C. elegans Tracking und Behavioral Measurement

Phänotypisierung. Die Lokomotion von *C. elegans* ist ein wichtiges Werkzeug für die Identifizierung von Genen und Neuronen, die an dem Verhalten von *C. elegans* beteiligt sind. *C. elegans* zeigt stereotypische Bewegungsmuster wie Vorwärts- und Rückwärtsbewegungen sowie verschiedene Arten von Kurven, indem es seine Körperform verändert. Um diese Bewegungen über weite Strecken und mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung zu quantifizieren, haben wir einen Wurmspurenverfolger entwickelt, der die Bewegung von *C. elegans* erfasst, während er auf der Oberfläche einer Agarplatte kriecht.

Wir haben außerdem Software entwickelt, um diese Bewegungen mithilfe benutzerdefinierter Programme, die in LabVIEW und MATLAB geschrieben wurden, quantitativ zu isolieren und zu analysieren. Eine Herausforderung aller Videosysteme zur Bewegungsverfolgung besteht darin, dass sie eine enorme Menge an hochdimensionalen Daten erzeugen. Unser Bildverarbeitungs- und Datenanalyseprogramm begegnet dieser Herausforderung, indem es die Wurmgrößen in eine Reihe unabhängiger Komponenten reduziert; wir haben das Wurmverhalten umfassend als Funktion von lediglich drei bis vier Dimensionen rekonstruiert.

Eine Agarplatte wird von einer Faser-Lichtquelle beleuchtet und mit einer Kamera abgebildet. Dieses System ist auf einer XY-Translationsstufe montiert. Die Stufe wird durch handelsübliche Schrittmotoren bewegt, die mit einem Schrittmotorenregler verbunden sind.

Die Steuerungseinheit und die Kamera sind mit dem Computer verbunden und werden über benutzerdefinierte Programme gesteuert, die in LabVIEW geschrieben wurden. Die Kamera erfasst die Oberfläche einer Agarplatte und identifiziert dunkle Objekte vor hellem Hintergrund. Eine Kalibrierungsmarke für den automatischen Kalibrierungsprozess wird erstellt, indem die Agaroberfläche angebohrt wird.

Mit einem Wurmpick wird die Bildqualität so eingestellt, dass das Computerprogramm Objekte in Echtzeit quantifizieren kann. Der Gain, die Helligkeit und die Verschlussgeschwindigkeit der Kamera können angepasst werden, um ein dunkles Objekt auf weißem Hintergrund darzustellen. Das gefilterte binäre Bild, das vom Trackingsprogramm verwendet wird, kann überprüft werden.

Die Software verfügt über eine automatische Kalibrierungsfunktion, die die Kalibrierungsmatrix berechnet, indem ein Testobjekt um eine feste Distanz bewegt wird. Die Abstände in Pixeln werden mithilfe der Kalibrierungsmatrix auf die Schritte des Schrittmotors kalibriert.

Nach der Kalibrierung ist das System betriebsbereit und muss nicht erneut kalibriert werden, es sei denn, die Vergrößerung wird geändert oder die Kamera neu positioniert. Ein Kupferring wird verwendet, um die Würmer zusammenzutreiben und daran zu hindern, an den Rand der Platte zu wandern. Erwärmen Sie den Ring zuerst, indem Sie ihn auf einen Wärmesammler oder ein gleichwertiges Gerät legen.

Der Ring sollte ungefähr eine Minute lang erhitzt werden. Legen Sie den Ring auf eine frische Agarplatte und drücken Sie leicht darauf, um ihn in die Agaroberfläche einzubetten. Eine mit NGM-Puffer gefüllte Agarplatte dient dazu, Futterreste von Würmern des L4- und jungen Erwachsenenstadiums zu entfernen.

Nachdem die Würmer in den NGM-Puffer gegeben wurden, lassen Sie sie einige Minuten lang schwimmen. Legen Sie vorsichtig einen der gewaschenen Würmer nahe dem Zentrum des Rings auf die Tracking-Platte. Diese Platte wird später für den Wurm-Tracker verwendet.

Stellen Sie die vorbereitete Platte auf die Wurm-Tracker-Bühne. Führen Sie das Lab-View-Programm aus und wählen Sie gegebenenfalls Optionen wie Speicherort für Bilder, Bildtypen, Messungen und Kameraeinstellungen. Bewegen Sie mithilfe des Joysticks das Mikroskop, bis ein Bild des Wurms im Sichtfeld auf dem Computerbildschirm erscheint.

Dann drücken Sie „Track“, um das Verfolgungsprogramm zu starten. Hier sehen wir einen Wurm, der in Echtzeit verfolgt wird. Das Computerprogramm misst die Bewegungen von binär gefilterten Bildern, wie gezeigt, und kann Messungen an diesem Bild in Echtzeit durchführen.

Nach der Verfolgung kann eine Rekonstruktion der globalen Trajektorie anhand der Bewegungen des Schrittmotors erstellt werden, während die lokalen Formveränderungen des Wurms im Detail sichtbar sind. Würmer bewegen sich durch wellenförmige Bewegungen fort. Wir erfassen diese Bewegungen, indem wir den Wurm zu einer mittigen Zentralkurve vereinfachen und diese Kurve anschließend als eine Reihe von Winkeln beschreiben.

Anschließend zerlegen wir die Skelette in ihre grundlegenden Formen, auch bekannt als Eigenvektoren. Mit diesen Eigenmoden können wir die Wurformen rekonstruieren und die Bewegungen des Wurms quantifizieren. Mithilfe der ersten beiden Modi können wir speziell die Phasenposition des wellenförmigen Bewegungszyklus des Wurms erfassen, wie im zweiten Panel dargestellt.

Das erste Panel zeigt die gemeinsame Verteilung der Modi eins und zwei und verdeutlicht einen kreisförmigen Grenzzyklus. Die Phasenbewegung in eine Richtung entspricht einer Vorwärtsbewegung, und die Phasenbewegung in die entgegengesetzte Richtung entspricht einer Rückwärtsbewegung. Somit entspricht die Phasengeschwindigkeit der Geschwindigkeit des Wurms.

Im Realraum ist die starke Korrelation zwischen Phase und realer Geschwindigkeit im letzten Panel erkennbar. Mithilfe der aus dem Eigenmodus abgeleiteten Phasengeschwindigkeit können wir subtile Details des Bewegungsverhaltens der Würmer aufdecken, die mit bloßem Auge übersehen würden. Beispielsweise zeigt die gemeinsame Verteilung der Phasengeschwindigkeit und der Phase deutlich, dass die Würmer den Vorwärtszustand bevorzugt zu bestimmten Bewegungsphasen verlassen bzw. betreten.

Hier haben wir ein einfach zu bedienendes Verfolgungssystem vorgestellt, das detaillierte Bilder des Verhaltens von Silikon beim Kriechen auf der Oberfläche und auf ACA-Platten aufzeichnet. Die Menge an Informationen, die in diesen Bildern enthalten ist, ist enorm und hochgradig mehrdimensional. Daher haben wir außerdem eine Methode entwickelt, um die Dimensionalität der Daten auf vier grundlegende Maße zu reduzieren. Diese Maße sind im Hinblick auf das Wurmverhalten leicht zu interpretieren.

Diese Arbeit dient der Messung des Verhaltens von Würmern bei geringen Modifikationen, und das System kann außerdem zur Messung neuronaler Aktivität unter Verwendung genetisch codierter und beschichteter Bereiche eingesetzt werden. Das System ist insgesamt flexibel in der Konstruktion und kann mit anderen Kriechsystemen wie Doof-Gesetz, LOEs verwendet werden.