Name: Aufbau einer Liquid-bedeckten Kultur Polarized Menschliche Airway Epithelial Calu-3-Zellen, um Host-Zell-Antwort, um Atemwegspathogene Studie In-vitro- (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 9 s
Description: Lernen Sie den Aufbau polarisierter Calu-3-Zellkulturen im Transwell-System zur Untersuchung von Atemwegsepithelfunktionen. TEER-Messungen und Natriumfluoreszein-Assays bestätigen die Barrierenintegrität.

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Die Autoren danken Elisabeth Blanchard für ihre technische Unterstützung danken. Die Erkenntnisse und Schlussfolgerungen in diesem Bericht sind die der Autoren und stellen nicht notwendigerweise die Ansichten der Centers for Disease Control and Prevention.

Ein. Kultivierung Calu-3 Zellen zur Verwendung in Transwell Kulturen Sicherheitshinweise: Führen Sie alle in einer biologischen Sicherheitswerkbank mit sterilen Kultur Technik. <ol><li> Um Zellen aus Gefrierlagerung auftauen: <ol><li> Planen Eagles Minimum Essential Medium mit 20% hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum (FBS), 0,1 mM nicht-essentielle Aminosäuren, 2 mM L-Glutamin, und 10 mM HEPES pH 7,4 (EMEM-20% + S). Sterile-Filter das vorbereitete Medium unter Verwendung eines 0,2 &amp;mgr; m Porengröße Filter, und warm in einem Wasserbad auf 37 ° C. Genauer reflektierende des in situ Atemwegsepithel Umgebung wird Mediums nicht mit Antibiotika oder Antimykotika ergänzt. </li><li> Auftauen eine gefrorene Kryoröhrchen von Calu-3-Zellen schnell (&lt;1 min) in einem 37 ° C Wasserbad. </li><li> Übertragen der aufgetauten Zellen auf eine 50 ml sterile konische Röhre und 30 ml erwärmten EMEM-20% + S. </li><li> Pelletieren der Zellen durch Zentrifugation für 5 min bei 1000-1200 × g,ohne Kühlung und mit geringem Steuerdruck Geschwindigkeit. </li><li> Den Überstand umfüllen sanft und die Zellen in 5 ml erwärmter EMEM-20% + S durch vorsichtiges Auf-und Abpipettieren. Seed 2 bis 5 × 10 6 Zellen pro Vertiefung in einer 6-Well Gewebekulturplatte und bei 37 ° C, 7% CO 2 in Luft-Atmosphäre, bis die Zellen 75% - 80% konfluent. Überprüfen Sie täglich, bis zu 7 Tage erforderlich sein. Alle 3-4 Tage saugen das Medium aus den Zellen und ersetzen Sie es mit frischen EMEM-20% + S. </li></ol></li><li> Um Subkultur Zellen: <ol><li> Warm 0,05% Trypsin - 0,02% EDTA in einem 37 ° C warmen Wasserbad. Absaugen Mediums von den Zellen und wäscht die Zellen einmal mit 0,05% Trypsin erwärmte - 0,02% EDTA, um überschüssiges Medium und Serum zu entfernen. Entfernen Sie die Wasch-und 1 ml erwärmt Trypsin pro Well zu den Zellen. </li><li> Bei 37 ° C und 7% CO 2 und unter einem Mikroskop Monitor alle 5 min, bis mindestens 75% der Zellen aus der Wanne (n) der Gewebekulturplatte abzulösen. Dies kannnehmen zwischen 5 und 30 min. </li><li> Waschen der Zellen in EMEM-20% + S, um überschüssiges Trypsin zu entfernen. Übertragung der Zellen auf eine trypsinisierte 50 ml sterile konische Röhre. Mehrere Vertiefungen von Zellen aus einer 6-Well-Kulturplatte können in ein steriles 50 ml konischen Röhrchen gepoolt werden. 30 ml EMEM-20% + S und Pellet der Zellen durch Zentrifugation bei 1000-1200 xg, ohne Kühlung, und mit geringem Bremsgeschwindigkeit. </li><li> Den Überstand umfüllen sanft und die Zellen in frischem EMEM-20% + S durch vorsichtiges Auf-und Abpipettieren. Mit Schritte 1.2.1 bis 1.2.3 oben, um Zellen trypsinieren weiterhin Subkultur Zellen in Zellkulturschalen wie in den Schritten 1.2.5 bis 1.2.7 beschrieben, wenn sie zwischen 75 sind - 80% konfluent. </li><li> Subkultivierung von einem Well einer 6-Well-Platte bis zu einem T-25-cm 2-Kolben, in einem Endvolumen von 5 ml 20%-EMEM + S, Säen zwischen 0,5 bis 1 × 10 6 Zellen / Kolben. </li><li> Mit 5 ml erwärmt Trypsin pro T-25 cm 2-Kolben, um Zellen, Subkultur lösenaus einem T-25-cm 2-Kolben bis zu einem T-75-cm 2-Kolben, in einem Endvolumen von 10 ml-20% EMEM + S, Säen von 1 bis 5 × 10 6 Zellen / Kolben. </li><li> Mit 8 ml erwärmt Trypsin pro T-75 cm 2-Kolben, um Zellen, Subkultur von einem T-75 cm 2-Kolben lösen in 2 T-75 cm 2-Kolben. Für ein optimales Zellwachstum, nicht Subkultur Zellen in Kolben größer als T-75 cm 2 oder Subkultur in einem Verhältnis größer als 1 übergeordneten Kolben: 3 neue Flaschen. </li></ol></li><li> Sobald Zellen wurden subkultiviert, vollständig zu entfernen und zu ersetzen Medium alle 2 bis 3 Tage, bis sie 75-90% Konfluenz erreichen. Zellen können bis zu 3 Wochen zu 75-90% Konfluenz erreichen. Für eine optimale Erzeugung polarisierten Kulturen, Subkulturen Zellen, bevor sie wachsen über 90% Konfluenz als Monolayer. </li><li> Weiterhin Subkultur Zellen, bis genügend Zellen auf Saatgut der gewünschten Anzahl von Einsätzen Transwell gewachsen sein. Jeder Transwell-Einsatz benötigt 2 × 10 5 Zellen. Für eine optimale Leistung Erzeugen polarisierten Kulturen, Zellen verwenden, die nicht mehr als 10 Subkulturen unterzogen wurden. </li></ol> 2. Wachsende Polarized Calu-3 Liquid-bedeckten Kulturen (LCC) Sicherheitshinweise: Führen Sie alle in einer biologischen Sicherheitswerkbank mit sterilen Kultur Technik. <ol><li> Planen EMEM mit 10% FBS (EMEM-10%) und warm in einem Wasserbad auf 37 ° C. </li><li> Bereiten Sie eine 24-Well-Transwell Platte für die Aussaat. Mit einer sterilen Pinzette bewegen Transwell Einsätze aus dem Inneren zum Äußeren Reihen der Platte ohne den Einsatz Membran. Zellen sollten nur in die Vertiefungen auf den äußeren Reihen der Platte subkultiviert werden. Um die Einführung der Luftblasen in die basolateralen Kompartimenten verhindern, fügen 600 ul EMEM-10% zu jedem durch Abwinkeln der Pipette gegen die Wand jedes Abteil und langsam freisetzenden das Medium in das Bohrloch. </li><li> Nehmen Zellen aus T-75 cm 2 Gewebe. Subculture Flaschen mit warmen Trypsin, waschen und in 30 ml EMEM-20% + S pro alle 2 Flaschen des trypsinierten Zellen, wie in Schritt 1.2 beschrieben. </li><li> Gründlich resuspendieren gewaschenen Zellen in 5 ml EMEM-10% durch vorsichtiges Auf-und Abpipettieren. </li><li> Nachweis lebensfähiger und insgesamt Zellzahlen von der Trypanblau-Methode. Fahren Sie nur fort, wenn 80% - 90% lebensfähig sind. </li><li> In einem 50 ml konischen Röhrchen sterile, verdünnte Zellen auf eine Konzentration von 2 × 10 6 lebensfähigen Zellen / ml mit 10% EMEM-. </li><li> Hinzufügen von Zellen auf der apikalen Kammer jeder Transwell. Um Vertiefungen A1 und D1, die zellfreie Kontrollvertiefungen, dass Rohlinge ist, fügen Sie 100 ul EMEM-10% ohne Zellen sein wird. Zu jedem der verbleibenden Vertiefungen werden 100 ul resuspendierten Calu-3-Zellen, die Pipette vorsichtig Angelgewässer gegen die innere Führungskanal der Einsatzwand und langsam freisetzende die Zellen. Berühren Sie nicht die Pipette mit dem Einsatz Membran. Um eine homogene Suspension von Calu-3-Zellen erhalten, die leicht bewegen Zellsuspensionwährend dieser Seeder Schritt. </li><li> Inkubieren Transwell Platte bei 37 ° C und 7% CO 2 in Luft-Atmosphäre. Legen Sie die Platte in einem Brutschrank, wo physische Störungen minimal sein wird. Um die Effizienz der Polarisation zu verbessern, nicht stapeln Platten auf der jeweils anderen. </li><li> Um Kulturen zu halten, bis polarisiert und bereit, in den Experimenten zu verwenden, vollständig ersetzen Medium in Transwells, wie in den Schritten 2,10 bis 2,13 beschrieben. Medium sollte vollständig drei Tage nach sie in Transwells subkultiviert ersetzt werden, und dann auf einem alternierenden Zyklus zwischen dem vierten und dann dritten Tag nach der letzten Fütterung, bis die Zellen vollständig polarisiert sind. </li><li> Warm EMEM-10% in einem Wasserbad auf 37 ° C. </li><li> Vorsichtig absaugen Medium von Transwell-Einsätze. Mit einem Kapillarpipette an einer Vakuumfalle mit einem leichten Vakuum, oder mit einem Standard 1 ml Pipette Aspirat Mediums aus zellfreien Vertiefungen A1 und D1, dann von Vertiefungen ausgesät, zunächst Entfernen apikalen Mediums von allen Vertiefungen und then Entfernen basolateralen Medium aus allen Wells. Berühren Sie nicht einfügen Membranen während Absaugen Medium. </li><li> Hinzufügen 200 ul EMEM-10% auf die apikale Kompartiment von zellfreien Vertiefungen A1 und D1, dann in die Vertiefungen ausgesät, Leiten des Mediums in die apikale Kompartiment mit der Seite des Einsatzes, um die Pipettenspitze