Name: Isolierung von Bronchialepithelzellen aus reseziertem Lungengewebe für Biobanken und Etablierung gut differenzierter Luft-Flüssigkeits-Grenzflächenkulturen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-26T14:10:00.000+00:00
Duration: 8 min 42 s
Description: Lernen Sie die Isolierung primärer Bronchialepithelzellen aus humanem Lungengewebe für Biobanken und Luft-Flüssigkeits-Grenzflächenkulturen. Diese Methode ermöglicht reproduzierbare Studien zur Atemwegsepithelforschung.

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Die Studien, die das in diesem Beitrag beschriebene Modell verwenden, wurden von einer Vielzahl von Förderorganisationen unterstützt, darunter die Lungenstiftung Niederlande, die Niederländische Organisation für Gesundheitsforschung und -entwicklung (ZonMw, COVID-19 MKMD-Zuschuss), die Niederländische Gesellschaft für den Ersatz von Tierversuchen (Stichting Proefdiervrij, Zuschuss #114025007) sowie Forschungsstipendien von Unternehmen wie Boehringer Ingelheim und Galapagos. Abbildung 1 wurde mit BioRender.com erstellt.

Die Autoren erklären, dass keine relevanten Interessenkonflikte bestehen.

Das hier vorgestellte Protokoll beschreibt die Isolierung von humanen Bronchialepithelzellen aus reseziertem Lungengewebe, eine Methode zur optimalen Expansion von Zellen ohne Verlust des Differenzierungspotentials, ein Kryokonservierungsverfahren und ein Verfahren zur Erzeugung gut differenzierter ALI-PBEC-Kulturen. Des Weiteren wird eine Beschreibung der Qualitätskontrolle sowie eine Anleitung zur Überwachung und Bewertung der differenzierten ALI-PBECs gegeben.
Das beschriebene Protokoll beginnt mit einem makroskopisch normalen, tumorfreien Bronchialring, der aus einem Lungenlappen von Patienten reseziert wird, die sich im Zusammenhang mit ihrer Lungenkrebsdiagnose einer Operation unterziehen. Es ist daher zu beachten, dass diese Ringe streng genommen nicht als gesundes Gewebe angesehen werden können, was daher die Eigenschaften der Zellkultur beeinträchtigen kann. Alternative Quellen zur Gewinnung von Bronchialepithelzellen sind die Verwendung von Bronchialepithelzellen, Bronchialbürsten oder Gewebe aus der Lunge eines transplantierten Spenders oder Empfängers. Unabhängig von der Quelle sollte bei der Verwendung von Lungengewebe das Risiko einer mikrobiellen Kontamination berücksichtigt werden, und daher werden Antibiotika in den verschiedenen Nährmedien verwendet, um das Risiko einer mikrobiellen Kontamination der Zellkultur zu verringern. Insbesondere Mykoplasmen stellen ein hohes und häufiges Risiko in Zellkulturen dar, da sie eine Vielzahl von Auswirkungen auf die Zellkultur haben, Resistenzen gegen Antibiotika, die üblicherweise in Zellkulturen verwendet werden, und die Tatsache, dass eine Mykoplasmenkontamination nur durch Mykoplasmennachweisassays bestätigt werden kann. Daher wird in der Anfangsphase der Zellkultur nach der Isolierung von Zellen aus Lungengewebe die antimikrobielle Breitbandformulierung Primocin verwendet, und während des Kulturprozesses werden zufällig ausgewählte Proben auf das Vorhandensein von Mykoplasmen getestet.
