Aufbau einer Liquid-bedeckten Kultur Polarized Menschliche Airway Epithelial Calu-3-Zellen, um Host-Zell-Antwort, um Atemwegspathogene Studie In-vitro-

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, eine polarisierte, mit Flüssigkeit bedeckte Kultur von Calu drei Zellen unter Verwendung eines Transwell-Kultursystems zu etablieren, um das Transwell-Kultursystem einzurichten. Bereiten Sie zunächst eine Transwell-Platte vor, indem Sie die Einsätze in die äußeren Reihen der Platte verschieben und den basolateralen Kammern jeder Vertiefung Medium hinzufügen. Der zweite Schritt besteht darin, monoschichtige Kulturzellen in Einzelzellsuspensionen vorzubereiten.

Anschließend werden die suspendierten Zellen in die apikalen Kompartimente der Transwell-Einsätze eingesetzt. Der letzte Schritt besteht darin, apikale und basale laterale Medien vollständig zu ersetzen. In Kultur in einem drei- und viertägigen Zyklus für zwei bis drei Wochen einsetzen, bis die Zellen vollständig polarisiert sind.

Letztendlich werden ein transepithelialer elektrischer Widerstand und ein passiver Natriumfluorescein-Äquilibrierungsassay verwendet, um die Polarisation von flüssigkeitsbedeckten Calu-Drei-Kulturen zu demonstrieren. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber der Verwendung normaler menschlicher Bronchialepithelzellen besteht darin, dass Calor drei leichter zugänglich sind und sich schneller zu polarisierten Kulturen entwickeln. Sofort einsatzbereit Alle Verfahren zur Züchtung polarisierter Calu. Drei mit Flüssigkeit bedeckte Kulturen oder LCC werden in einer Biosicherheitswerkbank unter Verwendung steriler Kulturtechniken durchgeführt.

Beginnen Sie mit der Vorbereitung einer 24-Well-Trans-Well-Platte. Für die Aussaat mit einer sterilen Pinzette bewegen Sie die Transwell-Einsätze von der Innen- in die Außenreihen der Platte, ohne den Einsatz zu berühren. Membranzellen sollten nur in Vertiefungen an den äußeren Reihen der Platte subkultiviert werden.

Bei 600 Mikrolitern EMEM, das 10 % FBS enthält, im Folgenden als EMEM bezeichnet, 10 % zu jedem basolateralen Kompartiment. Um das Eindringen von Luftblasen zu verhindern, winkeln Sie die Pipette gegen die Wand jedes Fachs und geben Sie das Medium langsam in die Vertiefung ab. Als nächstes lösen Sie Colu drei Zellen aus Gewebekulturflaschen und Subkulturzellen, wie im Protokolltext beschrieben, resuspendieren Sie die gewaschenen Zellen gründlich in fünf Millilitern EMEM 10%, indem Sie vorsichtig auf und ab pipettieren, bestimmen Sie die lebensfähigen und die Gesamtzellzahl nach der Trian-Blue-Ausschlussmethode und fahren Sie nur fort, wenn 80% bis 90% lebensfähig sind.

Dann verdünnen die Zellen in einem sterilen konischen Röhrchen von 50 Millilitern auf eine Konzentration von zweimal 10 auf die sechs lebensfähigen Zellen pro Milliliter. Mit EMEM 10% fügen Sie 100 Mikroliter resuspendierte Calu drei Zellen in das apikale Kompartiment jedes Transwells hinzu, mit Ausnahme der Vertiefungen A eins und D eins. Winkeln Sie die Pipette vorsichtig gegen den inneren Führungskanal der Einsatzwand an und geben Sie die Zellen langsam frei.

Berühren Sie die Pipette nicht mit der Einführmembran. Bewegen Sie die CALU-Drei-Zellen-Suspension während dieses Sitzschritts vorsichtig, um eine homogene Suspension der Zellen in den Vertiefungen A eins und D eins aufrechtzuerhalten, bei denen es sich um zellfreie Kontrollvertiefungen oder -blindproben bei 100 Mikrolitern EMEM 10 % ohne Zellen handelt. Inkubieren Sie die Trans-Well-Platte bei 37 Grad Celsius und 7 % Kohlendioxid in der Luftatmosphäre in einem Inkubator, in dem die physikalische Störung minimal ist, um die Effizienz der Polarisation zu verbessern.

Stapeln Sie die Platten drei Tage nach der Subkultur nicht übereinander und kalibrieren Sie drei Zellen in Transwells, sondern ersetzen Sie das Medium vollständig und saugen Sie das Medium vorsichtig aus den Transwell-Einsätzen an, indem Sie eine Kapillarpipette verwenden, die an einer Vakuumfalle mit einem sanften Vakuum befestigt ist. Entfernen Sie zuerst das apikale Medium aus allen Vertiefungen und dann das basolaterale Medium aus allen Vertiefungen. Berühren Sie die Einsteckmembranen nicht, während Sie Medium ansaugen.

