Name: Rasterelektronenmikroskopie (SEM) Protokolle für Problematische Pflanze, Oomycete und Pilzproben (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 57 s
Description: Lernen Sie optimierte Präparationsprotokolle für Rasterelektronenmikroskopie empfindlicher Pflanzen-, Oomyceten- und Pilzproben. Diese Methode ermöglicht verbesserte Visualisierung von Infektionsprozessen.

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Dieses Projekt hat die Finanzierung von der Europäischen Union Horizont 2020 Forschungs- und Innovationsprogramm unter Finanzhilfevereinbarung Nr erhielt 634429. Diese Publikation des Autors, die Ansichten reflektiert, und die Europäische Kommission kann nicht für die weitere Verwendung gehalten werden, die von den Informationen gemacht werden können, darin enthalten sind. Wir erkennen auch die finanzielle von Real Jardín Botánico, CSIC Beitrags. SR dankt der Europäischen Union [ITN-SAPRO-238550] für die Unterstützung ihrer Forschung in Saprolegnia. Wir wollen auch für bieten Francisco Calonge danken Sie bitte die Phellorinia herculanea Bilder und B. Pueyo für die Verarbeitung von Proben (Abbildung 5). Alle Bilder wurden von dem SEM-Service im Real Jardín Botánico-CSIC in Madrid genommen.

