Tracking und Quantifizierung von Entwicklungsprozessen in

Das übergeordnete Ziel der Verwendung von Bildanalyse-Software in der Entwicklungsbiologie besteht darin, quantitative Daten für mechanistische Modelle biologischer Prozesse zu gewinnen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen in der Entwicklungsbiologie zu beantworten, beispielsweise wie mutante Phänotypen quantitativ analysiert werden können. Der Hauptvorteil dieser Methodik liegt darin, dass sie es Forschenden ermöglicht, Veränderungen in biologischen Prozessen und Entwicklungsphänomenen auf eine unvoreingenommene Weise zu identifizieren.

Obwohl diese Methode Einblicke in die Entwicklung und Morphogenese von Sea Elegance ermöglichen kann, ist sie auch auf andere Modellorganismen wie Josepha anwendbar. Die Rekonstruktion der Zellform mit IOD wird Cina Leman, eine Doktorandin in meinem Labor, demonstrieren. Nachdem das IM MOD-Programm installiert wurde, öffnen Sie die Eunuch-Shell und geben im IM MOD-Fenster „Im mod“ ein. Wählen Sie die Datei mit den entsprechenden Rohdaten aus, aus denen ein 3D-Modell generiert werden soll, und nutzen Sie das Informationsfenster, um im Zap-Fenster die Unter- und Oberseite der Objekte zu lokalisieren.

Verfolgen Sie im Informationsfenster erneut die Zellkonturen, indem Sie die erste Kontur in der oberen Ebene jeder Zelle erstellen und darauf achten, für jede Zelle ein neues Objekt anzulegen. Blättern Sie dann in Z-Richtung nach unten und erstellen Sie für jede Z-Ebene eine neue Kontur und anschließend ein neues Objekt für jede Zelle. Nachdem Sie so viele Zellen wie für das Modell geeignet umrissen haben, öffnen Sie das Modellansichtsfenster, um die Objekte und ihre Konturen zu überprüfen.

Danach im Modellansicht-Werkzeugkasten Bearbeiten und Objekte auswählen. Das entsprechende Bearbeitungsfenster öffnet sich, um alle Zellen als gefüllte und geschlossene Objekte zu modellieren. Wählen Sie Mesh als Zeichendatentyp und Füllen als Zeichenstil.

Klicken Sie auf „Meshing“ und aktivieren Sie die Option „Cap“. Aktivieren Sie dann so viele Objekte wie nötig und klicken Sie auf „Mesh“. Das Programm erzeugt daraufhin volumenmodellierte Objekte aus den Konturenstapeln.

Ändern Sie die Z-Skala im Ansichtsfenster, um den Z-Abtastfaktor nach Bedarf anzupassen. Wählen Sie dann im Bearbeiten-Menü die Ansicht, um die 3D-Objekte zu drehen, und speichern Sie bei Bedarf Schnappschüsse oder Filme der Zellen, um Objekte aus fluoreszierenden Zeitrafferaufnahmen nachzuverfolgen. Konvertieren Sie zunächst mit NDR die Rohdaten in eine TIFF-Datei.

Öffnen Sie dann die Datei. Am Ende der Probe. Wählen Sie das Symbol für den 2D-Viewer und klicken Sie im Datenmenü auf das Symbol „Bereich anpassen“, um das Histogramm anzupassen.

Wählen Sie die Datei, den Namen, das Bild, den Satz, den Kanal sowie die X-, Y-, Z-Auflösung aus und geben Sie die Werte für X, Y und Z ein. Um die Kerne zu annotieren, wechseln Sie zur gewünschten Ebene und wählen erneut den 2D-Betrachter. Wählen Sie dann im Dropdown-Menü „Linie“ und anschließend „neue Linie“.

Klicken und ziehen Sie auf den Kern der interessierenden Partikel, um diesen zu markieren. Klicken Sie dann mit der rechten Maustaste auf den Kern und wählen Sie „Partikel umbenennen“. Geben Sie aus dem Dropdown-Menü einen Namen für den Partikel ein und ziehen Sie anschließend das Pfeil-Symbol, um den Durchmesser des Kreises zu ändern.

Klicken Sie anschließend auf das rechte Symbol, um die zentrale Ebene des Zellkerns zu markieren. Um in der Zeit und in der Ebene fortzufahren, wählen Sie die Optionen „Frame“ und „Z“ in der unteren Symbolleiste und passen Sie die Position oder Größe des Kreises, der den Zellkern markiert, entsprechend an, bis die verfolgte Zelle sich teilt. Wenn eine Zellteilung beobachtet wird, markieren Sie die Tochterkerne und klicken Sie auf das Fenstersymbol, um zum Abstammungsverlauf zu wechseln.

Markieren Sie alle drei Kerne gleichzeitig und wählen Sie unter der Linien-Option die zugehörige Elternebene aus. Sobald alle Zellen verfolgt wurden, klicken Sie auf den Dateinamen und wechseln Sie zum Kanal. Markieren Sie den Zellteilungsrest, um mithilfe der Particle-Image-Velocity-Symmetrie-Software einen quantitativen Analyse des kortikalen Flusses durchzuführen.