Das Isolationsverfahren, das mit einem Bronchialring beginnt, liefert ausreichend Ausgangsmaterial, um den Expansionsgrad dieser Primärzellen zu ermöglichen, der für den Start von Kulturen am ALI erforderlich ist, ohne die Differenzierungsfähigkeit zu beeinträchtigen. Der Beginn der Expansion der isolierten Epithelzellen mit einer begrenzten Anzahl von Zellen kann jedoch Probleme bei der Gewinnung einer ausreichenden Anzahl von Inserts mit genügend Zellen verursachen, die für die ALI-Kultur ausgesät werden können. Eine ausgedehnte Kultur und wiederholte Passage von Primärzellen kann zu einer replikativen Seneszenz führen. Es wurden verschiedene Lösungen vorgeschlagen, um diese Einschränkung zu überwinden. Horani et al. zeigten, dass der Rho-Kinase-Inhibitor (ROCK) Y-27632 die Proliferation von Basalzellen erhöhte30, Mou et al. nutzten die duale Smad-Hemmung, um basale Stammzellen zu vermehren und gleichzeitig die Eigenschaften der differenzierten Epithelzellschicht31 beizubehalten, und Sachs et al. haben ein Atemwegsorganoidsystem entwickelt, das verwendet werden kann, um Atemwegsepithelzellen zu erweitern und ihr Differenzierungspotenzial im Laufe mehrerer Passagen aufrechtzuerhalten32. Die letztgenannte Methode wurde auch verwendet, um Zellen aus Quellen mit sehr geringer Zellzahl, wie z. B. Trachealaspiate (TAs) von Frühgeborenen (&lt;28. Schwangerschaftswoche) und bronchoalveoläre Lavageflüssigkeit (BAL), zu expandieren, bevor sie in die ALI-Kultur übertragen wurden, wie hier beschrieben33. Es zeigte sich, dass Zellen, die aus BAL und TAs isoliert wurden, eine ähnliche Differenzierungsfähigkeit aufwiesen wie Zellen, die aus Bronchialgewebe generiert wurden, obwohl Unterschiede beobachtet wurden, wenn die Differenzierung in Richtung eher bewimperter oder kelchzellhaltiger Kulturen unter Verwendung der Notch-Signalinhibition oder des Th2-Zytokins IL-1333 verzerrt wurde. Es wird daher empfohlen, bei der Kultivierung von ALI-PBECs aus einem Ausgangsmaterial mit geringer Epithelzellzahl unter Verwendung ähnlicher Ansätze die Kulturen immer auf die grundlegenden Qualitätskriterien zu überprüfen, wie in Abschnitt 6 des Protokolls erörtert. Wichtig ist, dass die Verwendung von Feeder-Zellen auch dazu beitragen kann, größere Zellzahlen zu erhalten, was in einer Umgebung für die Entwicklung von transplantierbaren Gerüsten, in der Zeit und Zellzahl entscheidend sind, unerlässlich ist. Dies wird durch eine Studie veranschaulicht, in der autologe Epithelzellen aus Biopsien eines Patienten mit Trachealerkrankung kultiviert und Zellen in Gegenwart einer murinen embryonalen Feederschicht (mitotisch inaktivierte 3T3-J2-Fibroblasten) und des oben erwähnten Inhibitors des Rho/ROCK-Signalwegs (Y-27632)34 schnell vermehrt wurden. Die resultierende Zellkultur erwies sich als nützlich für die Wiederbesiedlung von Trachealgerüsten und könnte daher als geeignetes Protokoll für ein Transplantationsmodell angesehen werden.
Bei der Verwendung des in diesem Beitrag beschriebenen Protokolls, aber auch bei der Verwendung anderer Kulturprotokolle, wird zwangsläufig ein Selektionsbias eingeführt. Es ist wichtig zu wissen, dass Unterschiede in den Protokolldetails, wie z. B. die Herkunft der Zellen, die zur Initiierung von Kulturen verwendet werden, die Zusammensetzung des Mediums und andere Protokolldetails zu Veränderungen in der zellulären Zusammensetzung der Kulturen und damit zu Veränderungen in der Reaktion der ALI-Kultur führen können33,35. Darüber hinaus wurden auch Unterschiede in den Zelleigenschaften beobachtet, wenn verschiedene Medien zur Differenzierung der Atemwegszellen verglichenwurden 10,11. Beim Vergleich von PneumaCult und cBD-Medium wurden Unterschiede in den mRNA-Markern für Becherzellen und Keulenzellen, den TEER-Werten und der Zellschichtdicke beobachtet. Aufgrund dieser Beobachtungen wurde trotz fehlender statistischer Untermauerung, aufgrund der geringen Anzahl der verwendeten Spender, der den Kunden unbekannten Zusammensetzung des Mediums und der höheren Kosten des PneumaCult-Mediums, in unserem Labor die Entscheidung getroffen, cBD-Medium zu verwenden.
Wie bereits erwähnt, können Zellen zunächst mit Hilfe von Organoidkulturen expandiert und anschließend in das 2D-ALI-Insert-System überführt werden. Dies ist wichtig, da Atemwegsepithelorganoide nicht für die Exposition gegenüber luftgetragenen Substanzen geeignet sind, während die Verwendung des ALI 2D-Systems die Bewertung der Auswirkungen von luftgetragenen Substanzen wie Zigarettenrauch23,36 auf kultivierte Atemwegsepithelzellen ermöglicht. Ein anderer Ansatz zur Etablierung von ALI-Atemwegsepithelzellkulturen besteht darin, Atemwegsepithelzellen durch die Differenzierung menschlicher pluripotenter Stammzellen (hiPS-Zellen) zu erzeugen37. In solchen Protokollen können in der letzten Phase des Differenzierungsprotokolls nach der Differenzierung zu proximalen Atemwegsvorläuferzellen Zellen durch Kultur zum ALI differenziert werden, wobei ähnliche Verfahren wie die hier beschriebenen verwendet werden.