HINWEIS: Dieses Protokoll enthält sechs Hauptbereiche, drei gewidmet bestimmte Organismen (Abschnitte 1-3), und drei der Beschreibung der Verfahren, die für alle (4-6). Sternchen (*) zeigen Schritte, die von den Experimentatoren modifiziert. 1. Studium der Entwicklung und Voll baulichen Anlagen Formed <ol><li> Sammlung und Fixierung <ol><li> Wenn das Pflanzenmaterial in einem Ort ohne Zugang zu einem Abzug gesammelt wird, einführen und das Material in 70% Ethanol in Zentrifugenröhrchen eintauchen. Idealerweise tauchen Sie das Material nach 48 h in FAA (Schritte 1.1.1-1.1.3) übermäßige Dehydratisierung in Ethanol zu vermeiden. Wenn ein Abzug auf das Pflanzenmaterial zugänglich ist, ignorieren Sie diesen Schritt und fahren Sie mit 1.1.1. </li><li> Bereiten Sie die Formalin-Essigsäure-Alkohol (FAA) Fixiermittel in einem Abzug mit einem Aldehyd-Filter ausgestattet. Mit 85 Teilen 70% denaturiertem Ethanol, 10 Teile 60% ige Formaldehydlösung und 5 Teilen Eisessig. Bereiten Sie die FAAkurz bevor das Material, die als langfristige Lagerung Befestigung ist nicht mehr als 40 empfohlen. </li><li> Unter dem Abzug, gießen Sie den Bestand der FAA in einzelne Breit Mund und auslaufsicher Kunststoff-Flaschen. Verwenden Sie so viele Flaschen wie es Proben zur Verfügung, und erstellen Sie Etiketten für die Probenidentifikation. </li><li> Wählen Sie die Blumen- oder vegetative meristems zu beheben, um sicherzustellen, dass sie nicht von Insekten beschädigt sind, Pilze oder extreme Wetterbedingungen. Schneiden Sie die Zweige, das Entfernen von unerwünschtem Material, und legen Sie die Probe sofort in der FAA Lösung. </li><li> Nach 72-96 h, gießen Sie die FAA in einen Plastikbehälter für die chemische Verfügung. Sofort, waschen Sie die Proben dreimal mit frischem 70% Ethanol restliche FAA zu entfernen. Festmaterial kann auf unbestimmte Zeit in 70% Ethanol aufbewahrt werden. </li></ol></li><li> Dissection und Dehydration <ol><li> Präparieren Sie die feste Material in 70% Ethanol unter dem Stereomikroskop ultrafeinen Pinzette, neEdles, Pinzetten, Pinsel und Mikro-Skalpelle (die maximale Größe des Gewebes sollte etwa 1 cm 3 oder 2 cm für Flachmaterial sein). Präparieren der Proben in eine Petrischale mit Ethanol bedeckt das Gewebe vor dem Austrocknen zu verhindern. Verwenden Sie eine Petrischale mit der Basis mit trockenem schwarzem Silikon bedeckt, um besser die kontrastierenden weißen Gewebe zu sehen. </li><li> Setzen Sie den sezierten Material in die Probenbehälter für den kritischen Punkt Trockner (CPD, Abbildung 2a). An dieser Stelle tauchen die Behälter in die Petrischale mit 70% Ethanol, und umfassen die Probenidentifikationsetiketten (hergestellt mit Papier und Bleistift). Für eine effektivere Trocknung zur weiteren Manipulation, vermeiden Sie die junge und reife Proben in demselben Behälter mischen. * </li><li> Setzen Sie den Deckel auf den Behältern und deponieren sie in Plastikzentrifugenröhrchen mit reichlich 70% Ethanol. Lagern Sie die Röhrchen über Nacht, wenn das Material nicht sofort verarbeitet wird. </li><li> Übertragen Sie das sezierte Material durch die folgende Ethanol series in hermetischen Gläsern oder Zentrifugenröhrchen: 70%, 90%, 100% und 100%. Lassen Sie die Proben in jeder Lösung für 1 h mindestens. Halten Sie die Proben über Nacht in einer 100% igen Ethanollösung. </li><li> Übertragen Sie die Behälter mit dem Material der BPR (Abschnitt 4). </li></ol></li><li> Montage und Herstellung von Pflanzengeweben für SEM - Beobachtung <ol><li> Schreiben Sie die Probenidentifikationsnummer unter den SEM - Probenhalter (dh Aluminium - Stubs). Decken Sie die Oberseite der Stümpfe mit einem doppelseitigen Klebeband. Platzieren Sie den Stummel in einen Probenhalter (Abbildung 2b). </li><li> Unter einem Stereomikroskop, öffnen Sie sorgfältig die Behälter, die jungen und empfindlichen Proben tragen bereits in der CPD getrocknet. Beachten Sie, dass nach der CPD-Behandlung, die Proben werden leichter und empfindlich gegenüber Elektrostatik. Schließen der Behälter, nachdem die Proben wurden Staub oder Verunreinigungen zu vermeiden entnommen. </li><li> Legen Sie die Proben auf der klebrigen Oberfläche der Stubs, vorausschauende Planung der gewünschtePosition (sobald die Proben, die die Oberfläche berühren, ist es sehr schwierig ist, sie zu entfernen). Versuchen Sie nicht, eine große Dissektion an dieser Stelle zu tragen; nur unerwünschtes Gewebe zu entfernen, die zu holen ist einfach. Für palynologische Studien, sezieren die Antheren und öffnen sie den Pollen auf die Stümpfe zu belichten. </li><li> Stellen lange Proben (beispielsweise 2 cm lang) wie inflorescences in der horizontalen Position. Wenn möglich, orient Proben der gleichen Struktur für polare, Seiten- und Unteransichten. Lassen Sie genügend Platz zwischen den Proben auf dem Stummel. </li><li> Wenn die Proben nicht sofort verarbeitet werden können, halten sie über Nacht in einem hermetischen Behälter mit Kieselgel geschützt Rehydrierung (Abbildung 2c) * zu vermeiden. Bestreichen Sie die Proben unter Verwendung des Sputter-Coater und dessen Übertragung an den SEM (Abschnitte 5 und 6). </li></ol></li></ol><img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/55031/55031fig2.jpg" /> Abbildung 2: Werkzeug für die Probe manipulatiauf und Verarbeitung vor dem SEM-Beobachtung. (A) aus Stahl Probenbehälter mit Löchern versehenen Wände für die Ethanol / CO 2 Austausch in der CPD Kammer. (B) Stahlstummel in einem Kunststoffprobenhalter. (C) Glasbehälter verwendet , um die Proben vor Feuchtigkeit und Staub geschützt zu halten. An der Basis ist ein Fach für Silicagel. (D) Kritischer Punkt Trockner. In der Front befinden sich (von links nach rechts) das Manometer, den Netzschalter, der Temperaturregelung und der Temperaturanzeige. Übliche Arbeitsdruck für CO 2 ethanol Austausch ist 60 bar (800 psi). In der Spitze gibt es vier Ventile (Einlass, abtropfen lassen, Lüftungs- und Abgaskontrollen) die zentrale Probenkammer flankieren. Fotos wurden von Y. Ruiz-León und MA Bello genommen. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55031/55031fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55031/55031fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> &lt;<html> p class = &quot;jove_title&quot;&gt; 2. Studium der Cyst Verhalten von Saprolegnia (Oomycetes) auf verschiedenen Oberflächen <ol><li> Wachsende und Fixieren der Zysten <ol><li> Bereiten Sie Pepton und Glucose (PG-l) Medien 41 unter Verwendung von D - (+) - Glucose (6 g) und mykologische Pepton (3 g) *. Fügen Sie bis zu 900 ml Leitungswasser und im Autoklaven 40 min bei 121 ° C. Pour 50 ml der zuvor autoklavierten Lösung A (NaH 2 PO 4, 0,13 M) und 50 ml Lösung B (Na 2 HPO 4, 0,13 M). </li><li> Aus Stammkulturen von Stämmen von Saprolegnia parasitica auf Pepton gehalten, Glucose, Agar - Medien (PGA, die als PG-l hergestellt wird , jedoch unter Zugabe von 10 g der europäischen bakteriologischer Agar auf die Glucose und Pepton vor Autoklav), Myzelien Kolonien in 0,5 ml wachsen von PG-l-Tröpfchen für 24-48 h bei 20 ° C in Petrischalen. Sporulation induziert, indem die Myzelien mit autoklaviertem Leitungswasser dreimal Waschen und Inkubieren sie für 15 h bei 20 ° C= &quot;Xref&quot;&gt; 42, 43. </li><li> Sammeln Sie die freigesetzten sekundären Zoosporen durch sanft den oberen Teil der Suspension pipettiert und bündeln sie in 1-ml-Portionen. Rühre kräftig die Zoosporen für 30 s durch Verwirbelung 44 sekundäre Zysten zu erzeugen. </li><li> Um das Differential Wachstum der