auf.

Nach der Ethanol-Serie übergeben Sie die Behälter mit dem Material an den CPD und schreiben die Probenidentifikationsnummer unter die REM-Probenhalter. Decken Sie dann die Oberseite der Stummel mit doppelseitigem Klebeband ab.

Legen Sie die Stummel in einen Probenhalter. Öffnen Sie unter einem Stereomikroskop vorsichtig die Behälter mit den jungen und empfindlichen Proben, die bereits im CPD getrocknet sind. Beachten Sie, dass die Proben nach der CPD-Behandlung leichter und empfindlicher gegenüber Elektrostatik werden.

Verschließen Sie die Behälter, sobald die Proben entnommen wurden, um Staub oder Verunreinigungen zu vermeiden. Legen Sie die Proben auf die klebrige Oberfläche der Stummel und planen Sie im Voraus für die gewünschte Position. Sobald die Proben die Oberfläche berühren, ist es sehr schwierig, sie zu entfernen.

Versuchen Sie an dieser Stelle nicht, eine größere Sektion durchzuführen. Entfernen Sie einfach das unerwünschte Gewebe, das leicht aufzunehmen ist. Für palynologische Studien zerlegen Sie die Staubbeutel und öffnen sie, um den Pollen auf den Stummeln freizulegen.

Bewahren Sie die Proben über Nacht in einem hermetischen Behälter mit Kieselgel auf, um eine erneute Austrocknung zu vermeiden. Beschichten Sie die Proben mit dem Spotter-Coater und überführen Sie sie auf das REM, wie im Textprotokoll beschrieben. Um das differentielle Wachstum der Stacheln der Zysten auf separaten Petrischalen zu testen, geben Sie 0,5 Milliliter der sekundären Zystensuspension auf verschiedene Oberflächen.

Zu den Oberflächen können Transmissionselektronenmikroskopiegitter aus Kohlenstoff, Gold und Kupfer gehören. Früher wurden gebleichte Lachs- und Seehechtschuppen sowie Glasabdeckfolien verwendet. Inkubieren Sie die Zysten 70 Minuten lang bei 20 Grad Celsius, was die Anheftung der Zysten an die Oberfläche begünstigt.

Entfernen Sie die Flüssigkeit und geben Sie 0,5 Milliliter 2%iges Glutaraldehyd auf jede Oberfläche für die Fixierung der Zysten. Bewahren Sie die Proben eine Stunde lang bei Raumtemperatur unter einem Abzug auf. Entfernen Sie das Glutaraldehyd und dehydrieren Sie die Proben durch eine Ethanolreihe, indem Sie 15 Minuten lang fünf Milliliter jeder der Ethanollösungen hinzufügen.

Sobald sich die Probe in der letzten 100%igen Ethanollösung befindet, kann sie bis zu einem Monat in einer verschlossenen Petrischale gelagert werden. Übertragen Sie die Gitter und die Skalen vorsichtig aus der Petrischale in einen für die CPD geeigneten Halter, der die Proben voneinander trennt, z. B. einen CPD-Gitterhalter oder einen Stapelprobenhalter. Nehmen Sie das Gitter und die Schuppen mit einer Pinzette und denken Sie daran, dass die Zysten immer nach oben auf den Gittern liegen sollten.

Fahren Sie mit dem Trocknen des Materials mit dem CPD fort, bevor Sie die REM-Probenvorbereitung der Eizellen durchführen, um ihr Verhalten auf verschiedenen Oberflächen zu beobachten, wie im Textprotokoll beschrieben. Wickeln Sie jede Probe vorsichtig mit Filterpapier ein und bilden Sie etwa 0,5 bis einen Quadratzentimeter große, mit Bleistift beschriftete Umschläge. Achten Sie darauf, die Proben nicht zu zerdrücken.

Verschließen Sie das Filterpapier mit Büroklammern. Übertragen Sie dann die verpackten Proben in eine Petrischale und tauchen Sie sie in 10 Milliliter Wasser, um das Gewebe um die Sporen herum zu rehydrieren. Legen Sie die Proben sofort in die Mikrowelle.