Laden Sie die neuen Bilddateien in Pif Lab und wählen Sie den Sequenzierungsstil. 1, 2, 2, 3. Navigieren Sie anschließend zum Verzeichnis, das die gewünschte Bildsequenz enthält.

Wählen Sie die Bilder aus und klicken Sie auf „Hinzufügen“, um die Bilder zu importieren. Wählen Sie dann unter Analyseeinstellungen „Ausschlüsse“. ROI-Maske und verwenden Sie die Schaltfläche.

Zeichnen Sie Masken für den aktuellen Frame, um den unerwünschten Teil der Bilder unter den Analyseeinstellungen zu deaktivieren. Wählen Sie erneut die PIF-Einstellungen und stellen Sie als gewünschten PIF-Algorithmus die Deformation mit dem Fenster der schnellen Fourier-Transformation ein. Geben Sie für den ersten Durchgang einen Abtastbereich von 64 Pixeln mit einem Schritt von 32 für den zweiten Durchgang ein.

Geben Sie einen Interrogationsbereich von 32 Pixeln mit einem Schritt von 16 an. Wählen Sie dann „linear“ aus dem Dropdown-Menü zur Fensterdeformation und die Gaußsche 2×3-Punkt-Methode zur Unterpixel-Verschiebungsschätzung. Wählen Sie nun „Analysieren“ aus dem Analysemenü und anschließend „Alle Einzelbilder analysieren“. Wählen Sie aus dem Nachbearbeitungsmenü die Vektorvalidierung und wenden Sie aus dem Diagrammmenü einen Standardabweichungs-Filter-Schwellenwert von sieben auf alle Einzelbilder an.

Wählen Sie abgeleitete Parameter aus. Modifizieren Sie die Daten, gefolgt von Vektoren, Pixeln pro Bild und passen Sie die Glätte der Vektoren sowie den Hochpassfilter an. Nachdem Sie diese Anpassungen auf alle Bilder angewendet haben, setzen Sie die verwendeten Bilder auf eins, um abzuschließen.

Klicken Sie abschließend auf die Schaltfläche „Mittelwerte berechnen“, um die mittleren Vektoren aller Bilder zu ermitteln, wobei der Fokus auf der Drehung des Gonadenanlagen von adulten Wildtyp-C.-elegans-Individuen liegt, die wie gerade gezeigt abgebildet wurden. Ein 3D-Modell der Keimzellen wird aus den Mikroskopiedaten generiert, wodurch eine Analyse der Veränderungen der Zellgröße während des Übergangs der Zellen vom distalen zum proximalen Arm des Keimstocks unter Verwendung einer Zweifarben-Zeitraffermikroskopie ermöglicht wird. Die Modelle, die durch die Markierung von Linien-Histon-Fusionsproteinen und Nicht-Muskel-Myosin in NDR erhalten wurden, veranschaulichen das stereotypische Muster der Vererbung von Zellteilungsresten.

Außerdem können aus den Liniendaten in diesem Experiment die Spuren für jede Zelle L und jede Zellteilungsrest sowie deren Korrelation zur Zellteilungszeit ermittelt werden. Eine kurzzeitige Zeitraffermikroskopie mit hoher zeitlicher Auflösung des kortikalen nicht-muskulären Myosins zwei wurde durchgeführt, um Unterschiede in der Dynamik des kortikalen polarisierenden Flusses zwischen Wildtyp- und Embryonen, die für das RGA-3-aktivierende Protein der row-GTPase depletiert waren, wie erwartet zu bewerten. Der Fluss in den Wildtyp-Embryonen verlief vorwiegend entlang der Längsachse des Embryos.

Während die Strömung im RGA drei RNA-Interferenz-Embryo senkrecht zu dieser Achse verlief, was leicht aus der PIP-Analyse hervorgeht. Sobald die manuelle Segmentierung komplexer Objekte und die Zellverfolgung während der embryonalen Entwicklung beherrscht sind, können diese innerhalb weniger Stunden durchgeführt werden, sofern sie ordnungsgemäß durchgeführt werden, während man versucht, die Zell- und Objektverfolgung durchzuführen. Es ist wichtig, daran zu denken, eine geeignete zeitliche Auflösung einzustellen, um das Objekt während der Analyse unter Verwendung der hier beschriebenen drei Werkzeuge nicht zu verlieren.

Statistische Analysen können ebenfalls durchgeführt werden, um Fragen zur Variabilität zu beantworten oder einfach verschiedene Embryonen miteinander zu vergleichen. Die Anwendung von Software für die quantitative Bildanalyse ermöglicht uns und anderen Entwicklungsbiologen wie uns, morphogenetische Entwicklungsmechanismen auf einer bisher nicht dagewesenen Detailebene zu untersuchen. Nach dem Ansehen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie ein breites Spektrum an Software-Tools nutzen können, um quantitative Bildanalysen durchzuführen.