Stacheln der Zysten zu testen, auf separaten Petrischalen (p60), legte 0,5 ml der sekundären Zyste Suspension auf verschiedenen Oberflächen (dh Kohlenstoff, Gold und Kupfer TEM Grids, Lachs und Seehecht Fischschuppen (früher gebleicht) und Glasplättchen) *. Inkubieren der Zysten bei 20 ° C für 70 min, das die Befestigung der Zysten an der Oberfläche begünstigt. </li><li> Entfernen Sie die Flüssigkeit und mit 0,5 ml 2% igem Glutaraldehyd zu jeder Oberfläche für die Fixierung der Zysten. Halten Sie die Proben bei Raumtemperatur unter einem Abzug für 1 h. </li><li> Entfernen Sie die Glutaraldehyd und Dehydratisieren der Probe durch eine Ethanolreihe (30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%90%, 100% und 100%), Zugabe von 5 ml jeder Ethanollösung für 15 min. Nachdem in den letzten 100% igen Ethanollösung kann die Probe bis zu einem Monat in einer Schale versiegelt Petri gespeichert. In diesem Stadium sind die Proben bereit, in der CPD getrocknet werden. </li><li> übertragen Sie sorgfältig die Gitter und die Waage aus der Petrischale mit einem Halter geeignet für die CPD (Abschnitt 4). Für diesen Schritt verwenden, um ein CPD Gitterhalter oder eine Stapelprobenhalter, die voneinander getrennten Proben halten. Nehmen Sie die Gitter und Waagen mit einer Pinzette, wenn man bedenkt, dass die Zysten an den Gittern ganze Zeit nach oben zeigen sollte. * </li></ol></li><li> Montage und Vorbereitung Zyste Proben für die SEM - Beobachtung <ol><li> Montieren Sie die Gitter und die Waage auf den Aluminium Stubs, die zuvor mit einem doppelseitigen Klebeband Kohlenstoff bedeckt waren und unter der Bezeichnung. </li><li> Übertragen Sie die Proben mit dem Sputter-Coater (Abschnitt 5). </li><li> Beachten Sie die Proben unter dem SEM (Abschnitt 6). </li></ol></li></ol>Phellorinia herculanea unter SEM <ol><li> Rehydrierung und Dehydratisierung von Sporen <ol><li> Wickeln Sie jede Probe vorsichtig mit Filterpapier, Bildung Bleistift-markierten Umschläge ~ 0,5-1 cm 2, kümmert sich nicht um sie zu vernichten. Dichten Sie das Filterpapier mit Büroklammern. Übertragen Sie die verpackten Proben in eine Petrischale und tauchen sie in 10 ml Wasser Gewebe um die Sporen zu rehydrieren. </li><li> Unmittelbar stecken, die Proben in einer Mikrowelle (600 W für etwa 20 s). Entfernen Sie das Material, sobald das Wasser zu verdampfen beginnt, und lassen Sie es bei Raumtemperatur abkühlen lassen. </li><li> Führen Sie die Proben durch die folgenden Ethanolreihe: 30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100% und 100%. Je nach der Menge der Proben, einem Becher oder Zentrifugenröhrchen für diesen Schritt verwenden. Lassen Sie die Proben für 15 Minuten in jeder Lösung. </li><li> Legen Sie die Proben auf die CPD (Abschnitt 4). </li></ol></li><li> Montage und pSporen für SEM-Beobachtung reparing <ol><li> Öffnen Sie die Umschläge. Gießen die Sporen auf einer zuvor vorbereiteten stub mit doppelseitigem Klebeband. Alternativ sammeln die Sporen mit der klebrigen Oberfläche der Stubs, wobei darauf geachtet, sie nicht * zu vernichten. </li><li> Wenn die Proben wenige Sporen enthalten, zusätzlich zu dem vorherigen Schritt, schneiden Sie ein kleines Stück des Umschlags (~ 1 mm 2) und legen Sie es auf eine neue Stub *. </li><li> Legen Sie das Gewebe in die Sputter-Coater (Abschnitt 5). </li><li> Beachten Sie unter dem SEM (Abschnitt 6). </li></ol></li></ol> 4. Trocknen des Materials Mit einem kritischen Punkt Trockner (CPD, 2d) <ol><li> Verwenden Sie die CPD in einem gut belüfteten Ort und stellen Sie sicher, dass alle Ventile der Maschine geschlossen sind. Überprüfen Sie, ob die Probenkammer leer und sauber ist. </li><li> Maschine einschalten und prüfen, ob die Temperaturregelung Systemtest erfolgt automatisch. Wenn die CPD ein externes Kältebad System hat, überprüfen Sie die Wasserstände, bevor ich Schaltt auf. </li><li> Folgen Sie den Anweisungen des Herstellers der spezifischen CPD für die Verwendung von Ethanol und CO 2 Austausch. Zur Sicherheit tragen zu diesem Schritt unter der Aufsicht von jemandem für den Gebrauch der Maschine geschult. Denken Sie daran, dass es zu einem schnellen Druckänderungen ausgesetzt ist, es heftig blasen konnte. </li><li> Nehmen Sie die Proben aus und fahren Sie mit dem Schritt 1.3, wenn mit Pflanzengewebe arbeitet, 2.2 Schritt, wenn mit Oomyceten Zysten zu arbeiten, und die Schritte 3.2, wenn mit Pilzsporen zu arbeiten. </li></ol> 5. Die Beschichtung der Proben mit Gold Mit dem Sputter Coater (Abbildung 3a) <ol><li> Überprüfen Sie die Sputter-Beschichtungsvorrichtung. Stellen Sie sicher, dass die Gold-Kathode Ziel in einem guten Zustand ist. Verwenden Sie ein fusselfreies Tuch mit 90% Ethanol getränkt, die Wände der Vakuumkammer zu reinigen und die Kammerdeckel, falls erforderlich. </li><li> Markieren Sie die Sputter-Halter mit Nummern neben jeder Stichloch zur weiteren Identifizierung der Proben unter dem Mikroskop. Vorsichtig setzen die Stubs mit dem sampl geladenes und sichern. Verwenden Sie einen Drehplanetenprobentisch eine gleichmäßige Beschichtung an Proben mit unregelmäßigen Oberflächen zu gewährleisten. </li><li> Folgen Sie den Anweisungen des Herstellers , um Einstellungen wie der Arbeitsabstand, den Betrieb Gasdruck (zB 5 x 10 -1 - 7 x 10 -1 mbar) (zB 30 mm.), Die Sputter - Zeit (zB 50 s), Dicke der Goldschicht (zB 12 nm) der Strom (beispielsweise 15 mA) und der Spannungsversorgung (beispielsweise 600 V) 45. </li><li> Entfernen Sie die Stubs und nehmen sie in den SEM (Abschnitt 6). Sie können auch den Stummel in einem verschlossenen Behälter mit Kieselgel (Abbildung 2c). </li></ol><img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/55031/55031fig3.jpg" /> Abbildung 3: Sputter - Beschichtungsvorrichtung (a) und Rasterelektronenmikroskop (b). (A) Vorderansicht der Vakuumkammer (links), Gas valve, Timer, Vakuum und aktuelle Kontrollen. (B) Seitenansicht der Hauptkomponenten SEM (von links nach rechts): die Vakuumkolonne mit der Probenkammer, dem Computerbildschirm mit den Kontrollen, und die Monitorkammer. Fotos wurden von Y. Ruiz-León genommen. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55031/55031fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55031/55031fig3large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> 6. Die Beobachtung unter dem Rasterelektronenmikroskop (REM, 3b) <ol><li> SEM starten <ol><li> Folgen Sie den Anweisungen des Herstellers zu starten und die SEM einstellen, werden die Probenhöhe die Objektivöffnung Durchmesser Einstellung (zB für Pflanzen 2 &amp; mgr; m und für Pilze und Oomyceten 4 um), die Betriebsspannung (zB 15 kV). </li><li> Überprüfen Sie die korrekte Ausrichtung des Elektronenstrahlsystems und stellen die axiale Ausrichtung und die Stigmatoren gemäß den Herstellerangaben. Passen ter Arbeitsabstand, um eine ausreichende Tiefenschärfe zu erhalten. </li></ol></li><li> Bilderfassung <ol><li> Holen Sie sich ein scharfes Bild der Probe und verwenden Sie es als Ausgangspunkt. Erhöhen Sie die Vergrößerung der Nähe der Maximalpegel und konzentrieren sich wieder auf das Bild. Wählen Flächen mit Oberflächenunregelmßigkeiten wie Löcher. Richtig Astigmatismus und stellen Sie den optimalen Kontrast und Helligkeit. </li><li> Nehmen Sie das SEM-Bild mit dem hochauflösenden. Verwenden Sie den BSE-Detektor, wenn das Bild zeigt, dass die Proben geladen sind. Andernfalls stellen Sie den SE-Detektor. Ändern Sie die Detektoren den Anweisungen des Herstellers folgen. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

