وضع العلامات واحدة من الخلايا في الجهاز العصبي المركزي ذبابة الفاكهة الدروسوفيلا

الهدف العام من هذا الإجراء هو تسمية الخلايا العصبية المفردة في الجهاز العصبي المركزي للمرحلة المبكرة 17 جنينا ذبابة الفاكهة. يتم تحقيق ذلك عن طريق جمع البيض والسماح له بالتطور إلى المرحلة الصحيحة. الخطوة الثانية من الإجراء هي كلورة البيض ومحاذاة البيضات يدويا.

بعد هذه المغنية ، فإن استعمار الأجنة وحفظها يجعل الحبل العصبي متاحا. الخطوة الأخيرة هي تسمية الخلايا المفردة عن طريق تطبيق Iono retic للعين المحبة للدهون. في النهاية ، تسمح النتائج بتصور مورفولوجيا الخلايا العصبية المفردة إذا رغبت في ذلك في سياق أنماط تعبير GFP المعروفة أو في الخلفية الطافرة.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية على طرق وضع العلامات على الخلية المفردة الحالية مثل markum هي أنها تعمل في الجنين وتسمح بتصور الخلايا المحددة عن قصد. يعد العرض المرئي لهذه الطريقة مفيدا للغاية لأن العديد من الخطوات حساسة وبالتالي يصعب تعلمها. اسمح للذباب السليم بوضع الأجنة على ألواح أجار.

استبدل اللوحة كل ساعة ونصف عند 25 درجة مئوية واحتفظ بالأجنة. احتضان الأجنة على صفائحها عند 25 أو 18 درجة مئوية حتى تصل إلى مرحلة النمو المطلوبة. عندما تصبح جاهزا ، انقل الأجنة إلى شريحة مغطاة بشريط لاصق على الوجهين.

تجنب نقل أي أجار مع الأجنة لأنه سيتداخل مع التصاقها بالشريط. على الشريط. اترك الأجنة تجف لمدة خمس إلى 10 دقائق أثناء الانتظار.

قم بتغطية زلة غطاء 24 ملم × 60 ملم بغراء سباعي. ضع قطرة صغيرة من الغراء في وسط الشريحة وانشرها في طبقة رقيقة جدا باستخدام زلة غطاء مربعة مقاس 18 ملم. بمجرد أن تجف الأجنة ، لمسها برفق بإبرة.

سوف ينقسم الكوريون ويلتصق الجنين بالإبرة. انقل الأجنة منزوعة الكلور على الفور إلى كتلة أجار لمنعها من الجفاف. قم بمحاذاة هناك 10 على التوالي ، والجوانب البطنية لأعلى.

اقطع الأجار الزائد من الكتلة بمشرط. ثم المس الأجنة برفق باستخدام زلة الغطاء المطلية بغراء السباعي. يجب أن تلتزم بزلة الغطاء مع جوانبها البطنية لأسفل.

ضع إطارا من الشريط اللاصق حول زلة الغطاء وقم بتثبيته بشريحة مجهرية. إبقاء الأجنة أعلى زلة الغطاء. قم بتغطية الأجنة بكميات كبيرة من PBS على الجانب الظهري لكل جنين بالقرب من نهايته الخلفية.

اخترق غشاء الزجاجي بإبرة زجاجية ، وافتح الغشاء على طول خط الوسط الظهري واسحب الجنين من الغشاء. الآن أعد توجيه الجانب البطني للجنين لأسفل في مكان آخر على ركيزة الغراء السباعي. قم بحفظ الجنين بإبرة زجاجية عن طريق ثقب جدار الجسم برفق وتمزيق خط الوسط الظهري.

باستخدام الإبرة ، ادفع لأسفل على جدار الجسم حتى يلتصق بالشريحة. تمزيق القناة الهضمية في نهاياتها الأمامية والخلفية ، وارفع القناة الهضمية بعيدا. نظرا لأن العديد من الأجنة ستكون ملفة على نفس الشريحة ، فمن المفيد إما أن تكون دقيقا جدا في اتجاهها أو ترسم اتجاهها.

بعد ذلك ، يمكن تثبيت الأجنة بشكل خفيف لمدة 10 إلى 15 دقيقة في 7.4٪ فورمالديهايد في PBS متبوعا بأربع غسلات في PBS ، واستخدم الحذر الشديد لتجنب لمس الأجنة على سطح المحلول. سوف تدمرها قوى التوتر السطحي تحت هدف 10 ×. قم بتوسيط مجال الرؤية على جنين محضر ، وقم بزيادة التكبير وحدد موقع الخلية ذات الأهمية تحت بصريات DIC أو تحت التألق.

إذا كانت الخلية المستهدفة تعبر عن GFP ، فتأكد من فتح الحجاب الحاجز الميداني للمجهر فقط على حافة مجال الرؤية ، وليس خارج الإضاءة الضيقة. سيساعد الشعاع في تغيير موضع الماصة الدقيقة إلى الهدف 10 × ووضع قطب الحمام لمضخم التيار المستمر في المحلول بعيدا عن الجنين ومسار الماصة الدقيقة. قم بتركيب ماصة الحقن الدقيقة المملوءة بمحلول كلوريد الليثيوم بالحامل وإرفاقها بمناور الصغير.