zu führen. Fügen Sie nicht Mediums direkt auf Zellen, und berühren Sie nicht die Einlage Membran. </li><li> Fügen Sie 600 ul EMEM-10% auf den basolateralen Kompartimenten. Um die Einführung der Luftblasen in die basolateralen Kompartimenten verhindern, fügen Mediums zu jedem durch Abwinkeln der Pipette gegen die Wand jedes Abteil und langsam freisetzenden das Medium in das Bohrloch. </li></ol> 3. Auswertung Resistance Entwicklung von Calu-3 LCC Sicherheitshinweise: Führen Sie alle in einer biologischen Sicherheitswerkbank mit sterilen Kultur Technik. <ol><li> Bewerten transepithelialen elektrischen Widerstandes (TEER) von Calu-3 LCC 30 min nachMedium ändert; die Auswertung nach jedem Mediumwechsel durchgeführt werden können, falls gewünscht. Führen Sie Messungen unter sterilen Bedingungen. Beginnen Messungen mit der zellfreie Kontrollvertiefungen A1 und D1 (die Zuschnitte) an Baseline-Messungen zu erhalten, und weiterhin mit Messungen für jede Vertiefung. <ol><li> Unter sterilen Bedingungen übertragen die STX2 Elektrode auf eine 50 ml Zentrifugenröhrchen mit 70% Ethanol in sterilem Wasser und 15 min sterilisiert. </li><li> Kalibrieren und testen Sie die voltohmmeter für die Verwendung gemäß den Anweisungen des Herstellers. </li><li> Nehmen Sie die Elektrode aus dem Ethanol, an der Luft trocknen 5-10 sec, und spülen Sie die Elektrode mit sterilen EMEM-10%. </li><li> Stellen Sie den Modus-Schalter des voltohmmeter, um den Widerstand Einstellung, und schalten Sie ON. </li><li> Sanft die Elektrode in einer der drei Anschlüsse, die Zugriff zu erlauben in die basolaterale Kompartiment einer Transwell Kultur. Die Elektrodenspitze so dass der längere Vorsprung nur leicht berührt den Boden der äußeren Wanne und bleibt vertikal,und die kürzere Blei im Gewebekulturmedium der apikalen Kammer, ohne den Einsatz Membran. </li><li> Drücken Sie &quot;Measure R&quot;-Taste, und warten Sie für das Lesen zu stabilisieren. Wiederholen für die anderen zwei Ports für jede Vertiefung und Aufzeichnen der Messungen von allen drei Anschlüssen, also insgesamt aus drei Messungen pro Vertiefung. Weiter, um den Widerstand für alle Vertiefungen der Zellen zu messen. </li><li> Die Elektrode durch Tränken 5 bis 10 min in 70% Ethanol, Spülen in sterilem dH 2 O und Trocknen gründlich. In der Originalverpackung aufbewahren. </li><li> Berechnen des Widerstands jedes Wells, unter Verwendung von Gleichung 1. Ω Ist = Ω Probe - Ω blank, Gleichung 1 wo Ω Probe ist die durchschnittliche Messung von einem seeded gut und Ω blank ist die durchschnittliche Messung von der 2 Brunnen, A1 und D1, die Einsätze und mittlere, aber keine Zellen. </li><li> Berechnen Sie die Flächeneinheit Widerstand, mit Equation 2. Ω tatsächlichen × effektiven Membranfläche = Ω × cm 2, Gleichung 2 wo die effektive Membranfläche beträgt 0,33 cm 2 für 24-Well-Transwell-Einsätze. </li></ol></li><li> Überprüfen, ob Polarisation ist durch Durchführen einer sekundären Assay vollständig, Messen Natriumfluorescein passive Diffusion zwischen den apikalen und basolateralen Kompartimenten, auf ein bis drei Transwell Kulturen. Die Vertiefungen für den Assay verwendet Natriumfluorescein ist unmittelbar nach Beendigung des Tests zu verwerfen. <ol><li> Planen nicht fluoreszierenden Puffer (118 mM NaCl; 4,75 mM KCl; 2,53 mM CaCl 2 · 2H 2 O; 2,44 mM MgSO4; 1,19 mM KH 2 PO 4, 25 mM NaHCO 3 in sterilem Wasser; Sterilfilter mit 0,45 um Filtrationsvorrichtung ). Bereiten Natriumfluorescein bei 1 mg / ml in nicht-fluoreszierenden Puffer, Sterilfilter, in Alufolie wickeln und bei 4 ° C, vor Licht geschützt. Warm, um Raum-temperaturre vor der Verwendung. </li><li> Nach Abschluss Widerstandsmessungen, vorsichtig Mediums aus beiden basolateralen und apikale Kammern von einem bis drei einzelnen Transwell Kulturen. </li><li> Spülen Transwell Kulturen. Sanft hinzuzufügen 600 ul sterilem Raumtemperatur Dulbeccos PBS (D-PBS) in die basolateralen Kompartimenten und 100 ul sterilem Raumtemperatur D-PBS zu den apikalen Kompartimenten. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig D-PBS aus Brunnen. Fügen Sie 600 ul sterilem nicht-fluoreszierenden Puffer zu den basolateralen Kompartimenten. Fügen Sie 100 ul sterilem 1 mg / ml Natrium-Fluorescein an die apikalen Fächern. </li><li> Inkubieren der Platte bei 37 ° C für 1 Stunde. CO 2 ist während dieser Inkubationszeit erforderlich. </li><li> Während der Inkubation, bereiten Sie einen Natriumfluorescein Standardkurve zwischen 20 pg / ml und 0 pg / ml, mit nicht-fluoreszierenden Puffer Natriumfluorescein verdünnen. Planen mindestens 8 verschiedenen Konzentrationen von Natriumfluorescein, die jeweils in einem Endvolumen von mindestens 600 ul. HaltenStandardkurve Verdünnungen von leichten bis zu seiner Absorption messen geschützt. </li><li> Übertragen der nicht-fluoreszierenden Probe aus dem Puffer basolaterale Kompartiment jedes Tests zu einem separaten Transwell sauberes Röhrchen für die Analyse. Nehmen Sie den Test Transwells verwendet, um passive Natriumfluorescein Diffusion aus der Platte zu prüfen und zu verwerfen. Bringen Sie die Platte mit den restlichen Transwells in den Inkubator. </li><li> Zeigen 100 ul jeder Standardlösung in dreifacher Ausfertigung in eine 96-Well-Flachboden-Platte. </li><li> Bereiten Sie drei Verdünnungen von jedem basolateralen Probe (1:2, 1:20 und 1:50) in nicht-fluoreszierenden Puffer und 100 ul jeder unverdünnten Probe und jeder Verdünnung, in zweifacher Ausfertigung, in eine 96-Well-Flachbild- Bodenplatte. </li><li> Maßnahme Probenabsorption auf einem ELISA-Plattenlesegerät bei 486 nm oder 490 nm beträgt. </li><li> Bestimmung der Konzentration von Natrium-Fluorescein im basolaterale Kompartiment durch Vergleich der Absorption der Proben gegen die Absorptionswerte für die Natriumfluorescein strAndard Kurve. </li></ol></li></ol> 4. Infizieren Polarized Calu-3 LCC mit Respiratory Virus Sicherheitshinweise: Führen Sie alle in einer biologischen Sicherheitswerkbank mit sterilen Kultur-Technik, einer Sicherheitsstufe geeignet für das Virus verwendet wird. <ol><li> Verdünnte Virus in serumfreiem EMEM so daß gewünschte Inocula in 100 ul wäre. </li><li> Waschen der Zellen in serumfreiem EMEM. Vorsichtig absaugen Medium aus allen Vertiefungen, die Beseitigung der apikalen Medium dann den basolateralen Medium. Mit einem Kapillarpipette an einer Vakuumfalle mit einem leichten Vakuum, oder mit einem Standard 1 ml Pipette Aspirat Mediums aus zellfreien Vertiefungen A1 und D1, dann von Vertiefungen ausgesät, das Entfernen des ersten apikalen Mediums von allen Vertiefungen, und dann Entfernen der basolateralen Medium aus allen Wells. Berühren Sie nicht einfügen Membranen während Absaugen Medium. <ol><li> Je 100 ul serumfreiem EMEM zum apikalen Abteil zellfreie Vertiefungen A1 und D1 und dann zu ter Vertiefungen ausgesät, Leiten Mediums in die apikale Kompartiment mit der Seite des Einsatzes, um die Pipettenspitze zu führen. Fügen Sie nicht Medium direkt auf Zellen, und berühren Sie nicht die Einlage Membran. </li><li> Hinzufügen 600 ul serumfreiem EMEM der basolateralen Kompartimenten. Hinzufügen zu jedem Medium Transwell durch Abwinkeln der Pipette gegen die Wand der Kammer und das langsam freisetzende Mittel in das Bohrloch. </li><li> Vorsichtig absaugen serum-freiem Medium aus Brunnen. </li></ol></li><li> Beginnend mit infizierten oder Mock-infizierte Brunnen, fügen Sie entsprechende Virus-Verdünnungen zur apikalen Kompartiment Transwells. Für nicht infizierten Vertiefungen werden 100 ul serumfreiem EMEM zum apikalen Kammer geeigneter Transwells zum Schein infiziert Vertiefungen werden 100 ul virusfreie Präparation in serumfreiem EMEM zum apikalen Kammer geeigneter Transwells verdünnt und für Virusinfektion, verdünnter Virus in serumfreiem EMEM und 100 ul der apikale Kammern geeigneter Transwells. </li><li>Fügen Sie 600 ul serumfreiem EMEM allen basolateralen Kompartimenten. </li><li> Bei 37 ° C und 7% CO 2 für 2 Stunden. </li><li> Absaugen Medium aus Brunnen, zuerst von infizierten und Mock-infizierte Brunnen, dann von infizierten Brunnen. Entfernen apikalen Überstände erstens durch basolateralen Überstände gefolgt. </li><li> Ersetzen Medium mit 200 ul EMEM-10% in den apikalen Fächern und 600 ul EMEM-10% in den basolateralen Kompartimenten. </li></ol>