In Bezug auf die Standard-SEM-Protokolle, präsentiert die Verfahren hier sind relativ schnell, einfach zu folgen, und Low-Cost-Methoden. Je nach der Menge der Proben und auf die Leichtigkeit der Verarbeitung, dauert es vier bis fünf Tage, um Bilder von guter Qualität erhalten. Einschließlich einer angemessenen Sicherheitsvorkehrungen für die CPD und SEM-Betrieb sind die Verfahren einfach zu handhaben. Besondere Vorsicht ist mit Formalin und Glutaraldehyd (siehe Schritte 1.1.1 bis 1.1.3 und 2.1.5 des Protokolls) entnomme...

In der Biologie ist die Verwendung von Rasterelektronenmikroskopie (SEM) Untersuchungen von Strukturentwicklung erweitert, vergleichende Morphologie, Organentwicklung und Charakterisierung von Populationen oder 1 - Arten. Mit seiner zweidimensionalen Ansicht von mikroskopischen Strukturen, Bereiche wie Mikromorphologie und Systematik profitierte von SEM - Technik Fortschritte seit der zweiten Hälfte des 20. Jahrhunderts. Beispielsweise hat die Einführung der Sputter - Beschichtungsmethode in den 1970er Jahren möglich , Beobachtungen von empfindlichen Materialien wie Spross Scheiteln und Blüten der Abbildungs aus nichtleitendem Geweben verbessern 2, 3. SEM verwendet von der Oberfläche der Probe emittierten Elektronen , die Topographie in einer Hochvakuumumgebung 4 zu reproduzieren. Studien SEM werden, die sowohl in der Ableitung von Struktur Zeichen konzentriert und den Wiederaufbau von growth Prozesse. Neue strukturelle Zeichen relevant für die Taxonomie und Systematik von einem breiten Spektrum von Organismen wurden aus SEM Beobachtungen entdeckt. Zum Beispiel Pflanzeneigenschaften für Arten , Diagnose oder supraspecific Klassifikationen, wie die Verzierte Tüpfel aus Holz 5, Stigma Vielfalt 6, nectary und floralen Morphologie 7, 8, trichome Details 9 und Pollenkörner 10 werden richtig sichtbar, 11, kann nicht verwendet werden , ohne SEM. Erfolgreiche Beobachtungen mit konventionellen SEM wurden für Langzeit Formalin fixierten Organismen 12 und Anlage Herbarbelege 13 auch erreicht. Auf der anderen Seite, Studium der Rekonstruktion von Wachstumsprozessen REM umfassen ein breites Spektrum von Themen wie Organentwicklung 14, infections induziert durch Bakterien 15, Pflanzenwurzel Physiologie 16, Parasit-Wirt - Befestigungsmechanismen 17, 18, Arzneimittelwirkungen auf Parasiten 19, Mycoparasitismus und antibiotische 20, 21, Wachstum Malformation 22, vergleichende Entwicklung von wild und mutierten Individuen 23 und gesamten Lebenszyklus 24. Obwohl Umwelt Rasterelektronenmikroskope (ESEM) 25 wichtige Vorteile für die Beobachtung von nassen biologischen Proben in Wachstumsprozesse haben können, können empfindliche Material noch einmal in dem Niedervakuumzustand des ESEM) beeinträchtigt werden, und muss ausreichend Verlust zu vermeiden verarbeitet werden von wertvollen morphologischen Beobachtung. In diesem Papier, eine Überprüfung der spezifischen Protokolle für die SEM-Beobachtung von drei diffErent Probentypen vorgestellt: Blumen Meristeme, Oomyceten (Saprolegnia) und Pilzmaterial. Diese Protokolle kompilieren die Erfahrung unserer bisherigen SEM-basierten Studien 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, in denen besondere Schwierigkeiten und alternative Lösungen gefunden. Im Falle von Pflanzenvergleichs Entwicklungs- und Strukturstudien begann die Verwendung von SEM in den 1970er Jahren 34, 35, und seitdem entdeckten Forscher , dass bestimmte Blumen Merkmale labiler sind als bisher 36 gedacht. Die Rekonstruktion der Blütenentwicklung beinhaltet die Erfassung aller Stufen zwischen jungen Blumen Meristeme und anthesis. Um dieses Ziel zu erreichen, ist es Essential dass die Probentopographie und der Zellwandintegrität werden nach der Fixierung und nachfolgende Dehydratisierung nicht beeinträchtigt wird. Junge Blumen Meristeme sind besonders anfällig für Zellwand Zusammenbruch (1a, 1b). In ähnlicher Weise empfindliche Strukturen wie Nektarien, Blütenblätter, Stigmata und Sporangien erfordern effektive und undamaging Protokolle. Diese Übersicht fasst ein optimales Protokoll junge und empfindliche Gewebe intakt für SEM-Bildgebung zu halten. Im Falle der Oomyceten (Stramenopiles) -on der vielfältigsten und weit verbreiteten Gruppen von Parasiten, die mit den Hosts von Mikroben und Pflanzen zu wirbellosen Tieren und Wirbeltieren im Bereich 37 - gibt es Sporen, die in einer feuchten Umgebung wachsen und sich entwickeln. Diese Bedingung stellt eine Herausforderung für SEM-Beobachtung, da die Sporen ein ausreichendes Substrat nicht geeignet für Standard-SEM-Protokolle benötigen. Unter den Oomyceten - Arten Saprolegnia sind von besonderem Interesse , weil sie caverursachen n erheblichen Kürzung der Aquakultur, Fischerei und Amphibienpopulationen 38. Mikromorphologische Eigenschaften, wie die Hakenstacheln von Zysten, haben sich als nützlich erwiesen Arten von Saprolegnia zu identifizieren, die von grundlegender Bedeutung ist , um Infektionskontrollen und mögliche Behandlungen 39 herzustellen. Hier gibt es ein Versuchsprotokoll, um die Muster der Wirbelsäule Wachstum von Zysten auf verschiedenen Substraten zu vergleichen und die Probe für die kritischen Punkt Trockner (CPD) Herstellung und anschließende SEM Beobachtung zu manipulieren. In einem dritten Fall gibt es interessante Erkenntnisse , die nach einer Inspektion der Sporen der Pilze Phellorinia herculanea f kam. stellata f. nova (Agaricales) 31. Zusammen mit den Sporen, wurde eine Gruppe von unerwarteten nursery Zellen unter dem SEM identifiziert. Bei früheren traditionellen Protokollen und unbehandeltem Material, kamen die Nährzellen out vollständig zusammengebrochen (Abbildung 1c). Weitere Rückschlüsse insbesondere auf die Sporen dazugehörigen Gewebe kann mit den einfachen , aber entscheidenden Änderungen an den Standardansätze hier (Abbildung 1d) beschrieben , hergestellt werden. In dieser Bewertung gibt es detaillierte SEM-Protokolle, die mit unterschiedlichen Problemen verwendet werden können, mit SEM-Betrachtung bei Angiospermen, Oomyceten und Agaricales, wie Zellkollaps und Meristemgewebe Schrumpfung, nicht das optimale Wachstum von Zysten Stacheln und Zerstörung fertig zu werden ephemeren Gewebe, respectively. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/55031/55031fig1.jpg" /> Abbildung 1: Vergleich von Proben behandelt , ohne (a, c) und mit (b, d) das Protokoll FAA-Ethanol-CPD. (A - b) Blumenknospen von Keulen-Bertram, Mid-Entwicklung. Bud mit Osmiumtetroxid behandelt 46 &lt;/ sup&gt; (a) und Knospe mit der FAA-CPD - Protokoll (b) behandelt. (C - d) Krankenschwester Zellen mit Sporen von Phellorinia herculanea f. stellata. Getrocknete Proben ohne Behandlung (c) und mit dem Protokoll hier für Agaricales beschrieben (d). Spores in Orange. Waage: (ab) 100 &amp; mgr; m (cd) 50 &amp; mgr; m. Fotos wurden von Y. Ruiz-León genommen. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55031/55031fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55031/55031fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

