Isolation, Charakterisierung und vergleichende Differenzierung humaner Dental Pulp Stammzellen aus bleibenden Zähne mit zwei verschiedenen Methoden abgeleitet

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, menschliche gentile Pulsstammzellen aus bleibenden Zähnen mit zwei Methoden zu isolieren, zu charakterisieren und zu differenzieren. Dies wird erreicht, indem gesunde retinierte Weisheitszähne gesammelt und zu Beginn um den Zement herum geschnitten werden. Dentale Poly-Stammzellen D PSCs werden auf zwei verschiedene Weise isoliert.

Bei der ersten Methode werden Polypengewebe enzymatisch verdaut, indem es in Kollagenase Typ eins plus Bandscheibenraumlösung inkubiert wird. Hier nennen wir sie ed. Unter Berücksichtigung der Isolationsmethode bei der zweiten Methode werden Palpgewebe nur ohne Verdauung in den Kolben gegeben.

Auf diese Weise beginnen DPSS aus dem Gewebe in den Kolben zu wandern. Diese Zellen mit dem Namen OG beziehen sich auf die Methode zur Isolierung des Auswuchses. Der zweite Schritt des Verfahrens ist die Identifizierung von Stammzellen mittels Fallzytometrie.

Der dritte Schritt des Verfahrens ist die Induktion der Odontoblastendifferenzierung, und der letzte Schritt des Verfahrens ist die vergleichende Bewertung der Odontoblastendifferenzierung zwischen zwei Gruppen durch Rotfärbung und QBCR. Ich bin RA Kde von der Abteilung für Stammzellen und Entwicklungsbiologie am Rian Institute. Heute zeige ich Ihnen die Isolierung, Charakterisierung und vergleichende Differenzierung von humanen mesenchymalen Stammzellen mit Hilfe von zwei Methoden.

Hallo, ich bin Dr. Rezaian vom Rio Institute. Wir arbeiten an einem Projekt, das sich mit menschlichen Stammzellen aus Zahnpulpa befasst. Diese Zellen sind eine Art mechy-Stammzellen, die leicht und mit minimalen Schmerzen und Morbidität zu gewinnen sind.

Mechy-Stammzellen spezifizieren mit plastischer Aran-Fähigkeit, Bildung von Kolonien und mehrfacher Differenzierungsfähigkeit. Hallo, ich bin Dr.Ami von der Abteilung für Stammzellen. Am Institut verwenden wir dieses Verfahren in unserem Labor, um Stammzellen für Forschungsstudien und zukünftige Anwendungen zu isolieren.

In der regenerativen Medizin besteht der allererste Schritt zur Nutzung dieser Stammzellquelle für zukünftige stammzellbasierte Therapien darin, das beste Protokoll für die Isolierung von Stammzellen aus menschlichem Teilgewebe zu wählen. Um dieses Ziel zu erreichen, ist es entscheidend, bestimmte Aspekte des zellulären Verhaltens unter verschiedenen Bedingungen der Stammzellisolierung zu untersuchen. Zuerst werde ich menschliche Stammzellen aus der Zahnpulpa isolieren, indem ich entweder die enzymatische Dissoziation der Pulpa oder das Auswachsen von Stammzellen aus Gewebeimplantaten verwende.

Dann charakterisieren und differenzieren Sie sie in Ogen-Blast. Also lasst uns loslegen. Erster Weg, Raum und Kollagenase Typ eins lösen beide in PBS auf.

Filtern Sie sie dann mit einem Spritzenvorsatzfilter von oh 0,2 Mikron. Beides in ein konisches Rohr ziehen. Fügen Sie dann Pener und PBS hinzu, um die endgültige Konzentration zu erreichen.

Gesunde Weisheitszähne im kalten basischen Medium unter Stahlbedingungen ins Labor überführen. Reinigen Sie die Oberfläche des Zahns mit 70% Ethanol, bevor Sie lernen. Achten Sie darauf, die Brise von der Oberfläche des Zahns zu entfernen.

Schneiden Sie den Zahn um den Zementschmelzübergang herum, indem Sie eine sterilisierte Zahnscheibe verwenden, um die Pulpakammer freizulegen. Es ist zu beachten, dass der Schneidprozess langsam durchgeführt werden muss, um die Überhitzung des Zahngewebes zu reduzieren. Anschließend trennen Sie mit der Scarpa-Klinge vorsichtig Pulpagewebe von der Krone, d.h. Pulpagewebe in ein bis zwei Millimeter große Stücke.

Übertragen Sie kleine Stücke des Pulpagewebes alle 30 Minuten für eine Stunde bei einem Wirbel von 37 Grad Celsius in eine Milliliter-Enzymlösung, um das Aufbrechen des Pulpagewebes zu unterstützen. Entfernen Sie anschließend große Aggregate, indem Sie sie durch einen 70-Mikron-Zellstamm führen. Geben Sie dann PBS mit PENER Zentrifugen in 1.200 U/min für fünf Minuten hinzu.

Entfernen Sie das Supernat vorsichtig. Dann suspendieren wir die Platte in dem Proliferationsmedium pm, überführen sie in den Kulturkolben und fügen Medium hinzu. Dann inkubieren, inkubieren.

Wechseln Sie das Medium alle drei Tage, bis die Zellkonfluenz für die Outwork-Methode erreicht ist. Wiederholen Sie den Schneidvorgang. Nach dem Schneiden bedeutet Zahn das Gewebe in ein bis zwei Millimeter Fragment zu zerbrechen.