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</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Beim Aufbau Calu-3 LCC in Transwell Einsätze können Zellen überhaupt nicht polarisieren, oder nicht vollständig polarisiert, wie durch eine definierte TEER ≥ 1000 Ω x cm 2 und ≤ 1% Natrium Fluoresceinfarbstoff Äquilibrierung zwischen den apikalen und basolateralen Kompartimenten. Zusätzlich kann Calu-3-Zellen in LCC vollständig polarisieren, aber TEER können inkonsistent zwischen Messungen. Obwohl Schwankungen TEER Messungen von Calu-3 LCC normalen von Tag zu Tag sind, werden einmal vollständig polarisiert, dramatische Schwankungen in TEER nicht zu erwarten, bis die Kultur natürlich mit dem Alter abnimmt, was kann so wenig wie 5 Wochen oder so lange wie 12 Wochen nach der Aussaat. Die Fähigkeit von Calu-3 LCC zu polarisieren hängt teilweise wie Zellen subkultiviert werden beibehalten und vor Einsatz in der Transwell-System. Zellen, die über 90% Konfluenz als Monolayer während Subkultivierung geworden, die vor mehr als 10 mal aus gefrorenen Vorrat subkultiviert, oder die haben nichten mit frischem Medium in regelmäßigen Abständen zugeführt sind weniger wahrscheinlich, vollständig zu polarisieren, und beliebige Polarisation ist wahrscheinlich schnell sinken. Unvollständige oder völliges Fehlen der Polarisation kann auch auf eine Veränderung der Material-und Porengröße von Transwells für Calu-3 LCC verwendet zugeschrieben werden, und viel zu viel Variation in Transwells ähnlicher Zusammensetzung und die Porengröße kann auch Auswirkungen auf Polarisation. Größere Porengrößen ermöglichen Calu-3 durch die Transwell Membran in der basolateralen Kompartiment wachsen, Verhinderung der Kultur aus polarisieren. Ein Fehlen der Polarisation kann auch durch bakterielle Wachstum, angedeutet durch getrübte Kulturmedium, das anschließende Aufteilung der Tight Junctions zwischen Calu-3-Zellen führt. Variable TEER Messungen von Calu-3 LCC kann durch mechanische Störungen der Calu-3 LCC Zellmonoschichten, die Einsätze oder die Platten selbst verursacht werden. Medium Änderungen und TEER-Messungen sollten ohne Pipettenspitzen oder elektro durchgeführt werdende führt die Berührung der Zellen. Während der Durchführung dieser Operationen ist darauf zu vermeiden Einführen von Luftblasen in den apikalen und basolateralen Kompartimenten, die die Fähigkeit des voltohmmeter um Widerstand detektieren stören wird. Die Fähigkeit des voltohmmeter Resistenz in einem Kulturmedium, das tatsächlich polarisierten detektieren kann auch durch Protein Anhaftungen an den Elektrodenleitungen begrenzt. Dieser Aufbau kann unter leichtem Schleifen entfernt werden, oder kann durch Ersetzen der Elektrode behoben werden. Sobald Calu LCC-3 vollständig zu polarisieren und das nicht mehr TEER zunehmende sind Calu LCC-3 zur Verwendung als ein in vitro-Modell zur Charakterisierung Host Lungenepithelzellen Zellantworten auf Atemwegsinfektion bereit. Dieses System erlaubt eine bessere Charakterisierung der Erreger gerichtete Reaktion auf gegenüber Monoschicht kultivierten Zelllinien Lunge traditionell zur respiratorischen Erreger wie A549 und HEp-2-Zellen zu untersuchen, mit den zusätzlichen Vorteilen Calu-3 LCC being schneller zu entwickeln, leichter erhältlich und billiger zu erzeugen als primäre, polarisierten, differenzierten NHBE. Ähnlich NHBE, polarisiert Calu-3 zeigen, tight junction Bildung und produzieren Schleimstoffe. Doch im Gegensatz zu NHBE, nicht polarisierte Calu-3-Zellen nicht in Schichten von Basalzellen und Flimmerepithel cylindrischen Epithelzellen differenzieren, und nur wenige polarisierten Calu-3-Zellen zu entwickeln Zilien Fortsätze 19. So, obwohl nützlich für die Prüfung polarisierte Reaktionen der Atemwege Epithelzellen der Atemwege Beleidigung, sind polarisiert Calu-3 LCC nicht ein ideales Modell der Atemwege Entwicklung oder Umgestaltung in Reaktion auf Atemwege Beleidigung oder Verletzung zu untersuchen. Schleim Produktion von kultivierten Zellen in vitro kann Auswirkungen auf zellulärer Infektiosität sowie Freisetzung von infektiösen Viren und Virus-Ausbreitung in einem polarisierten Modell und einen direkten Vergleich der Schleimproduktion zwischen polarisierten Calu-3 LCC und polarisiert, differenzierte NHBE wurde nicht berichtet . A549 und HEp-2-Zellen are Kultur leichter als Calu-3-Zellen, jedoch im Gegensatz Calu-3 LCC, bilden sie keine polarisierten Kulturen, wenn auf Transwell Einsätze gewachsen, und sind somit nicht ideale Modelle zur Untersuchung in vitro die Reaktionen der polarisierte Epithelzellen der Atemwege Virusinfektion .