باستخدام عناصر التحكم في الدورة ، ضع الماصة الدقيقة أسفل الهدف وفوق الجنين بكثير. إذا كانت زاوية البيب الصغيرة شديدة الانحدار ، فلن يتم التركيز على الحافة. إذا كان ضحلا جدا, سوف يفسد العمود على جدار الحمام مركز الطرف في مجال الرؤية.

الآن اخفض الماصة الدقيقة وركز بالتناوب حتى تصبح الماصة في PBS وليس بعيدا جدا عن الجنين. الآن قم بالتغيير إلى هدف عالي الطاقة وقم بتوسيط الماصة في مجال الرؤية. عندما يكون العمود في بؤرة التركيز البؤري ، حرك الماصة الدقيقة في المحور X حتى يقع طرفها في وسط مجال الرؤية.

يجب أن يكون طرف الماصة الدقيقة أعلى بكثير من مستوى الجنين. قم بالتبديل إلى إضاءة التألق وافحص الحافة. تحقق من وجود تسرب في صبغة العين.

اضبط تيار التيار المستمر بحيث لا تتراكم بلورة عين الصبغة عند الحافة. الآن اخفض الماصة الدقيقة في المحور Z باتجاه الجنين. ضبط التركيز تدريجيا مع تركيز الجنين.

قم بالتبديل إلى استخدام عنصر التحكم الدقيق. ركز الخلية المراد حقنها في وسط الحقل ثم أعد التركيز على طرف الماصة الدقيقة. من هذه النقطة فصاعدا ، قد يكون من الأنسب استخدام التحكم في مرحلة المجهر لتحريك الجنين بالنسبة إلى الماصة الدقيقة.

اجعل طرف الماصة الدقيقة ملامسا للخلية وقم بعمل انخفاض على سطحها. قم بتمرير عدة نانو أمبير من تيار إزالة الاستقطاب لبضع ثوان. سوف تتشكل بلورة صغيرة من صبغة العين على الخلية لتأكيد أن الخلية قد تم تصنيفها.

افتح الغالق لفترة وجيزة لإضاءة المجال بضوء الفلورسنت. إذا ظهرت على جسم الخلية علامات الملصق، فقم بتطبيق التيار لعدة ثوان أخرى. ثم قم بإيقاف تشغيل التيار واسحب الجنين بسرعة بعيدا عن الماصة الدقيقة باستخدام أدوات التحكم في المرحلة.

إذا لم يكن هناك وضع علامات على العين D واضحا، فقد تكون الماصة الدقيقة قد تم حظرها وتحتاج إلى استبدال. إذا كان طرف الماصة يعطل أنسجة أخرى على جذر الخلية ويلطخ تلك الأنسجة، فحاول سحب الماصة الدقيقة قليلا وإعادة الاقتراب من الخلية قبل اللجوء إلى استبدال الماصة الدقيقة حسب الحاجة. استمر في وضع العلامات على الخلايا الأخرى في نفس الجنين أو في أجنة أخرى على نفس الشريحة.

حرك الطرف إلى حافة مجال الرؤية وكرر الإجراء. قم بإزالة معظم المحلول في غرفة الحقن. ثم قم بإصلاح الأجنة بإضافة 7.4٪ فورمالديهايد PBS لمدة 10 دقائق ، متبوعة بأربع غسلات باستخدام PBS.

يمكن الآن تحويل المستحضر بالصور أو تركيبه للفحص المجهري متحد البؤر باستخدام البروتوكول الموضح. تم تحويل الخلايا العصبية الداخلية المملوءة بداي بشكل لا تشوبه شائبة تحت بصريات DIC. تم حل السياق المكاني للخلية المسمى داخل الأنسجة المحيطة غير المسماة بشكل جيد.

على سبيل المثال ، يمكن رؤية مواضع جسم الخلية داخل القشرة وإسقاط الألياف داخل حبوب منع الحمل العصبية في هذا المستحضر. كان قطرة الصبغة كبيرة جدا. تم تصنيف العديد من الخلايا المجاورة في وقت واحد ، مما يجعل من الصعب ربط الإسقاطات الفردية بأجسام الخلايا المميزة.

لاحظ أيضا أنه تحت المجهر الفلوري ، تكون دقة الخلفية أقل بكثير بدون تحويل الصورة. يمكن أيضا حقن خلايا متعددة في الأجزاء المجاورة في هذا المستحضر ، وهو جسم مضاد ضد بقعتين سريعتين من البقع في حبوب منع الحمل العصبية. على الرغم من أجسام الخلايا الصافية ، يظهر المستحضر آثارا جانبية محتملة لفترات تحويل الصور الطويلة.

تميل الخلايا ذات العلامات الأكثر كثافة إلى تلطيخ المبالغ الزائدة وتبدأ في الانتفاخ مقارنة بتسمية خلية واحدة ببصريات متحد البؤر. يمكن أن يوفر وضع العلامات على صبغة العين في الأجنة التي تحمل تركيبات مراسل GFP السياق المكاني وهوية الخلية المملوءة D داخل مجموعات محددة من أنواع الخلايا العصبية أو الدبقية الإيجابية GFP. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إعداد وتنفيذ ملصقات الخلايا العصبية المفردة في الجهاز العصبي المركزي الجنيني بعد oph.

ولكن أثناء محاولة هذا الإجراء ، يرجى أن تضع في اعتبارك أن كل خطوة تتطلب الكثير ، لذا توقع بضع تكرارات حتى يتم تشغيل الإجراء بأكمله بسلاسة.