Im aktuellen Protokoll wird cBD-Medium für die Kultur am ALI verwendet. cBD-Medium ist ein serumfreies Medium, das durch Zugabe einer Mischung aus verschiedenen Nahrungsergänzungsmitteln hergestellt wird, inspiriert von Fulcher et al.38 sowie anderen Studien. Die Ergänzungslösung enthält 52 μg/ml Rinderhypophysenextrakt (BPE), 0,5 μg/ml Hydrocortison, 0,5 ng/ml humanes EGF, 0,5 μg/ml Epinephrin, 10 μg/ml Transferrin, 5 μg/ml Insulin, 6,5 ng/ml Trijodthyronin und 0,1 ng/ml RA39. Da es sich bei BPE um einen Gewebeextrakt handelt, der chargenweise Schwankungen unterliegt, kann das Medium nicht als vollständig definiertes Medium betrachtet werden und ist auch nicht tierversuchsfrei. Ein vollständig definiertes Zellkulturmedium wird bevorzugt, um Unterschiede von Charge zu Charge zu minimieren. Im Hinblick auf den Übergang zur tierversuchsfreien Forschung ist es wichtig, dass Anstrengungen unternommen werden, um definierte Medien zu produzieren, die keine tierischen Produkte enthalten und für die Wissenschaft erschwinglich sind.
Je nach Fragestellung können verschiedene Versuchsaufbauten auf Basis des ALI-Modells eingesetzt werden. Um beispielsweise die Auswirkungen von Verbindungen zu untersuchen, die den Differenzierungsprozess beeinflussen können, kann dies durch Zugabe der Verbindungen zur Kultur während der verschiedenen Stadien der submersen Kultur, während der Differenzierung oder in der gut differenzierten Phase behoben werden. Die zelluläre Zusammensetzung der ALI-PBEC-Kultur kann durch die Zugabe spezifischer Verbindungen beeinflusst werden; So führt beispielsweise die Differenzierung von ALI-PBECs in Gegenwart von IL-13 zu einer Kultur mit mehr Becherzellen und weniger Flimmerzellen, während die Behandlung mit dem γ-Sekretase-Inhibitor DAPT (der zur Blockierung des Notch-Signalwegs verwendet wird) während der Differenzierung zu einer Kultur mit mehr Flimmerzellen auf Kosten der Becherzellen führt 23,40,41,42.
Darüber hinaus können Wirkstoffe, die Zellen stimulieren oder bestimmte Prozesse blockieren, entweder auf das basale Kompartiment oder (in sehr kleinem Volumen) auf das apikale Kompartiment der Kultur appliziert werden. Zellen können auch von der apikalen Seite luftgetragenen Substanzen ausgesetzt werden. Solche Expositionsdesigns wurden verwendet, um die Wirkung von Dieselabgasen oder ganzem Zigarettenrauch auf PBECszu untersuchen 23,43,44. Das Medium kann jedes Mal geerntet werden, wenn das Medium gewechselt wird, um die sezernierten Proteine auf der Basalseite zu überwachen. Gleiches gilt für die apikale Seite der Zellen, die mit PBS gewaschen wird, während das Basalmedium aufgefrischt wird. Der sogenannte apikale Wash wird geerntet und optional Dithioerythrit (DTE) hinzugefügt, um den Schleim, der von den Becherzellen produziert wird, effizienter zu dissoziieren. Zelllysate können für die Isolierung von Gesamtprotein, RNA sowie chromosomaler und mitochondrialer DNA gewonnen werden. Die Zellen können unter Verwendung von Antikörpern für spezifische Marker weiter untersucht werden, indem die Polyethylenterephthalat (PET)-Membran aus dem Kunststoffeinsatz geschnitten und diese Membran für mehrere Immunfluoreszenzfärbungen weiter in kleinere Stücke geschnitten wird45. Darüber hinaus kann die Durchflusszytometrie oder FACS auch nach Trypsinisierung der Zellen in den Inserts eingesetzt werden. Während der ALI-Phase kann die Entwicklung der zellulären Barriere durch Messung des elektrischen Widerstands und anschließende Berechnung des TEER überwacht werden, wobei der elektrische Widerstand umgekehrt proportional zur Oberfläche des Membraneinsatzes ist. Die Berechnung basiert auf dem Ohmschen Gesetz unter Verwendung der folgenden Formel: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/65102/65102eq01.jpg" style="margin: auto;">, wobei Rm der gemessene elektrische Widerstand, Rb der elektrische Grundwiderstand eines Einsatzes ohne Beschichtung und Zellen und SA die Oberfläche der Membran des Einsatzes ist. Die Messung des elektrischen Widerstands mit EVOM2- und STX/Essstäbchen-Elektroden ist unkompliziert, hängt aber stark von den Handhabungsverfahren beim Einführen in das Bohrloch ab. Auch wurde vorgeschlagen, dass die Form der Elektrode die Messung der Barrierefunktion der relativ großen Oberfläche17 beeinflusst.