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> REAGENZIEN </td></tr><tr><td> Calu-3 </td><td> ATCC </td><td> HTB-55 </td><td></td></tr><tr><td> 0,05% Trypsin - 0,02% EDTA </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 25300 </td><td></td></tr><tr><td> Eagle Minimum Essential Medium (EMEM) </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 07-00100DK </td><td></td></tr><tr><td> Fötales Rinderserum (FBS) </td><td> HyClone </td><td> SH30070.03 </td><td> Hitze-Inaktivierung, 56 ° C, 30 Min. </td></tr><tr><td> Nicht-essentielle Aminosäuren 100X (10 mM) </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 11140 </td><td> Lagerung bei 4 ° C im Dunkeln </td></tr><tr><td> L-Glutamin </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 25030 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 15630 </td><td></td></tr><tr><td> EMEM-10% FBS (EMEM-10%) </td><td></td><td></td><td> Supplement EMEM mit hitzeinaktiviertem FBS bis 10% Serum, steril-Filter </td></tr><tr><td> EMEM-20% FBS + Ergänzungen (EMEM-20% + S) </td><td></td><td></td><td> Supplement EMEM um Endkonzentrationen: hitzeinaktiviertes FBS, 20%; 1X Aminosäuren; 2 mM L-Glutamin, 10 mM HEPES; sterilen-Filter </td></tr><tr><td> 24-Well-Platten Transwell </td><td> Corning Costar </td><td> 3472 </td><td> 3 um Porengröße, Polyester </td></tr><tr><td> Trypanblau </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 15250 </td><td></td></tr><tr><td> Ethanol </td><td> Sigma </td><td> E7023 </td><td> Bereiten Sie sich 70% unter Verwendung von sterilen dH 2 O </td></tr><tr><td> Dulbeccos PBS (D-PBS) </td><td> Invitrogen </td><td> 14040 </td><td></td></tr><tr><td> Nicht-fluoreszierenden Puffer </td><td></td><td></td><td> 118 mM NaCl;4,75 mM KCl; 2,53 mM CaCl 2 · H 2 O; 2,44 mM MgSO4; 1,19 mM KH 2 PO 4, 25 mM NaHCO 3 in sterilem Wasser; sterilen-Filter </td></tr><tr><td> Natriumfluorescein </td><td> Sigma </td><td> 6377 </td><td> 1 mg / ml in sterile nicht-fluoreszierenden Puffer; sterile-Filter, vor Licht schützen; bei 4 ° C bis zu 6 Monaten </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> EQUIPMENT </td></tr><tr><td> Voltohmmeter </td><td> World Precision Instruments </td><td></td><td></td></tr><tr><td> STX2 Elektrode </td><td> World Precision Instruments </td><td></td><td></td></tr><tr><td> ELISA-Reader </td><td></td><td></td><td> Für die Messung von A 486 oder A 490 </td></tr></tbody></table>

aufbau einer liquid-bedeckten kultur polarized menschliche airway epithelial calu-3-zellen, um host-zell-antwort, um atemwegspathogene studie<em&gt; in-vitro-</em

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

Die apikalen und basolateralen Oberflächen Epithelzellen der Atemwege nachzuweisen direktionale Antworten auf Erregers Exposition in vivo. So, ideal in vitro Modellen zur Untersuchung zellulärer Reaktionen auf Atemwegspathogene polarisieren, bilden apikalen und basolateralen Oberflächen. Ein solches Modell ist normale menschliche Bronchialepithelzellen (NHBE) differenziert. Jedoch erfordert dieses System Lungengewebe Proben, Fachkenntnisse Isolierung und Kultivierung epithelialer Zellen aus Gewebe, und die Zeit, um ein Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche Kultur erzeugen. Calu-3-Zellen, aus einer menschlichen Bronchien Adenokarzinom abgeleitet sind eine alternative Modell zur Untersuchung der Reaktion von proximalen Atemwegsepithelzellen die Atmungsorgane Insult 1, pharmakologischen Verbindungen 2-6 und 7-9 bakterielle und virale Pathogene, einschließlich Influenzavirus, Rhinovirus und schwere akute respiratorische Syndrom - assoziierte Coronavirus 10-14. Kürzlich, we gezeigt, dass Calu-3-Zellen anfällig Respiratory Syncytial Virus (RSV)-Infektion in einer Weise, die mit NHBE 15,16 sind. Hier stellen wir ausführlich die Einrichtung einer polarisierten, flüssige verschneiten Kultur (LCC) von Calu-3-Zellen, die sich auf die technischen Details des Anbaus und der Kultivierung Calu-3-Zellen, die Aufrechterhaltung Zellen, die in LCC kultiviert wurden, und wir, die Verfahren zum Durchführen von respiratorischen Virusinfektionen des polarisierten Calu-3-Zellen. Um eine gleichbleibend zu erhalten polarisierten Calu-3 LCC, Calu-3-Zellen müssen vor Kultivierung in Transwell Einsätze subkultiviert werden. Calu-3 Monolayerkulturen sollte unter 90% Konfluenz zu bleiben, sollte subkultiviert weniger als 10-mal aus gefrorenem Lager ist, und sollten regelmäßig mit frischem Medium versorgt werden. Einmal in Transwells kultiviert, muss Calu-3 LCC mit Vorsicht behandelt werden. Unregelmäßige Medienwechsel und mechanische oder physikalische Unterbrechung der Zellschichten oder Platten negativ beeinflussen Polarisation fürmehrere Stunden oder Tage. Polarisation wird durch Auswertung transepithelialen elektrischen Widerstandes (TEER) überwacht und durch Auswertung des passiven Äquilibrierung von Natriumfluorescein zwischen den apikalen und basolateralen Kompartimenten 17,18 verifiziert. Sobald TEER Plateaus bei oder über 1.000 Ω × cm 2, Calu-3 LCC einsatzbereit, um zelluläre Reaktionen auf Atemwegspathogene untersuchen.