Geben Sie 200 Mikroliter EMEM 10% in das apikale Kompartiment der zellfreien Vertiefungen A eins und D eins. Dann in die sitzenden Vertiefungen, wobei das Medium mit der Seite des Einsatzes, um die Pipettenspitze zu führen, in das apikale Kompartiment geleitet wird. Geben Sie kein Medium direkt auf die Zellen und berühren Sie nicht die Einlegemembran.

Geben Sie anschließend 600 Mikroliter EMEM 10% in die basalen lateralen Kompartimente, um das Einbringen von Luftblasen in die basalen lateralen Kompartimente zu verhindern. Geben Sie Medium zu jedem Fach, indem Sie die Pipette gegen die Wand jedes Fachs anwinkeln und das Medium langsam in die Vertiefung abgeben. Setzen Sie die Transwell-Platte nach diesem ersten Medium wieder in den Inkubator ein. Ersatz.

Das Medium sollte in einem Zyklus abwechselnd zwischen dem vierten und dem dritten Tag nach der vorherigen Fütterung ausgetauscht werden, bis die Zellen vollständig polarisiert sind. Die Polarisation wird überwacht, indem der transepitheliale elektrische Widerstand oder der Riss des CALU drei LCC mit einem Volter bewertet wird, der kalibriert und getestet wurde. Um diesen Vorgang zu starten, nehmen Sie die Elektrode aus dem Ethanol, trocknen Sie sie fünf bis 10 Sekunden lang an der Luft und spülen Sie die Elektrode mit sterilem EMEM 10%Stellen Sie den Modusschalter des Volters auf die Widerstandseinstellung und schalten Sie das Gerät ein.

Beginnen Sie die Messungen mit den zellfreien Kontrollvertiefungen, um Basismessungen zu erhalten, und fahren Sie dann mit den Messungen für jede Welle fort. Platzieren Sie die Elektrode vorsichtig in einen der drei Ports, die den Zugang zum basolateralen Kompartiment der Transwell-Kultur ermöglichen. Platzieren Sie die Elektrode so, dass die längere Leitung nur leicht den Boden der äußeren Vertiefung berührt und senkrecht bleibt.

Und die kürzere Elektrode befindet sich im Gewebekulturmedium des apikalen Kompartiments, ohne die Einsatzmembran zu berühren. Drücken Sie die Messtaste R und warten Sie, bis sich der Messwert stabilisiert hat. Wiederholen Sie den Vorgang für die beiden anderen Ports für jede Vertiefung, und zeichnen Sie die Messungen an allen drei Anschlüssen für insgesamt drei Messungen pro Vertiefung auf, um sicherzustellen, dass die Polarisation abgeschlossen ist. Ein sekundärer Assay zur Messung der passiven Natriumfluoresceindiffusion zwischen den apikalen und basolateralen Kompartimenten wird an ein bis drei Transwell-Kulturen durchgeführt.

Entfernen Sie vorsichtig das Medium sowohl aus den basalen lateralen als auch aus den apikalen Kompartimenten der Transwell-Kulturen, die getestet werden sollen. Spülen Sie Transwell-Kulturen, indem Sie vorsichtig 600 Mikroliter steriles DPBS bei Raumtemperatur in die basolateralen Kompartimente und 100 Mikroliter steriles DPBS bei Raumtemperatur in die apikalen Kompartimente geben. Entfernen Sie DPBS vorsichtig aus den Vertiefungen.

Geben Sie 600 Mikroliter sterilen nicht fluoreszierenden Puffer in die basolateralen Kompartimente, gefolgt von 100 Mikrolitern sterilem Natriumfluorescein in die apikalen Kompartimente. Inkubieren Sie die Platte eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius. Nach einer Stunde.

Übertragen Sie die nicht fluoreszierende Pufferprobe aus dem basolateralen Kompartiment jedes Testtranswells in ein separates sauberes Röhrchen. Zur Analyse die Testtranswells, die zur Untersuchung der passiven Natriumfluoresceindiffusion verwendet werden, von der Platte entfernen und verwerfen. Stellen Sie die Platte mit den restlichen Transwells wieder in den Inkubator ein.

Geben Sie 100 Mikroliter jeder zuvor hergestellten Natriumfluorescein-Standardlösung in dreifacher Ausfertigung in eine 96-Well-Platte mit flachem Boden. Bereiten Sie drei Verdünnungen jeder basalen lateralen Probe in nicht fluoreszierendem Puffer vor. Geben Sie für jede Probe 100 Mikroliter einer unverdünnten Probe und 100 Mikroliter jeder Verdünnung in doppelter Ausführung in eine 96-Well-Platte mit flachem Boden.

Messung der Probenabsorption auf einem EISA-Plattenlesegerät bei 486 Nanometern oder 490 Nanometern. Um dieses Verfahren zu beginnen, waschen Sie zuerst Zellen und serumfreies EMEM mit einer Kapillarpipette, die an einer Vakuumfalle befestigt ist, saugen Sie mit einem sanften Vakuum vorsichtig Medium aus allen Vertiefungen an, entfernen Sie das apikale Medium, gefolgt von dem basolateralen Medium, aspirieren Sie das Medium aus den zellfreien Vertiefungen A eins und D eins und dann aus den ausgesäten Vertiefungen. Berühren Sie die Einlegemembranen nicht, während Sie das Medium ansaugen.