Platzieren Sie sie dann in der Kultur. Flash mit Proliferation, medium und inkubiert. Es sollte berücksichtigt werden, dass das Gesamtvolumen des Proliferationsmediums die Anheftung aller Teile für das weitere Zellwachstum unterstützen muss.

Wechseln Sie das Medium nach Beobachtung des Auswuchses und dann alle drei Tage, bis die Zellkonfluenz erreicht ist. Für die Immunphänotypisierung inkubieren Sie beide Arten von D-PSCs mit PE- oder FITC-konjugierten Antikörpern für 30 Minuten bei vier Grad Celsius im Dunkeln. Fügen Sie dann PBS- und Centi-Ansichten mit 1.200 U/min für fünf Minuten hinzu.

Entfernen Sie den Überstand und die Reanimation, hängen Sie die Platte in PBS auf und bewerten Sie schließlich Oberflächenmarker mit Hilfe von Durchflusszytometer-Subkulturen, beides Arten von DPCs für drei Durchgänge. Dann trippt man in Eis und überträgt sie in sechs rote Kulturschalen mit 60 % Co-Fluenz, ersetzt PM durch odontogenes Medium. Drei Vertiefungen bleiben als Negativkontrolle durch Zugabe von pm erhalten.

Wechseln Sie das Medium alle drei Tage am 21. Tag Waschzellen mit PBS. Fixieren Sie sie dann um einen Milliliter pro Vertiefung. 10% formelle Gelhöhe für 15 Minuten bei Haustemperatur.

Nach 15 Minuten das Fixiermittel vorsichtig entfernen und die Zellen dreimal mit destilliertem Wasser aufwickeln. Ersetzen Sie dann das Wasser durch einen Milliliter pro Rotalge in roter Fleckenlösung. Nach 20 Minuten entfernen wir überschüssige Farbstoff- und Waschzellen viermal mit entionisiertem Wasser.

Geben Sie dann einen Millimeter pro Brunnen Wasser hinzu, um ein Austrocknen der Zellen zu verhindern. Nach der Färbung können Sie sehen, wie sich drei obere Schienen im Vergleich zu den Kontrollen unter dem Mikroskop rot färben, Sie können eine Absorption der Farbe um die Zelle herum durch große Vergrößerung zur Quantifizierung einer roten Färbung sehen. Nach dem Entfernen des Wassers einen Milliliter pro Vertiefung mit 10 % saurer Säure hinzufügen und dann 30 Minuten lang unter Schütteln inkubieren.

Kratzen Sie dann die Zellen vorsichtig mit einem Zellschaber von der Platte ab. Übertragen Sie sie dann in die separaten Röhrchen. VOR dauert 30 Sekunden lang kräftig.

Dann erhitzen Sie sie 10 Minuten lang auf 85 Grad Celsius. Um zu vermeiden, dass Verdampfungsdichtungsrohre mit ParaView-Transferrohren fünf Minuten lang auf Eis gesetzt werden, verwendeten sie sie incenty bei 20.000 g für 15 Minuten. In der Zwischenzeit machen Sie Alzheimer-Rot als Standard-Reihenverdünnung gemäß dem Regionsprotokoll.

Entfernen Sie nach der Zentrifugation die Schlinge und übertragen Sie sie in die neuen Röhrchen. Neutralisieren Sie den pH-Wert mit 10% Ammoniumhydrozyten. Fügen Sie dann Standards und auch Stichproben in 96 hinzu.

Füllen Sie die Well-Platte, messen Sie dann die Extinktion bei 405 Nanometern und analysieren Sie die Daten gemäß der Standard-Reihenverdünnung. Hier sieht man DPCs, die am 10., 15. und 18. Tag durch enzymatische Dissoziation isoliert werden, sowie DPCs am fünften, 10., 13. und 18. Tag. Beide Arten von dpss bei sase drei haben fast die gleiche Größe und Morphologie. Die Ergebnisse der Immunphänotypisierung zeigen das Vorhandensein von mesenchymalen Stammzellmarkern wie CD 44, CD 73 und CD 19 und das Fehlen von hämatopoetischen und endothelialen Markern wie CD 34, CD 45 und CD 11 B.Interessanterweise sind die Expressionen von CD 1 0 5 und CD 146 in herausgewachsenen d PSCs im Vergleich zu D-P-S-C-E-D höher. Die Quantifizierung der Enzymrotfärbung am 21. Tag der Odontoblastendifferenzierung zeigt eine höhere Calciumablagerung in D-P-S-C-E-D im Vergleich zu ohne kon Zahnoberseite von Stammzellen.

Die QPCR-Ergebnisse deuten auch auf eine signifikant höhere Expression von MEP und A LP als Mineralisierungsmarker in D-P-S-C-D im Vergleich zum ausgehenden Zahn von Stammzellen hin. Währenddessen werden beide Gene während der Differenzierung reguliert und auch die Expression von DSPP, da der odontogene Marker während der Differenzierung zunimmt. Es gibt jedoch keine signifikante Variation in der Expression von DSVP in differenzierten Zellen zwischen ED- und OG-Gruppen.

Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie Sie menschliche Zahnteile und Stammzellen isolieren können, indem Sie entweder die enzymatische Dissoziation der Pulpa oder das Auswachsen von Stammzellen aus dem Gewebe verwenden. Das war's also. Ich wünsche Ihnen viel Glück beim Versuch, dieses Verfahren in Ihrem Experiment anzuwenden.

Vielen Dank.