Wenn sie als Flüssigkeit bedeckten Kulturen (LCC) in Transwell Kultursystemen gezüchtet, wie in Abbildung 1, Calu-3-Zellen polarisieren, Entwicklung deutliche apikalen und basolateralen Flächen dargestellt. Nach dem hier beschriebenen Verfahren, erreicht der transepithelialen elektrischen Widerstandes (TEER) von Calu-3 LCC ein Plateau bei oder über 1000 Ω x cm 2 innerhalb von 3 Wochen nach der Aussaat, von denen ein Beispiel in 2 gezeigt wird. Die engen Verbindungen zwischen polarisierten Zellen gebildet zu verhindern passive Äquilibrierung von kleinen Molekülen zwischen den apikalen und basolateralen Kompartimenten. Somit wird eine modifizierte Natriumfluorescein Äquilibrierung Assay verwendet werden, um Polarisation des Calu-3 LCC 15,17,18 bestätigen. Da der TEER von Calu-3 Zellmonoschichten in LCC zunimmt, nimmt die Menge von Fluorescein, die passiv äquilibriert in das basolaterale Kompartiment. Sobald der TEER beträgt 1.000 Ω x cm 2, wobei die Menge von Fluorescein, die in äquilibriertzur basolateralen Abteil ≤ 1%, wie in Abbildung 3 gezeigt, daher sind Calu-3 LCC als vollständig polarisiert ist, wenn der TEER ≥ 1000 Ω · cm 2. Der Gipfel TEER Messung von Calu-3 LCC kann von Experiment zu Experiment variieren. Allerdings, wenn TEER-Werte Plateau für einen bestimmten Experiment, kann ein vollständig polarisiert, nicht infizierten Calu-3 LCC für fünf stabilen bis 12 Wochen nach der Aussaat. Fehlen Resistenzentwicklung in Transwell-kultivierte Calu-3 kann von verschiedenen Faktoren, wie in Tabelle 1 dargelegt verursacht werden. Sobald der TEER von Calu-3 LCC Plateaus bei oder über 1000 Ω x cm 2, ist das Modell nun verwendet, um zu untersuchen Atemwegsepithelzellen Zellantworten auf Atemwegspathogene einschließlich Respiratory Syncytial Virus (RSV). Die Exposition gegenüber RSV führt zu einem raschen Rückgang im polarisierten Kultur Integrität im Vergleich zu einem Mock-Infektion von Zellen (Abbildung 4). Abbildung 1. Querschnittsdarstellung der Transwell-kultivierten Zellen. Zellen werden auf der apikalen Oberfläche des Einsatzes Membran gewachsen. <img alt="Abbildung 2" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50157/50157fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50157/50157fig2.jpg" /> Abbildung 2. Entwicklung des transepithelialen elektrischen Widerstandes (TEER) und Polarisation Calu-3-Zellen nach dem Aussäen in Transwell-Einsätze. Zu jedem Zeitpunkt wird TEER als Median Ω x cm 2 ± SEM von 32 unabhängigen Vertiefungen aus einem repräsentativen Experiment. <img alt="Abbildung 3" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50157/50157fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50157/50157fig3.jpg" /> Abbildung 3. Passive Gleichge<html> brierung von Natriumfluorescein in das basolaterale Kompartiment Calu-3 Zellmonoschichten gehemmt als Zellen polarisiert zu werden. kumulierten Daten aus vier unabhängigen Experimenten dargestellt. Jeder Datenpunkt stellt einen einzelnen Messung. <img alt="Abbildung 4" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50157/50157fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50157/50157fig4.jpg" /> Abbildung 4. RSV-Infektion von polarisiertem Calu-3 LCC beschleunigt einen Rückgang der Monoschicht Integrität. Polarisierte Calu-3-Zellen wurden mit RSV-A2 mit einer MOI = 1 am Tag 0 infiziert und Polarität wurde für 8 Wochen nach der Infektion überwacht. Ein repräsentatives Experiment gezeigt. Die Daten sind als Median Widerstand 8 unabhängige Wells pro Infektion ± SEM pro Zeitpunkt vorgestellt. * P &lt;0,05 zwischen Mock-und RSV-A2-infizierten Kulturen, wie durch den Student-t-Test ermittelt. Wegen &quot;&gt; <tbody><tr><td> Ausgabe </td><td> Auflösung (s) </td></tr><tr><td> Widerstand ist nicht messbar </td><td><ul><li> Entfernen Sie alle Luftblasen in den Vertiefungen </li><li> Verwenden Calu-3-Zellen, die aus gefrorenen Lager wurden weniger als 10 Mal subkultiviert </li><li> Lassen Sie keine Calu-3-Zellen auf 100% Konfluenz in Monolayer Subkultur zu erreichen </li><li> Überprüfen, ob die Zellen wachsen nicht auf den Kunststoff deutlich unterhalb des Einsatzes (was anzeigt, dass die Zellen durch die Poren des Einsatzes gewachsen) </li><li> 2-3 Wochen nach der Aussaat für die vollständige Entwicklung von Resistenzen </li><li> Überprüfen Sie die Zusammensetzung und Porengröße von Einsätzen verwendet werden, bei Bedarf ändern (empfohlen Polyester Einlage, 0,3 um Porengröße, keine Beschichtungen siehe Materialien für Details) </li><li> Prüfen Sie die Qualität der Elektrode, Schleifen sanft angesammelt Proteine ​​von der Spitze entfernen und ersetzen falls nötig </li><li> Überprüfen Medium für bakterielles Wachstum </li></ul&gt; </td></tr><tr><td> Widerstand entwickelt, aber voller Polarisation (≥ 1.000 Ω × cm 2) wird nicht erreicht </td><td><ul><li> Zusätzliche Zeit für die Polarisation zu entwickeln (manchmal dauern kann bis zu 4 Wochen) </li><li> Verwenden Calu-3-Zellen, die aus gefrorenen Lager wurden weniger als 10 Mal subkultiviert </li><li> Lassen Sie keine Calu-3-Zellen auf 100% Konfluenz in Monolayer Subkultur zu erreichen </li><li> Durchweg ersetzen Medium in Transwell Kulturen, abwechselnd zwischen dem dritten und vierten Tag nach vorheriger Fütterung </li><li> Kultur nur Zellen auf Einsätze, die in den äußeren Reihen von Platten gelegt werden </li><li> Verwenden Sie eine andere Menge von Transwell-Einsätze </li></ul></td></tr><tr><td> Zellen vollständig zu polarisieren, aber der Widerstand ist nicht konsistent von einer Lesung zur nächsten </td><td><ul><li> Nicht stören oder stapeln Platten im Inkubator </li><li> Nicht zu Vibrationen in der Biosicherheitswerkbank während Transwell plates gehandhabt werden </li><li> Entfernen Sie alle Luftblasen in den Vertiefungen </li><li> Bitte nicht stören die Zellschicht mit Pipettenspitzen beim Medienwechsel oder die Durchführung TEER Lesungen </li><li> Verwenden Sie 200 ul Medium in der apikale Kompartiment, geringere Lautstärke kann zu instabilen TEER Messwerten führen </li><li> Prüfen Sie die Qualität der Elektrode, Schleifen sanft angesammelt Proteine ​​von der Spitze zu entfernen, und falls nötig ersetzen </li></ul></td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Fehlersuche Probleme, die bei der Kultivierung Calu-3-Zellen in Transwells entstehen können. Mehrere Faktoren tragen zu Vollpolarisation von Calu-3-Zellen in flüssigem bedeckten Kulturen, die am ehesten von denen in dieser Tabelle markiert werden.