<table><tbody><tr><td>Essigsäure</td><td>Kein spezifischer Lieferant</td><td></td><td>Hautreizungen, Augenreizungen</td></tr><tr><td>Aluminiumstummel</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>16221</td><td>www.tedpella.com</td></tr><tr><td>Zentrifugenröhrchen</td><td>Kein spezifischer Lieferant</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Critical Point Dryer</td><td>Polaron Quatum Technologies</td><td>CPD7501</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose</td><td>Merck</td><td>1.083.421.000</td><td></td></tr><tr><td>Doppelseitiges Klebeband</td><td>Kein spezifischer Lieferant</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ethanol absolut</td><td>Kein spezifischer Lieferant</td><td></td><td>Entzündlicher</td></tr><tr><td>europäischer bakteriologischer Agar</td><td>Conda</td><td>1800.00</td><td>www.condalab.com</td></tr><tr><td>Filterpapier</td><td>Kein spezifischer Lieferant</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pinzetten</td><td>Kein spezifischer Lieferant</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Formalin 4%</td><td>Kein spezifischer Lieferant</td><td></td><td>Gesundheitsschädlich, akute Toxizität, Hautsensibilisierung, Karzinogenität. </td></tr><tr><td>Abdeckgläser aus brennbarem Glas</td><td>Kein spezifischer Lieferant</td><td></td><td></td></tr><tr><td>hermetischer Glasbehälter</td><td>Kein spezifischer Lieferant</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehyd 25% DC 253857.1611&nbsp; (L)</td><td>Dismadel S.L.</td><td>3336</td><td>www.dismadel.com</td></tr><tr><td>Mykologisches Pepton</td><td>Conda</td><td>1922.00</td><td>www.condalab.com</td></tr><tr><td>Nadeln</td><td>Kein spezifischer Lieferant</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Petrischalen</td><td>Kein bestimmter Lieferant</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kunststoffbehälter</td><td>Kein bestimmter Lieferant</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Probenhalter mit Deckel für den Trockner an der kritischen Stelle&nbsp;</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>4591</td><td>www.tedpella.com</td></tr><tr><td>Skalpelle</td><td>Kein spezifischer Lieferant</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rasterelektronenmikroskop</td><td>Hitachi</td><td>S3000N</td><td></td></tr><tr><td>Software für REM</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lösung A: NaH2PO4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lösung B: Na2HPO4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Probenhalter</td><td>Kein spezifischer Lieferant</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sputter-Coater</td><td>Balzers</td><td>SCD 004</td><td></td></tr><tr><td>Stereomikroskop</td><td>Kein spezifischer Lieferant</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Transmissionselektronenmikroskop (TEM) Gitter</td><td>Elektronenmikroskopie</td><td>Wissenschaften G200 (Quadratmasche)</td><td>www.emsdiassum.com</td></tr><tr><td>Pinzette</td><td>Kein spezifischer Lieferant</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

rasterelektronenmikroskopie (sem) protokolle für problematische pflanze, oomycete und pilzproben

Scanning Electron Microscopy (SEM) Protocols for Problematic Plant, Oomycete, and Fungal Samples

Häufige Probleme bei der Verarbeitung von biologischen Proben für Beobachtungen mit dem Rasterelektronenmikroskop (SEM) umfassen Zellkollaps, Behandlung von Proben aus nassen Mikroumgebungen und Zellzerstörung. Mit jungen Blütengewebe, oomycete Zysten und Pilzsporen (Agaricales) als Beispiele spezielle Protokolle empfindliche Proben zu verarbeiten hier beschrieben werden, die einige der wichtigsten Herausforderungen in der Probenbehandlung für die Bilderfassung unter dem SEM überwinden. Floral meristems mit FAA fixiert (Formalin-Acetic-Alkohol) und mit dem kritischen Punkt Dryer (CPD) verarbeitet nicht Zellwände oder verzerrt Organe kollabiert Display. Diese Ergebnisse sind von entscheidender Bedeutung für die Rekonstruktion der Blütenentwicklung. Eine ähnliche CPD-basierte Behandlung von Proben aus nassen Mikroumgebungen, wie beispielsweise die mit Glutaraldehyd fixierten Oomyceten Zysten ist optimal die differentielle Wachstum von diagnostischen Eigenschaften zu testen (beispielsweise die Zyste Stacheln) auf verschiedenen Arten von substrates. Die Zerstörung der Nährzellen an Pilzsporen wurde nach Rehydrierung vermieden, Dehydrierung und der CPD-Behandlung, ein wichtiger Schritt für die weitere funktionelle Studien dieser Zellen. Die Protokolle detailliert hier repräsentieren preiswerte und schnelle Alternativen für den Erwerb von qualitativ gute Bilder Wachstumsprozesse zu rekonstruieren und diagnostischen Eigenschaften zu studieren.

