Tracking und Quantifizierung von Entwicklungsprozessen in C. elegans Verwendung von Open-Source-Werkzeuge
December 16th, 2015
Hier wird gezeigt, wie Entwicklungsprozesse in C. elegans verfolgt und quantifiziert werden können. Die vorgestellten Methoden basieren auf Open-Source-Tools, die einfach implementiert werden können. Es wird gezeigt, wie man 3D-Zellformmodelle rekonstruiert, wie man subzelluläre Strukturen manuell verfolgt und wie man die kortikale kontraktile Strömung analysiert.
Das übergeordnete Ziel des Einsatzes von Bildanalysesoftware und Entwicklungsbiologie ist es, quantitative Daten für mechanistische Modelle biologischer Prozesse zu erhalten. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen der Entwicklungsbiologie zu beantworten, wie z.B. wie können mutierte Phäno-Phänotypen quantitativ analysiert werden? Der Hauptvorteil dieser Methodik besteht darin, dass sie den Forschern die Möglichkeit gibt, Veränderungen in biologischen Prozessen und Entwicklungsphänomenen unvoreingenommen zu identifizieren.
Obwohl diese Methode verwendet werden kann, um Einblicke in die Entwicklung und Morphogenese der Meereseleganz zu geben, kann sie auch auf andere Modellorganismen wie Josepha angewendet werden. Die Rekonstruktion der Zellform mit IOD wird von CINA Leman, einer Doktorandin in meinem Labor, demonstriert. Öffnen Sie nach der Installation des IM MOD-Programms die Eunuchen-Shell und geben Sie Im mod in das IM mod-Fenster ein. Wählen Sie die Datei mit den entsprechenden Rohdaten aus, aus der ein 3D-Modell generiert werden soll, und verwenden Sie das Informationsfenster, um den unteren und oberen Rand der Objekte im Zap-Fenster zu lokalisieren.
Zeichnen Sie im Informationsfenster erneut die Zellumrisse nach, indem Sie die erste Kontur auf der obersten Ebene jeder Zelle erstellen und darauf achten, dass für jede Zelle ein neues Objekt erstellt wird. Scrollen Sie dann in Z nach unten und erstellen Sie für jede Z-Ebene eine neue Kontur und anschließend für jede Zelle ein neues Objekt. Nachdem Sie so viele Zellen umrissen haben, wie für das Modell geeignet sind, öffnen Sie das Modellansichtsfenster, um die Objekte und ihre Konturen zu untersuchen.
Wählen Sie dann in der Symbolleiste der Modellansicht Bearbeiten und Objekte aus. Es öffnet sich das entsprechende Bearbeitungsfenster, in dem Sie alle Zellen als gefüllte und geschlossene Objekte modellieren können. Wählen Sie Mesh als Zeichnungsdatentyp und Fill als Zeichnungsstil aus.
Klicken Sie auf Vernetzung und aktivieren Sie die Option Obergrenze. Markieren Sie dann so viele Objekte wie nötig und klicken Sie auf Netz. Das gesamte Programm generiert feste Objekte aus den Stapeln von Konturen.
Ändern Sie die Z-Skala im Ansichtsfenster, um den Z-Sampling-Faktor nach Bedarf anzupassen. Wählen Sie dann im Bearbeitungsmenü Ansicht aus, um die 3D-Objekte zu drehen und Schnappschüsse oder Filme der Zellen zu speichern, um Objekte aus fluoreszierenden Zeitrafferaufnahmen zu verfolgen. Konvertieren Sie die Rohdaten zuerst mit NDR in eine TIFF-Datei.
Öffnen Sie dann die Datei. Am Ende fallen. Wählen Sie das 2D-Viewer-Symbol und klicken Sie auf das Symbol für den Anpassungsbereich, um das Histogramm im Datenmenü anzupassen.
Wählen Sie Datei, Name, Bild, Set, Kanal und X-, Y-, Z-Auflösung aus und geben Sie die X-, Y- und Z-Werte ein. Um die Kerne zu beschriften, bewegen Sie sich zur gewünschten Ebene, und wählen Sie den 2D-Viewer erneut aus. Wählen Sie dann im Dropdown-Menü die Option "Abstammung" aus und wählen Sie "Neue Abstammung".
Klicken und ziehen Sie auf den Nukleus, der für den Markt von Interesse ist. Klicken Sie dann mit der rechten Maustaste auf den Kern und wählen Sie Teilchen umbenennen. Geben Sie im Dropdown-Menü einen Namen für das Partikel ein und ziehen Sie dann das Pfeilsymbol, um den Durchmesser des Kreises zu ändern.
Klicken Sie anschließend auf das rechte Symbol, um die zentrale Ebene des Kerns zu markieren. Um dann in Zeit und Ebene fortzufahren, wählen Sie die Optionen Rahmen und Z in der unteren Symbolleiste und passen Sie die Position oder Größe des Kreises, der den Kern markiert, entsprechend an, bis sich die verfolgte Zelle teilt. Wenn eine Zellteilung beobachtet wird, markieren Sie die Tochterkeime und klicken Sie auf das Windows-Symbol, um zur Abstammung zu wechseln.