Die Erkenntnisse und Schlussfolgerungen in diesem Bericht sind die der Autoren und stellen nicht notwendigerweise die Ansichten der Centers for Disease Control and Prevention.

Aufbau einer Liquid-bedeckten Kultur Polarized Menschliche Airway Epithelial Calu-3-Zellen, um Host-Zell-Antwort, um Atemwegspathogene Studie<em&gt; In-vitro-</em

The  apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate  directional responses to pathogen exposure in  vivo. Thus, ideal in vitro ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, eine polarisierte, mit Flüssigkeit bedeckte Kultur von Calu drei Zellen unter Verwendung eines Transwell-Kultursystems zu etablieren, um das Transwell-Kultursystem einzurichten. Bereiten Sie zunächst eine Transwell-Platte vor, indem Sie die Einsätze in die äußeren Reihen der Platte verschieben und den basolateralen Kammern jeder Vertiefung Medium hinzufügen. Der zweite Schritt besteht darin, monoschichtige Kulturzellen in Einzelzellsuspensionen vorzubereiten.Anschließend werden die suspendierten Zellen in die apikalen Kompartimente der Transwell-Einsätze eingesetzt. Der letzte Schritt besteht darin, apikale und basale laterale Medien vollständig zu ersetzen. In Kultur in einem drei- und viertägigen Zyklus für zwei bis drei Wochen einsetzen, bis die Zellen vollständig polarisiert sind.Letztendlich werden ein transepithelialer elektrischer Widerstand und ein passiver Natriumfluorescein-Äquilibrierungsassay verwendet, um die Polarisation von flüssigkeitsbedeckten Calu-Drei-Kulturen zu demonstrieren. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber der Verwendung normaler menschlicher Bronchialepithelzellen besteht darin, dass Calor drei leichter zugänglich sind und sich schneller zu polarisierten Kulturen entwickeln. Sofort einsatzbereit Alle Verfahren zur Züchtung polarisierter Calu. Drei mit Flüssigkeit bedeckte Kulturen oder LCC werden in einer Biosicherheitswerkbank unter Verwendung steriler Kulturtechniken durchgeführt.Beginnen Sie mit der Vorbereitung einer 24-Well-Trans-Well-Platte. Für die Aussaat mit einer sterilen Pinzette bewegen Sie die Transwell-Einsätze von der Innen- in die Außenreihen der Platte, ohne den Einsatz zu berühren. Membranzellen sollten nur in Vertiefungen an den äußeren Reihen der Platte subkultiviert werden.Bei 600 Mikrolitern EMEM, das 10 % FBS enthält, im Folgenden als EMEM bezeichnet, 10 % zu jedem basolateralen Kompartiment. Um das Eindringen von Luftblasen zu verhindern, winkeln Sie die Pipette gegen die Wand jedes Fachs und geben Sie das Medium langsam in die Vertiefung ab. Als nächstes lösen Sie Colu drei Zellen aus Gewebekulturflaschen und Subkulturzellen, wie im Protokolltext beschrieben, resuspendieren Sie die gewaschenen Zellen gründlich in fünf Millilitern EMEM 10%, indem Sie vorsichtig auf und ab pipettieren, bestimmen Sie die lebensfähigen und die Gesamtzellzahl nach der Trian-Blue-Ausschlussmethode und fahren Sie nur fort, wenn 80% bis 90% lebensfähig sind.Dann verdünnen die Zellen in einem sterilen konischen Röhrchen von 50 Millilitern auf eine Konzentration von zweimal 10 auf die sechs lebensfähigen Zellen pro Milliliter. Mit EMEM 10% fügen Sie 100 Mikroliter resuspendierte Calu drei Zellen in das apikale Kompartiment jedes Transwells hinzu, mit Ausnahme der Vertiefungen A eins und D eins. Winkeln Sie die Pipette vorsichtig gegen den inneren Führungskanal der Einsatzwand an und geben Sie die Zellen langsam frei.Berühren Sie die Pipette nicht mit der Einführmembran. Bewegen Sie die CALU-Drei-Zellen-Suspension während dieses Sitzschritts vorsichtig, um eine homogene Suspension der Zellen in den Vertiefungen A eins und D eins aufrechtzuerhalten, bei denen es sich um zellfreie Kontrollvertiefungen oder -blindproben bei 100 Mikrolitern EMEM 10 % ohne Zellen handelt. Inkubieren Sie die Trans-Well-Platte bei 37 Grad Celsius und 7 % Kohlendioxid in der Luftatmosphäre in einem Inkubator, in dem die physikalische Störung minimal ist, um die Effizienz der Polarisation zu verbessern.Stapeln Sie die Platten drei Tage nach der Subkultur nicht übereinander und kalibrieren Sie drei Zellen in Transwells, sondern ersetzen Sie das Medium vollständig und saugen Sie das Medium vorsichtig aus den Transwell-Einsätzen an, indem Sie eine Kapillarpipette verwenden, die an einer Vakuumfalle mit einem sanften Vakuum befestigt ist. Entfernen Sie zuerst das apikale Medium aus allen Vertiefungen und dann das basolaterale Medium aus allen Vertiefungen. Berühren Sie die Einsteckmembranen nicht, während Sie Medium ansaugen.Geben Sie 200 Mikroliter EMEM 10% in das apikale Kompartiment der zellfreien Vertiefungen A eins und D eins. Dann in die sitzenden Vertiefungen, wobei das Medium mit der Seite des Einsatzes, um die Pipettenspitze zu führen, in das apikale Kompartiment geleitet wird. Geben Sie kein Medium direkt auf die Zellen und berühren Sie nicht die Einlegemembran.Geben Sie anschließend 600 Mikroliter EMEM 10% in die basalen lateralen Kompartimente, um das Einbringen von Luftblasen in die basalen lateralen Kompartimente zu verhindern. Geben Sie Medium zu jedem Fach, indem Sie die Pipette gegen die Wand jedes Fachs anwinkeln und das Medium langsam in die Vertiefung abgeben. Setzen Sie die Transwell-Platte nach diesem ersten Medium wieder in den Inkubator ein. Ersatz.Das Medium sollte in einem Zyklus abwechselnd zwischen dem vierten und dem dritten Tag nach der vorherigen Fütterung ausgetauscht werden, bis die Zellen vollständig polarisiert sind. Die Polarisation wird überwacht, indem der transepitheliale elektrische Widerstand oder der Riss des CALU drei LCC mit einem Volter bewertet wird, der kalibriert und getestet wurde. Um diesen Vorgang zu starten, nehmen Sie die Elektrode aus dem Ethanol, trocknen Sie sie fünf bis 10 Sekunden lang an der Luft und spülen Sie die Elektrode mit sterilem EMEM 10%Stellen Sie den Modusschalter des Volters auf die Widerstandseinstellung und schalten Sie das Gerät ein.Beginnen Sie die Messungen mit den zellfreien Kontrollvertiefungen, um Basismessungen zu erhalten, und fahren Sie dann mit den Messungen für jede Welle fort. Platzieren Sie die Elektrode vorsichtig in einen der drei Ports, die den Zugang zum basolateralen Kompartiment der Transwell-Kultur ermöglichen. Platzieren Sie die Elektrode so, dass die längere Leitung nur leicht den Boden der äußeren Vertiefung berührt und senkrecht bleibt.Und die kürzere Elektrode befindet sich im Gewebekulturmedium des apikalen Kompartiments, ohne die Einsatzmembran zu berühren. Drücken Sie die Messtaste R und warten Sie, bis sich der Messwert stabilisiert hat. Wiederholen Sie den Vorgang für die beiden anderen Ports für jede Vertiefung, und zeichnen Sie die Messungen an allen drei Anschlüssen für insgesamt drei Messungen pro Vertiefung auf, um sicherzustellen, dass die Polarisation abgeschlossen ist. Ein sekundärer Assay zur Messung der passiven Natriumfluoresceindiffusion zwischen den apikalen und basolateralen Kompartimenten wird an ein bis drei Transwell-Kulturen durchgeführt.Entfernen Sie vorsichtig das Medium sowohl aus den basalen lateralen als auch aus den apikalen Kompartimenten der Transwell-Kulturen, die getestet werden sollen. Spülen Sie Transwell-Kulturen, indem Sie vorsichtig 600 Mikroliter steriles DPBS bei Raumtemperatur in die basolateralen Kompartimente und 100 Mikroliter steriles DPBS bei Raumtemperatur in die apikalen Kompartimente geben. Entfernen Sie DPBS vorsichtig aus den Vertiefungen.Geben Sie 600 Mikroliter sterilen nicht fluoreszierenden Puffer in die basolateralen Kompartimente, gefolgt von 100 Mikrolitern sterilem Natriumfluorescein in die apikalen Kompartimente. Inkubieren Sie die Platte eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius. Nach einer Stunde.