Floral Entwicklung und Fixierung der Entwicklung und Voll baulichen Anlagen Formed Mit dem FAA-CPD-Protokoll hier beschrieben, junge und reife Pflanzengewebe optimal fixiert und dehydriert für SEM-Bildgebung. Prozesse wie Blütenentwicklung kann rekonstruiert werden , weil die Topographie und die Form der Knospen nicht durch Zellschrumpfungs (Figuren 1b, 1d, 4a-f) verzerrt. Strukturen mit komplizierten Formen kön...

Probleme bei der Verarbeitung biologischer Proben für die Rasterelektronenmikroskopie umfassen Zellkollaps, Behandlung von Proben aus feuchten Mikroumgebungen und Zellzerstörung. Kostengünstige und relativ schnelle Protokolle, die sich für die Vorbereitung anspruchsvoller Proben wie Blütenmeristeme, Oomycetenzysten und Pilze (Agaricales) eignen, werden hier zusammengestellt und detailliert beschrieben.

Rasterelektronenmikroskopie (SEM) Protokolle für Problematische Pflanze, Oomycete und Pilzproben

Common problems in the processing of biological samples for observations with the scanning electron microscope (SEM) include cell collapse, treatment of ...

Das Ziel dieser Methodik ist es, empfindliche Gewebe von Pflanzen, Oomyceten und Pilzen für ihre optimale Betrachtung unter einem Rasterelektronenmikroskop (REM) zu handhaben. Diese Methode kann uns helfen, Fragen zu praktisch allen Pilzen, Mikroben und Krankheiten zu beantworten und wie sie ihren Wirt infizieren, besiedeln und sich an ihn anheften. Die Technik in unserer verbesserten Methodik dient zur Fixierung von Proben, für die die mi-toh-mins in aquatischen Ökosystemen.Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie es uns ermöglicht, Schlüsselaspekte der Infektion mit teuren und leicht verfügbaren Mitteln zu visualisieren. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die Schritte gegenüber herkömmlichen Protokollen stark modifiziert wurden. Und veröffentlichte Methoden beschreiben allgemeine Vorgehensweisen ohne Details.Bereiten Sie zunächst das Formol und den Essigalkohol oder das FAA-Fixiermittel in einem Abzug vor, der mit einem Aldehydfilter ausgestattet ist. Bei 85 Teilen 70 % denaturiertem Ethanol, 10 Teilen 60 % Formaldehydlösung und fünf Teilen Eisessig. Gießen Sie unter dem Abzug den Vorrat an FAA in einzelne Behälter.Wählen Sie die zu fixierenden Blüten- oder vegetativen Meristeme aus und stellen Sie sicher, dass sie nicht durch Insekten, Pilze oder extreme Wetterbedingungen beschädigt werden. Schneiden Sie die Äste ab, entfernen Sie unerwünschtes Material und legen Sie die Probe sofort in die FAA-Lösung. Gießen Sie das FAA nach 72 bis 96 Stunden zur Chemikalienentsorgung in einen Plastikbehälter.Waschen Sie die Proben sofort dreimal mit frischem 70%igem Ethanol, um alle FAA-Rückstände zu entfernen. Fixiertes Material kann unbegrenzt in 70%igem Ethanol gelagert werden. Präparieren Sie die Proben in eine mit Ethanol bedeckte Petrischale, um ein Austrocknen des Gewebes zu verhindern.Verwenden Sie eine Petrischale, deren Boden mit einem trockenen, schwarzen Silikon bedeckt ist, um das kontrastierende weiße Gewebe besser sehen zu können. Füllen Sie das Gewebe in separate Behälter und tauchen Sie diese dann in eine Petrischale mit 70% Ethanol. Setzen Sie die Deckel auf die Behälter und legen Sie sie in ein Zentrifugenröhrchen aus Kunststoff mit reichlich 70% Ethanol.Übertragen Sie das präparierte Material durch eine Ethanolserie in hermetische Gläser oder Zentrifugenröhrchen. Lassen Sie die Proben mindestens eine Stunde lang in jeder Lösung. Bewahren Sie die Proben dann über Nacht in einer 100%igen Ethanollösung auf.Nach der Ethanol-Serie übergeben Sie die Behälter mit dem Material an den CPD und schreiben die Probenidentifikationsnummer unter die REM-Probenhalter. Decken Sie dann die Oberseite der Stummel mit doppelseitigem Klebeband ab.Legen Sie die Stummel in einen Probenhalter. Öffnen Sie unter einem Stereomikroskop vorsichtig die Behälter mit den jungen und empfindlichen Proben, die bereits im CPD getrocknet sind. Beachten Sie, dass die Proben nach der CPD-Behandlung leichter und empfindlicher gegenüber Elektrostatik werden.Verschließen Sie die Behälter, sobald die Proben entnommen wurden, um Staub oder Verunreinigungen zu vermeiden. Legen Sie die Proben auf die klebrige Oberfläche der Stummel und planen Sie im Voraus für die gewünschte Position. Sobald die Proben die Oberfläche berühren, ist es sehr schwierig, sie zu entfernen.Versuchen Sie an dieser Stelle nicht, eine größere Sektion durchzuführen. Entfernen Sie einfach das unerwünschte Gewebe, das leicht aufzunehmen ist. Für palynologische Studien zerlegen Sie die Staubbeutel und öffnen sie, um den Pollen auf den Stummeln freizulegen.Bewahren Sie die Proben über Nacht in einem hermetischen Behälter mit Kieselgel auf, um eine erneute Austrocknung zu vermeiden. Beschichten Sie die Proben mit dem Spotter-Coater und überführen Sie sie auf das REM, wie im Textprotokoll beschrieben. Um das differentielle Wachstum der Stacheln der Zysten auf separaten Petrischalen zu testen, geben Sie 0,5 Milliliter der sekundären Zystensuspension auf verschiedene Oberflächen.Zu den Oberflächen können Transmissionselektronenmikroskopiegitter aus Kohlenstoff, Gold und Kupfer gehören. Früher wurden gebleichte Lachs- und Seehechtschuppen sowie Glasabdeckfolien verwendet. Inkubieren Sie die Zysten 70 Minuten lang bei 20 Grad Celsius, was die Anheftung der Zysten an die Oberfläche begünstigt.Entfernen Sie die Flüssigkeit und geben Sie 0,5 Milliliter 2%iges Glutaraldehyd