Betrachter Markieren Sie alle drei Kerne gleichzeitig und wählen Sie unter der Option "Abstammung" die Option "Übergeordnetes Element zuordnen" aus. Wenn alle Zellen verfolgt wurden, klicken Sie auf den Dateinamen und wechseln Sie zum Kanal. Markierung des Zellteilungsrests zur quantitativen Analyse der kortikalen Strömung mit Hilfe von Software zur Partikelbild-Geschwindigkeitssymmetrie.
Laden Sie die neuen Bilddateien in pif lab und wählen Sie den Sequenzierungsstil aus. 1, 2, 2, 3. Navigieren Sie anschließend zu dem Verzeichnis, das die Sequenz der gewünschten Bilder enthält.
Wählen Sie die Bilder aus und klicken Sie auf Hinzufügen, um die Bilder zu importieren. Wählen Sie dann unter Analyseeinstellungen die Option Ausschlüsse aus. ROI-Maske und verwenden Sie die Schaltfläche.
Zeichnen Sie Masken für den aktuellen Rahmen, um den unerwünschten Teil der Bilder in den Analyseeinstellungen zu deaktivieren. Wählen Sie erneut PIF-Einstellungen und wählen Sie als gewünschten PIF-Algorithmus die schnelle Verformung des Fourier-Transformationsfensters. Geben Sie für den ersten Durchgang einen Wert für den Abfragebereich von 64 Pixeln und einen Schritt von 32 Durchgang zwei ein.
Geben Sie einen Wert für den Abfragebereich von 32 Pixeln in Schritten von 16 ein. Wählen Sie dann im Dropdown-Menü "Fensterverformung" die Option "linear" und wählen Sie die Gaußsche Zwei-mal-Drei-Punkt-Methode zur Schätzung der Subpixel-Verschiebung. Wählen Sie nun im Menü "Analyse" die Option "Analysieren" und dann "Alle Frames nach der Verarbeitung analysieren", wählen Sie im Menü "Nachbearbeitung" die Option "Vektorvalidierung" und wenden Sie im Menü "Plot" einen Standardabweichungsfilterschwellenwert von sieben auf alle Frames an.
Wählen Sie abgeleitete Parameter aus. Ändern Sie die Daten gefolgt von Vektoren, Pixel pro Frame und passen Sie die Glätte der Vektoren und des Hochpassfilters an. Nachdem Sie diese Anpassungen auf alle Frames angewendet haben, setzen Sie die verwendeten Frames auf eins am Ende.
Klicken Sie abschließend auf die Schaltfläche "Mittlere Vektoren berechnen", um die mittleren Vektoren aller Frames zu messen, wobei der Schwerpunkt auf der Drehung der Gonade der Wildtyp-C-Eleganz liegt, die bei Erwachsenen wie gerade gezeigt dargestellt wurde. Aus den Mikroskopiedaten wird ein 3D-Modell der Keimzellen generiert, das die Analyse der Veränderungen der Zellgröße ermöglicht, die während des Übergangs der Zellen vom distalen zum proximalen Arm des Kus mit Hilfe der Zweifarben-Zeitraffermikroskopie auftreten. Die Modelle, die mit Linien-Histon-Fusionsproteinen und Nicht-Muskel-Myosin im NDR erhalten wurden, veranschaulichen das stereotype Muster der Vererbung von Zellteilungsresten.
Darüber hinaus können in diesem Experiment aus den Liniendaten die Spuren für jedes Zell-L und jeden Zellteilungsrest und die Korrelation zum Zeitpunkt der Zellteilung gewonnen werden. Es wurde eine Kurzzeit-Zeitraffermikroskopie mit hoher zeitlicher Auflösung des kortikalen Nicht-Muskel-Myosins zwei durchgeführt, um die Unterschiede in der Dynamik des kortikalen polarisierenden Flusses zwischen Wildtyp-and-Embryonen zu bewerten, die wie erwartet für das reihige gtpa-aktivierende Protein RGA drei depletiert wurden. Die Strömung in den Wildtyp-Embryonen verlief überwiegend entlang der Längsachse des Embryos.
Während die Strömung im RGA-Drei-RNA-Interferenzembryo orthogonal zu dieser Achse war, wie aus der PIP-Analyse leicht ersichtlich ist. Einmal gemeistert, kann die manuelle Segmentierung komplexer Objekte und die Zellverfolgung während der Embryonalentwicklung innerhalb weniger Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig ist, während versucht wird, die Zell- und Objektverfolgung durchzuführen. Es ist wichtig, daran zu denken, eine angemessene zeitliche Auflösung einzurichten, um das Objekt während der Analyse nicht mit den drei hier beschriebenen Werkzeugen zu verlieren.