Übertragen Sie die nicht fluoreszierende Pufferprobe aus dem basolateralen Kompartiment jedes Testtranswells in ein separates sauberes Röhrchen. Zur Analyse die Testtranswells, die zur Untersuchung der passiven Natriumfluoresceindiffusion verwendet werden, von der Platte entfernen und verwerfen. Stellen Sie die Platte mit den restlichen Transwells wieder in den Inkubator ein.Geben Sie 100 Mikroliter jeder zuvor hergestellten Natriumfluorescein-Standardlösung in dreifacher Ausfertigung in eine 96-Well-Platte mit flachem Boden. Bereiten Sie drei Verdünnungen jeder basalen lateralen Probe in nicht fluoreszierendem Puffer vor. Geben Sie für jede Probe 100 Mikroliter einer unverdünnten Probe und 100 Mikroliter jeder Verdünnung in doppelter Ausführung in eine 96-Well-Platte mit flachem Boden.Messung der Probenabsorption auf einem EISA-Plattenlesegerät bei 486 Nanometern oder 490 Nanometern. Um dieses Verfahren zu beginnen, waschen Sie zuerst Zellen und serumfreies EMEM mit einer Kapillarpipette, die an einer Vakuumfalle befestigt ist, saugen Sie mit einem sanften Vakuum vorsichtig Medium aus allen Vertiefungen an, entfernen Sie das apikale Medium, gefolgt von dem basolateralen Medium, aspirieren Sie das Medium aus den zellfreien Vertiefungen A eins und D eins und dann aus den ausgesäten Vertiefungen. Berühren Sie die Einlegemembranen nicht, während Sie das Medium ansaugen.Geben Sie 100 Mikroliter serumfreies EMEM in das apikale Kompartiment der zellfreien Vertiefungen A eins und D eins und dann in die sitzenden Vertiefungen, die das Medium in das apikale Kompartiment leiten. Verwenden Sie die Seite des Einsatzes, um die Pipettenspitze zu führen. Geben Sie kein Medium direkt auf die Zellen und berühren Sie nicht die Einsatzmembran.Als nächstes werden 600 Mikroliter Serum frei EMEM in die basolateralen Kompartimente gegeben. Geben Sie Medium in jede Trans-Vertiefung, indem Sie die Pipette gegen die Wand des Fachs anwinkeln und das Medium langsam in die Vertiefung abgeben. Saugen Sie das serumfreie Medium vorsichtig aus den Vertiefungen an. Beginnend mit nicht infizierten oder scheininfizierten Vertiefungen fügen Sie die folgenden Virusverdünnungen in das apikale Kompartiment der entsprechenden trans-Vertiefungen hinzu.100 Mikroliter serumfreies EMEM für nicht infizierte Vertiefungen. 100 Mikroliter virusfreies Präparat, verdünnt in serumfreiem EMEM für scheininfizierte Vertiefungen und 100 Mikroliter Virus, verdünnt in serumfreiem EMEM für Viren. Danach bei 600 Mikrolitern Serum freies EMEM in alle basolateralen Kompartimente inkubieren, zwei Stunden lang bei 37 Grad Celsius und 7 % Kohlendioxid inkubieren.Nach zwei Stunden aspirieren Sie Medium aus Vertiefungen, zuerst aus nicht infizierten und simulierten infizierten Vertiefungen und dann aus infizierten Vertiefungen. Zuerst apikale Überstände entfernen, gefolgt von basalen lateralen Überständen. Ersetzen Sie schließlich das Medium durch 200 Mikroliter EMEM, 10 % in den apikalen Kompartimenten und 600 Mikroliter EMEM 10 % in den basolateralen Kompartimenten, indem Sie der in diesem Video gezeigten Methode folgen.Der transepitheliale elektrische Widerstand oder Riss von calu drei flüssig bedeckten Kulturen erreicht innerhalb von drei Wochen nach der Aussaat ein Plateau bei oder über 1000 m x Quadratzentimeter. Ein Beispiel dafür ist in dieser Abbildung dargestellt, da die zwischen polarisierten Zellen gebildeten Tight Junctions das passive Gleichgewicht kleiner Moleküle zwischen dem apikalen und dem basolateralen Kompartiment verhindern. Ein modifizierter Natriumfluoreszenz-Äquilibrierungsassay wird verwendet, um die Polarisation von Calu-Drei-Flüssig-bedeckten Kulturen zu bestätigen.Da die Schicht von Calu, drei Zell-Monolagen und Flüssigkulturen zunimmt, nimmt die Menge an Fluorescein, die sich passiv in das basolaterale Kompartiment ausgleicht, ab. Hier werden kumulative Daten aus vier unabhängigen Experimenten präsentiert, und jeder Datenpunkt stellt eine individuelle Messung dar. Sobald der Riss 1000 im Besitz eines Zentimeters im Quadrat ist, beträgt die Menge an Fluorescein, die sich in das BA-Basolateral-Kompartiment äquilibriert, kleiner oder gleich 1 %. Daher gelten drei mit Flüssigkeit bedeckte Kulturen als vollständig polarisiert, wenn die Schicht größer oder gleich 1000 im Besitz eines Zentimeters im Quadrat ist. Sobald die Stufe der mit Flüssigkeiten bedeckten Calu-3-Kulturen ein Plateau bei oder über 1000 im Besitz eines Quadratzentimeters erreicht, ist das Modell bereit, zur Untersuchung der Reaktionen von Epithelzellen der Atemwege auf respiratorische Krankheitserreger verwendet zu werden, einschließlich des Respiratorischen Synzytial-Virus oder RSV, wie gezeigt.In diesem Beispiel führt die Exposition gegenüber RSV, dargestellt in Rot, zu einem schnelleren Rückgang der polarisierten Kultur. Die Integrität im Vergleich zu einer Scheininfektion von Zellen, die in den blauen Daten dargestellt sind, wird als mediane Resistenz von acht unabhängigen Wells pro Infektion plus oder minus SEM pro Zeitpunkt dargestellt. Das Sternchen zeigt einen P von weniger als 0,05 zwischen Schein- und RSVA-infizierten Kulturen an, wie durch den T-Test-Test des Studenten bestimmt.Vergessen Sie nicht, wenn Sie mit Infektionserregern arbeiten, dass diese gefährlich sein können, und Sie sollten geeignete PSA tragen und bei der Durchführung dieser Verfahren gute Laborpraktiken anwenden.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Source: Montefusco-Pereira, C. V. et al. P. aeruginosa Infected 3D Co-Culture of Bronchial Epithelial Cells and Macrophages at Air-Liquid Interface for Preclinical Evaluation of Anti-Infectives. J. Vis. Exp.(2020)This video demonstrates a co-culture model of bronchial epithelial cells and macrophage-like cells at the air-liquid interface to study host-pathogen interactions. Pathogenic bacterial infection compromises epithelial membrane integrity, triggering macrophage-like cell activation and...