auf jede Oberfläche für die Fixierung der Zysten. Bewahren Sie die Proben eine Stunde lang bei Raumtemperatur unter einem Abzug auf. Entfernen Sie das Glutaraldehyd und dehydrieren Sie die Proben durch eine Ethanolreihe, indem Sie 15 Minuten lang fünf Milliliter jeder der Ethanollösungen hinzufügen.Sobald sich die Probe in der letzten 100%igen Ethanollösung befindet, kann sie bis zu einem Monat in einer verschlossenen Petrischale gelagert werden. Übertragen Sie die Gitter und die Skalen vorsichtig aus der Petrischale in einen für die CPD geeigneten Halter, der die Proben voneinander trennt, z. B. einen CPD-Gitterhalter oder einen Stapelprobenhalter. Nehmen Sie das Gitter und die Schuppen mit einer Pinzette und denken Sie daran, dass die Zysten immer nach oben auf den Gittern liegen sollten.Fahren Sie mit dem Trocknen des Materials mit dem CPD fort, bevor Sie die REM-Probenvorbereitung der Eizellen durchführen, um ihr Verhalten auf verschiedenen Oberflächen zu beobachten, wie im Textprotokoll beschrieben. Wickeln Sie jede Probe vorsichtig mit Filterpapier ein und bilden Sie etwa 0,5 bis einen Quadratzentimeter große, mit Bleistift beschriftete Umschläge. Achten Sie darauf, die Proben nicht zu zerdrücken.Verschließen Sie das Filterpapier mit Büroklammern. Übertragen Sie dann die verpackten Proben in eine Petrischale und tauchen Sie sie in 10 Milliliter Wasser, um das Gewebe um die Sporen herum zu rehydrieren. Legen Sie die Proben sofort in die Mikrowelle.Entferne das Material, sobald das Wasser zu verdunsten beginnt, und lass es bei Raumtemperatur abkühlen. Anschließend wird die Probe durch eine Ethanolreihe geleitet. Verwenden Sie für diesen Schritt je nach Probenmenge ein Becherglas oder ein Zentrifugenröhrchen.Lassen Sie die Proben 15 Minuten lang in jeder Lösung. Legen Sie anschließend die Proben in die CPD, wie im Textprotokoll beschrieben. Um die Sporen für die REM-Betrachtung zu mounten, öffnen Sie die Umschläge.Sammeln Sie dann die Sporen mit der klebrigen Oberfläche der Stummel und achten Sie darauf, sie nicht zu zerquetschen. Führen Sie abschließend eine Goldbeschichtung der Proben und eine REM-Betrachtung durch, wie im Textprotokoll beschrieben. Hier sind blumige Knospen von Anacyclus clavatus zu sehen, die mit Osmiumtetroxid behandelt und unter Verwendung des FAA CPD-Protokolls hergestellt wurden, das in diesem Video gezeigt wird.Gezeigt werden auch getrocknete Proben von Phellorinia herculanea ohne jegliche Behandlung, sowie Pilzsporen, die behandelt wurden, wie in diesem Video gezeigt. Diese Abbildung zeigt die frühe, mittlere und späte Blütenentwicklung, die unter dem REM erfasst wurde. Dieses Bild zeigt die Draufsicht eines jungen Reh-cim.Hier ist eine blumige Knospe während der Gynesium-Differenzierung und eine Blüte an der Anthese zu sehen. Einige Strukturen können schwierig zu fixieren und für die Bildgebung unter dem REM zu konservieren sein. Beispiele hierfür sind solche, die aus feuchten Umgebungen stammen, sowie solche mit Ornamenten und solche mit Indumenta.Hier sind unterschiedliche Wachstumsmuster der Stacheln von Saprolegnia parasitica auf Glas-, Kohlenstoff-, Kupfer-, Gold-, Seehechtschuppen und Lachsschuppen dargestellt. Dies ist ein Video, das den asexuellen Lebenszyklus von Saprolegnia parasitica zeigt. Der asexuelle Lebenszyklus ist wichtig für die Ausbreitung dieser Organismen in ihren aquatischen oder feuchten Umgebungen.Darüber hinaus stellen Zoo-Spoors, die in diesem Stadium produziert werden, die primäre Infektionseinheit bei parasitären Arten der Ordnung saprolegniales dar. Obwohl die Beherrschung dieser Technik in drei bis fünf Tagen durchgeführt werden kann, wird sie ordnungsgemäß ausgeführt. Wir haben Geld verwendet, um die SEM-Therapien zu vervollständigen, die in diesem Zeitraum im Königlichen Botanischen Garten in Madrid zur externen Anwendung bereitgestellt werden.Nach dem Anschauen dieses Videos wissen die Forscher, wie sie empfindliches biologisches Material für die REM-Beobachtung effektiv sammeln und fixieren können. Die Zerstörung von Zellen, Organverzerrungen oder die schlechte Konservierung von Proben aus feuchten Umgebungen können mit diesem Verfahren leicht überwunden werden. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass die Betrachtung durch REM auf die Untersuchung von Oberflächen mit hoher Vergrößerung beschränkt ist.Auch vor der CPD-Behandlung müssen die Dichtungen vor schockartigen Veränderungen und direktem Kontakt mit der Luft geschützt werden. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Phytologie, um die Sporenstruktur während des Infektionsprozesses zu erforschen, insbesondere bei Arten, die für die Fischerei von Interesse sind. Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden wie Transmissionsmikroskopie oder TM durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, z. B. wie die innere Struktur der Zellzusammensetzung in einem bestimmten Organ oder einer bestimmten Zelle oder in Pollen aussieht.Vergessen Sie nicht, dass die Handhabung von Formalin und Glutaraldehyd äußerst gefährlich sein kann, und Vorsichtsmaßnahmen wie das Arbeiten unter einem Abzug und die Verwendung von Masken, Laborkitteln und Handschuhen sollten bei der Durchführung dieses Verfahrens immer getroffen werden.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dieses Protokoll beschreibt ein neues Verfahren zu wachsen und qualitativ bakteriellen Biofilmen auf Pilzhyphen durch konfokale und Elektronenmikroskopie analysiert.