Geben Sie 100 Mikroliter serumfreies EMEM in das apikale Kompartiment der zellfreien Vertiefungen A eins und D eins und dann in die sitzenden Vertiefungen, die das Medium in das apikale Kompartiment leiten. Verwenden Sie die Seite des Einsatzes, um die Pipettenspitze zu führen. Geben Sie kein Medium direkt auf die Zellen und berühren Sie nicht die Einsatzmembran.

Als nächstes werden 600 Mikroliter Serum frei EMEM in die basolateralen Kompartimente gegeben. Geben Sie Medium in jede Trans-Vertiefung, indem Sie die Pipette gegen die Wand des Fachs anwinkeln und das Medium langsam in die Vertiefung abgeben. Saugen Sie das serumfreie Medium vorsichtig aus den Vertiefungen an. Beginnend mit nicht infizierten oder scheininfizierten Vertiefungen fügen Sie die folgenden Virusverdünnungen in das apikale Kompartiment der entsprechenden trans-Vertiefungen hinzu.

100 Mikroliter serumfreies EMEM für nicht infizierte Vertiefungen. 100 Mikroliter virusfreies Präparat, verdünnt in serumfreiem EMEM für scheininfizierte Vertiefungen und 100 Mikroliter Virus, verdünnt in serumfreiem EMEM für Viren. Danach bei 600 Mikrolitern Serum freies EMEM in alle basolateralen Kompartimente inkubieren, zwei Stunden lang bei 37 Grad Celsius und 7 % Kohlendioxid inkubieren.

Nach zwei Stunden aspirieren Sie Medium aus Vertiefungen, zuerst aus nicht infizierten und simulierten infizierten Vertiefungen und dann aus infizierten Vertiefungen. Zuerst apikale Überstände entfernen, gefolgt von basalen lateralen Überständen. Ersetzen Sie schließlich das Medium durch 200 Mikroliter EMEM, 10 % in den apikalen Kompartimenten und 600 Mikroliter EMEM 10 % in den basolateralen Kompartimenten, indem Sie der in diesem Video gezeigten Methode folgen.

Der transepitheliale elektrische Widerstand oder Riss von calu drei flüssig bedeckten Kulturen erreicht innerhalb von drei Wochen nach der Aussaat ein Plateau bei oder über 1000 m x Quadratzentimeter. Ein Beispiel dafür ist in dieser Abbildung dargestellt, da die zwischen polarisierten Zellen gebildeten Tight Junctions das passive Gleichgewicht kleiner Moleküle zwischen dem apikalen und dem basolateralen Kompartiment verhindern. Ein modifizierter Natriumfluoreszenz-Äquilibrierungsassay wird verwendet, um die Polarisation von Calu-Drei-Flüssig-bedeckten Kulturen zu bestätigen.

Da die Schicht von Calu, drei Zell-Monolagen und Flüssigkulturen zunimmt, nimmt die Menge an Fluorescein, die sich passiv in das basolaterale Kompartiment ausgleicht, ab. Hier werden kumulative Daten aus vier unabhängigen Experimenten präsentiert, und jeder Datenpunkt stellt eine individuelle Messung dar. Sobald der Riss 1000 im Besitz eines Zentimeters im Quadrat ist, beträgt die Menge an Fluorescein, die sich in das BA-Basolateral-Kompartiment äquilibriert, kleiner oder gleich 1 %. Daher gelten drei mit Flüssigkeit bedeckte Kulturen als vollständig polarisiert, wenn die Schicht größer oder gleich 1000 im Besitz eines Zentimeters im Quadrat ist. Sobald die Stufe der mit Flüssigkeiten bedeckten Calu-3-Kulturen ein Plateau bei oder über 1000 im Besitz eines Quadratzentimeters erreicht, ist das Modell bereit, zur Untersuchung der Reaktionen von Epithelzellen der Atemwege auf respiratorische Krankheitserreger verwendet zu werden, einschließlich des Respiratorischen Synzytial-Virus oder RSV, wie gezeigt.

In diesem Beispiel führt die Exposition gegenüber RSV, dargestellt in Rot, zu einem schnelleren Rückgang der polarisierten Kultur. Die Integrität im Vergleich zu einer Scheininfektion von Zellen, die in den blauen Daten dargestellt sind, wird als mediane Resistenz von acht unabhängigen Wells pro Infektion plus oder minus SEM pro Zeitpunkt dargestellt. Das Sternchen zeigt einen P von weniger als 0,05 zwischen Schein- und RSVA-infizierten Kulturen an, wie durch den T-Test-Test des Studenten bestimmt.

Vergessen Sie nicht, wenn Sie mit Infektionserregern arbeiten, dass diese gefährlich sein können, und Sie sollten geeignete PSA tragen und bei der Durchführung dieser Verfahren gute Laborpraktiken anwenden.