Establishing a Co-Culture Model to Study Host-Pathogen Interactions at the Air-Liquid Interface

Nasen Epithelzellen, durch oberflächliche Schürf Biopsie der menschlichen Freiwilligen erhalten, werden erweitert und auf Gewebekultureinsätze übertragen. Nach Erreichen der Konfluenz werden die Zellen an der Luft Flüssigkeit-Grenzfläche angebaut, was Kulturen der Wimper und nicht-Geißelzellen. Differenzierte Nasen epithelialen Zellkulturen bieten tragfähige experimentelle Modelle für die Untersuchung der Schleimhaut der Atemwege.

Die Kultivierung der menschlichen Nasen Epithelzellen an der Air flüssig-Grenzfläche

Wir beschreiben ein Protokoll für ein dreidimensionales Co-Kultur-Modell infizierter Atemwege, mit CFBE41o- Zellen, THP-1 Makrophagen und Pseudomonas aeruginosa, die an der Luft-Flüssig-Schnittstelle eingerichtet wurden. Dieses Modell bietet eine neue Plattform, um gleichzeitig die Wirksamkeit von Antibiotika, die Epithelbarrierefunktion und entzündungshemmende Marker zu testen.

P. aeruginosa Infizierte 3D-Co-Kultur von Bronchialepithelzellen und Makrophagen an der Luft-Flüssig-Schnittstelle zur präklinischen Bewertung von Anti-Infektivika

Beschrieben wird die Zellkultur und Expositionsmethode eines In-vitro-Bronchialmodells für eine realistische, wiederholte Inhalationsexposition gegenüber Partikeln für Toxizitätstests.

Ein Luft-Flüssig-Interface-Bronchial-Epithelmodell für realistische, wiederholte Inhalationsexposition gegenüber Luftpartikeln für Toxizitätstests

Dieses Protokoll beschreibt eine Untersuchung der frühen Wechselwirkungen zwischen viral infizierten Nasenepithelzellen und der angeborenen Zellaktivierung. Einzelne Untergruppen von Immunzellen können anhand ihrer Aktivierung als Reaktion auf Virusinfektionen unterschieden werden. Sie können dann weiter untersucht werden, um ihre Auswirkungen auf frühe antivirale Reaktionen zu bestimmen.

Kontaktfreies Co-Kultur-Modell zur Untersuchung der angeborenen Immunzellaktivierung während einer Infektion mit respiratorischen Viren

Das vorliegende Protokoll beschreibt humane induzierte pluripotente Stammzell-abgeleitete alveoläre Epithel-ähnliche Zellen (iAT2s) vom Typ 2. Diese Zellen können als selbsterneuernde Kugeln in 3D-Kultur kultiviert oder an die Luft-Flüssigkeits-Interface-Kultur (ALI) angepasst werden.

Erzeugung von 3D-Kugeln und 2D-Luft-Flüssig-Grenzflächenkulturen von humanen induzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten alveolären Epithelzellen vom Typ 2

Jüngste Fortschritte bei humaninduzierten pluripotenten Stammzelldifferenzierungsprotokollen ermöglichen die schrittweise Ableitung organspezifischer Zelltypen. Hier stellen wir detaillierte Schritte zur Erhaltung und Expansion von iPSC-abgeleiteten Atemwegsbasalzellen und deren Differenzierung zu einem mukoziliären Epithel in Luft-Flüssigkeits-Grenzflächenkulturen zur Verfügung.

Erzeugung von Atemwegs-Epithelzell-Luft-Flüssig-Grenzflächenkulturen aus humanen pluripotenten Stammzellen

Das Nasenepithel ist die primäre Barrierestelle, auf die alle respiratorischen Krankheitserreger treffen. In dieser Arbeit skizzieren wir Methoden zur Verwendung von primären nasalen Epithelzellen, die als Luft-Flüssigkeits-Grenzflächenkulturen (ALI) gezüchtet wurden, um menschliche Coronavirus-Wirt-Interaktionen in einem physiologisch relevanten System zu charakterisieren.

Infektion von primären nasalen Epithelzellen, die an einer Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche gezüchtet wurden, zur Charakterisierung menschlicher Coronavirus-Wirt-Interaktionen

In dieser Arbeit wird eine reproduzierbare, kostengünstige und robuste Methode zur Isolierung und Expansion von primären Bronchialepithelzellen für das langfristige Biobanking und die Erzeugung differenzierter Epithelzellen durch Kultur an der Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche vorgestellt.

Isolierung von Bronchialepithelzellen aus reseziertem Lungengewebe für Biobanken und Etablierung gut differenzierter Luft-Flüssigkeits-Grenzflächenkulturen

Die Grenzflächenkultur zwischen Luft und Flüssigkeit wird häufig verwendet, um pseudostratifiziertes Atemwegsepithel zu entwickeln, indem primäre normale menschliche Bronchialepithelzellen differenziert werden, die die apikale Seite der Lungenatemwege nachahmen. Hier beschreiben wir ein einfaches Protokoll zur Bestimmung seiner Qualität durch Überwachung seiner biophysikalischen Eigenschaften, wie z. B. der Ziliarfunktion und der Membranintegrität.

Bestimmung der Ziliarfunktion und Membranundurchlässigkeit des pseudostratifizierten Lungenepithels der Atemwege

Dieser Artikel beschreibt die Generierung eines komplexen, mehrzelligen Atemwegsbarrieremodells, das aus induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSC)-abgeleitetem Lungenepithel, Mesenchym, Endothelzellen und Makrophagen in einer Luft-Flüssigkeits-Grenzflächenkultur besteht.

iPSC-abgeleitete Co-Kultur von Epithel-, mesenchymalen, endothelialen und Immunzellen zur Modellierung der Integrität der Atemwegsbarriere bei Lungengesundheit und -erkrankung

Lernen Sie den Aufbau polarisierter Calu-3-Zellkulturen im Transwell-System zur Untersuchung von Atemwegsepithelfunktionen. TEER-Messungen und Natriumfluoreszein-Assays bestätigen die Barrierenintegrität.

Aufbau einer Liquid-bedeckten Kultur Polarized Menschliche Airway Epithelial Calu-3-Zellen, um Host-Zell-Antwort, um Atemwegspathogene Studie In-vitro- (Video) | JoVE Journal

Aufbau einer Liquid-bedeckten Kultur Polarized Menschliche Airway Epithelial Calu-3-Zellen, um Host-Zell-Antwort, um Atemwegspathogene Studie

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