Eine neue Methode zur qualitativen Mehrskalige Analyse von bakteriellen Biofilmen auf filamentösen Pilzkolonien mittels konfokaler und Elektronenmikroskopie

SEM-Analyse ist eine effektive Methode um Speziesidentifizierung oder phänotypischen Diskriminierung zu unterstützen. Dieses Protokoll beschreibt die Methoden zur Untersuchung der morphologischer Besonderheiten der drei repräsentative Arten von Organismen und zur Untersuchung der Eigenschaften von vielen organismal breit anwendbar wäre und Gewebetypen.

Vorbereitung der prokaryotischen und eukaryotischen Organismen mit chemischen Trocknung für die morphologische Analyse in Rasterelektronenmikroskopie (SEM)

Hier stellen wir Ihnen ein Protokoll für die Kombination von zwei Probe-Verarbeitungstechniken, Hochdruck, Einfrieren und Mikrowellen-gestützte Probenverarbeitung, gefolgt von minimal Harz für die Datenerfassung mit fokussierten Ion Beam Rasterelektronenmikroskop (FIB-SEM) einbetten. Dies wird gezeigt, mit einer Maus tibiale Nerven Probe und Caenorhabditis Elegans.

Biologische Probenvorbereitung durch Hochdruck gefrieren, Mikrowellen-gestützte Kontrastverstärkung und minimale Harz einbetten für Volume Imaging

Zur Beobachtung der Ultrastruktur von Insektensensilla wurden in der Studie Raster- und Transmissionselektronenmikroskopie (SEM bzw. TEM) zur Probenvorbereitung vorgestellt. Tween 20 wurde in das Fixativ aufgenommen, um Probenverformungen in SEM zu vermeiden. Fluoreszenzmikroskopie war hilfreich, um die Schnittgenauigkeit in TEM zu verbessern.

Probenvorbereitungsmethode des Raster- und Transmissionselektronenmikroskops für die Anhänge von Woodboring Beetle

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur effizienten Kombination von serieller Blockfläche und fokussierter Ionenstrahlelektronenmikroskopie für einen Interessenbereich. Dies ermöglicht eine effiziente Suche in drei Dimensionen und das Auffinden seltener Ereignisse in einem großen Sichtfeld.

Gezielte Studien mit serial Block Face und Focused Ion Beam Scan Electron Microscopy

Hier stellen wir detaillierte Verarbeitungsprotokolle für die Abbildung empfindlicher Gewebeproben mittels Rasterelektronenmikroskopie (SEM) vor. Drei verschiedene Verarbeitungsmethoden, nämlich Hexamethyl disilazana (HMDS) chemische Trocknung, einfache Lufttrocknung und kritische Punkttrocknung werden für die Herstellung von starren Eierschalen, Embryonen in frühen Entwicklungsstadien und Pilzkulturen beschrieben.

Verarbeitung von Embryo-, Eierschalen- und Pilzkultur für die Rasterelektronenmikroskopie

Die Mikro-CT ist ein zerstörungsfreies Werkzeug, mit dem Pflanzenstrukturen dreidimensional analysiert werden können. Das vorliegende Protokoll beschreibt die Probenvorbereitung zur Nutzung von Mikro-CT zur Analyse der parasitären Pflanzenstruktur und -funktion. Verschiedene Spezies werden verwendet, um die Vorteile dieser Methode in Verbindung mit spezifischen Präparaten hervorzuheben.

Nutzung von Mikro-CT-Scans zur Analyse parasitärer Pflanzen-Wirt-Interaktionen

Dieses Protokoll zielt darauf ab, detaillierte Verfahren zum Sammeln, Fixieren und Pflegen mykoheterotropher Pflanzenproben bereitzustellen, wobei verschiedene Mikroskopietechniken wie Raster- und Transmissionselektronenmikroskopie, Licht-, Konfokal- und Fluoreszenzmikroskopie angewendet werden, um die Pilzbesiedlung in Pflanzengeweben und Samen zu untersuchen, die mit Mykorrhizapilzen gekeimt sind.

Mikroskopische Techniken zur Interpretation der Pilzbesiedlung in mykoheterotrophen Pflanzengeweben und der symbiotischen Keimung von Samen

Wir schlagen ein optimiertes Rasterelektronenmikroskopie-Protokoll vor, um sehr heterogene und empfindliche Proben zu visualisieren, die pflanzliche und pilzliche Biomasse zusammen mit Mikrobiota und Biofilm enthalten. Dieses Protokoll ermöglicht es, die räumlichen Dimensionen der Mikrobiota-Organisation zu beschreiben.

Mikrobiota von Attinanameisengärten: Visualisierung einer mikrobiellen Landschaft mit Hilfe der Rasterelektronenmikroskopie

Es ist eine Herausforderung, qualitativ hochwertige Transmissionselektronenmikroskopie-Bilder zu erhalten, insbesondere im Fall von Pflanzenzellen, die reichlich große wassergefüllte Vakuolen und belüftete Räume haben. Das Tandem-Hochdruckgefrieren und die Schnellgefriersubstitution verkürzen die Vorbereitungszeit von Pflanzenproben für die TEM erheblich und erzeugen gleichzeitig Proben mit hervorragender ultrastruktureller Konservierung.

Tandem-Hochdruck-Schnell Einfrieren und Gefriersubstitution von Pflanzengeweben für die Transmissionselektronenmikroskopie

Lernen Sie optimierte Präparationsprotokolle für Rasterelektronenmikroskopie empfindlicher Pflanzen-, Oomyceten- und Pilzproben. Diese Methode ermöglicht verbesserte Visualisierung von Infektionsprozessen.

Rasterelektronenmikroskopie (SEM) Protokolle für Problematische Pflanze, Oomycete und Pilzproben

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