Entferne das Material, sobald das Wasser zu verdunsten beginnt, und lass es bei Raumtemperatur abkühlen. Anschließend wird die Probe durch eine Ethanolreihe geleitet. Verwenden Sie für diesen Schritt je nach Probenmenge ein Becherglas oder ein Zentrifugenröhrchen.

Lassen Sie die Proben 15 Minuten lang in jeder Lösung. Legen Sie anschließend die Proben in die CPD, wie im Textprotokoll beschrieben. Um die Sporen für die REM-Betrachtung zu mounten, öffnen Sie die Umschläge.

Sammeln Sie dann die Sporen mit der klebrigen Oberfläche der Stummel und achten Sie darauf, sie nicht zu zerquetschen. Führen Sie abschließend eine Goldbeschichtung der Proben und eine REM-Betrachtung durch, wie im Textprotokoll beschrieben. Hier sind blumige Knospen von Anacyclus clavatus zu sehen, die mit Osmiumtetroxid behandelt und unter Verwendung des FAA CPD-Protokolls hergestellt wurden, das in diesem Video gezeigt wird.

Gezeigt werden auch getrocknete Proben von Phellorinia herculanea ohne jegliche Behandlung, sowie Pilzsporen, die behandelt wurden, wie in diesem Video gezeigt. Diese Abbildung zeigt die frühe, mittlere und späte Blütenentwicklung, die unter dem REM erfasst wurde. Dieses Bild zeigt die Draufsicht eines jungen Reh-cim.

Hier ist eine blumige Knospe während der Gynesium-Differenzierung und eine Blüte an der Anthese zu sehen. Einige Strukturen können schwierig zu fixieren und für die Bildgebung unter dem REM zu konservieren sein. Beispiele hierfür sind solche, die aus feuchten Umgebungen stammen, sowie solche mit Ornamenten und solche mit Indumenta.

Hier sind unterschiedliche Wachstumsmuster der Stacheln von Saprolegnia parasitica auf Glas-, Kohlenstoff-, Kupfer-, Gold-, Seehechtschuppen und Lachsschuppen dargestellt. Dies ist ein Video, das den asexuellen Lebenszyklus von Saprolegnia parasitica zeigt. Der asexuelle Lebenszyklus ist wichtig für die Ausbreitung dieser Organismen in ihren aquatischen oder feuchten Umgebungen.

Darüber hinaus stellen Zoo-Spoors, die in diesem Stadium produziert werden, die primäre Infektionseinheit bei parasitären Arten der Ordnung saprolegniales dar. Obwohl die Beherrschung dieser Technik in drei bis fünf Tagen durchgeführt werden kann, wird sie ordnungsgemäß ausgeführt. Wir haben Geld verwendet, um die SEM-Therapien zu vervollständigen, die in diesem Zeitraum im Königlichen Botanischen Garten in Madrid zur externen Anwendung bereitgestellt werden.

Nach dem Anschauen dieses Videos wissen die Forscher, wie sie empfindliches biologisches Material für die REM-Beobachtung effektiv sammeln und fixieren können. Die Zerstörung von Zellen, Organverzerrungen oder die schlechte Konservierung von Proben aus feuchten Umgebungen können mit diesem Verfahren leicht überwunden werden. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass die Betrachtung durch REM auf die Untersuchung von Oberflächen mit hoher Vergrößerung beschränkt ist.

Auch vor der CPD-Behandlung müssen die Dichtungen vor schockartigen Veränderungen und direktem Kontakt mit der Luft geschützt werden. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Phytologie, um die Sporenstruktur während des Infektionsprozesses zu erforschen, insbesondere bei Arten, die für die Fischerei von Interesse sind. Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden wie Transmissionsmikroskopie oder TM durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, z. B. wie die innere Struktur der Zellzusammensetzung in einem bestimmten Organ oder einer bestimmten Zelle oder in Pollen aussieht.

Vergessen Sie nicht, dass die Handhabung von Formalin und Glutaraldehyd äußerst gefährlich sein kann, und Vorsichtsmaßnahmen wie das Arbeiten unter einem Abzug und die Verwendung von Masken, Laborkitteln und Handschuhen sollten bei der Durchführung dieses Verfahrens immer getroffen werden.