Eine statistische Analyse kann auch durchgeführt werden, um Fragen zur Variabilität zu beantworten oder einfach nur verschiedene Embryonen zu vergleichen. Die Implementierung einer quantitativen Bildanalysesoftware ermöglicht es uns und anderen Entwicklungsbiologen wie uns, morphogenetische Entwicklungsmechanismen in einem noch nie dagewesenen Detaillierungsgrad zu erforschen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie eine Vielzahl von Softwaretools zur Durchführung quantitativer Bildanalysen verwenden können.
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Übersicht
Dieser Artikel zeigt Methoden zur Verfolgung und Quantifizierung von Entwicklungsprozessen in C. elegans mit Open-Source-Tools auf. Er behandelt die Rekonstruktion von 3D-Zellformmodellen, die manuelle Verfolgung subzellulärer Strukturen und die Analyse des kortikalen kontraktilen Flusses.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Entwicklungsbiologie
- Bildanalyse
- Quantitative Forschung
Hintergrund
- Bildanalyse-Software hilft bei der Gewinnung quantitativer Daten für biologische Prozesse.
- Die Methodik ermöglicht eine unvoreingenommene Identifizierung von Veränderungen in Entwicklungsphänomenen.
- Anwendbar auf verschiedene Modellorganismen jenseits von C. elegans.
- Fokus auf die Rekonstruktion von Zellformen und die Analyse von Mutanten-Phänotypen.
Zweck der Studie
- Um Einblicke in Entwicklung und Morphogenese zu geben.
- Um Mutanten-Phänotypen quantitativ zu analysieren.
- Um den Einsatz von Open-Source-Tools in der Entwicklungsbiologie zu demonstrieren.
Verwendete Methoden
- Installation des IMOD-Programms für Bildanalyse.
- Verwendung der IMOD-Schnittstelle zur Generierung von 3D-Modellen aus Rohdaten.
- Manuelle Verfolgung subzellulärer Strukturen.
- Analyse des kortikalen kontraktilen Flusses.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Rekonstruktion von 3D-Zellformmodellen.
- Effektive Verfolgung subzellulärer Strukturen.
- Quantitative Analyse von Entwicklungsprozessen.
- Demonstrierte Methodik anwendbar auf verschiedene Organismen.
Schlussfolgerungen
- Die vorgestellten Methoden verbessern das Verständnis der Entwicklungsbiologie.
- Open-Source-Tools ermöglichen eine unvoreingenommene Analyse biologischer Prozesse.
- Potenzial für eine breitere Anwendung in verschiedenen Forschungskontexten.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Quantitative tracking of developmental processes in C. elegans using open-source image analysis tools enables mechanistic de-risking and functional target validation in early discovery. These workflows provide unbiased, reproducible data critical for distinguishing mutant phenotypes and clarifying developmental pathways. Integrating such quantitative imaging approaches strengthens predictive confidence and supports risk-adjusted portfolio decisions in preclinical research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables quantitative interrogation of developmental hypotheses and mutant phenotypes.
- Supports mechanistic de-risking by clarifying cell lineage and morphogenetic events.
- Facilitates functional target validation through unbiased phenotype quantification.
- Improves predictive confidence for early-stage portfolio triage.
Screening & Assay Development
- Prepares validated biological systems for downstream quantitative imaging workflows.
- Standardizes assay outputs with reproducible, open-source analysis pipelines.
- Enables reliable tracking of subcellular structures and developmental events.
- Supports scalable screening of genetic or chemical perturbations in model organisms.
Translational & Preclinical Research
- Aligns quantitative imaging outputs with disease-relevant developmental models.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation of mechanistic hypotheses.
- Enables risk-adjusted advancement decisions based on robust phenotypic data.
- Supports translational biomarker identification when developmental processes are disease-linked.
Pipeline & Workflow Integration
These open-source imaging and analysis methods integrate from early discovery through preclinical model validation, supporting hypothesis testing, pathway clarification, and quantitative phenotyping.
- Discovery Biology: Quantitative image analysis supports hypothesis-driven interrogation of developmental mechanisms and mutant effects.
- Screening: Standardized tracking and measurement workflows enable reproducible comparison of experimental conditions.
- Analytics: Provides quantitative outputs such as cell shape, lineage, and contractile flow metrics for statistical analysis.
- Translational Research: Facilitates alignment of developmental phenotypes with disease models when relevant.
- Enterprise Reuse: Open-source tools and protocols are adaptable across laboratories and model systems, supporting broad R&D reuse.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in developmental biology studies.
- Operational Value: Promotes standardization, reproducibility, and scalability through open-source, platform-independent tools.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions and capital efficiency by providing robust quantitative data.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of discovery-stage assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in quantitative image analysis and developmental biology.
- Needs access to microscopy systems and compatible computational infrastructure.
- Demands cross-team standardization of imaging protocols and analysis pipelines.
- Adaptable to various model organisms and developmental systems with protocol adjustments.
- Manual segmentation and tracking may be time-intensive until proficiency is achieved.