Eine weitere Verbesserung des ALI-Zellkultursystems, die darauf abzielt, die genaue Geweberepräsentation zu erhöhen, umfasst die Kokultur zusätzlicher Zelltypen wie Leukozyten, Fibroblasten oder Endothelzellen46,47,48. Es wurde beobachtet, dass die Kokultur von ALI-PBEC mit dem Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor (GM-CSF) oder M-CSF-differenzierten Makrophagen die angeborenen Epithelreaktionen und -reparaturen deutlich beeinflusst48. Es ist wichtig zu beachten, dass in solchen Kokulturmodellen die Medienkompatibilität ein Problem darstellen kann. Da das für die Atemwegsepithelzellkultur verwendete Medium speziell für PBECs entwickelt wurde und für andere Zelltypen möglicherweise nicht optimal geeignet ist, ist eine Optimierung erforderlich. Eine weitere Art von Fortschritt auf dem Gebiet der Atemwegsbiologie, für die isolierte PBECs verwendet werden können, ist die Verwendung der Organs-on-Chips (OoC)-Technologie49,50. Mit dieser Technologie kann der Einfluss der mechanischen Kräfte der Atmung und des Blutflusses, wie z. B. Dehnung, Luft und mittlerer Durchfluss, untersucht werden 29.
Die Variabilität zwischen den Spendern kann bei der Verwendung von PBECs von verschiedenen Spendern signifikant sein, und daher ist es wichtig, die Verwendung von Zellen von mehreren Spendern in Betracht zu ziehen, um diese Variabilität in Epithelzellkulturstudien zu berücksichtigen. Da die Kultivierung von ALI-PBECs zeitaufwändig und mit erheblichen Kosten verbunden ist, wird die Möglichkeit geprüft, ALI-PBEC-Kulturen durch Mischen von Zellen verschiedener Spender in einem Zellkultureinsatz zu etablieren. Auf diese Weise können Pilotexperimente mit Primärzellen durchgeführt werden, bevor die Reaktionen von Kulturen analysiert werden, die von verschiedenen Einzelspendern stammen. Darüber hinaus können Spender mit unterschiedlichen Merkmalen (z.B. unterschiedliche Alterskategorie oder Geschlecht) für explorative Studien gruppiert werden. Bei der Verwendung von Spendermischungen ist es wichtig, darauf zu achten, dass die gleiche Zellzahl verschiedener Spender vorhanden ist, um zu verhindern, dass ein Spender aufgrund einer höheren Proliferationsrate die Ergebnisse dominiert. Daher werden Zellen von einzelnen Spendern separat expandiert und mit einer höheren Dichte im Einsatz ausgesät als bei der Aussaat von Zellen eines einzelnen Spenders, um die Proliferation im Insert vor dem Übergang zum ALI zu minimieren. Das Ansprechen von Spendermischungen und entsprechenden Einzelspendern wurde durch Untersuchung der Infektionskinetik von SARS-CoV-2 verglichen. Mit Hilfe von RT-qPCR und Immunfluoreszenzfärbung wurde beobachtet, dass die Spendermischung eine gute Repräsentation der verschiedenen einzelnen Spender lieferte, indem sie eine ähnliche Anzahl von produzierten Viruspartikeln und eine ähnliche Anzahl infizierter Zellen aufwies28.
Um eine akzeptable Alternative für Tiermodelle zu werden, sollte die Genom-Editierung von kultivierten Bronchialepithelzellen durchführbar sein51. Die RNA-Interferenztechnologie unter Verwendung kleiner interferierender RNAs (siRNAs) in ALI-PBECs wird untersucht, da die Zellen jedoch während der submersen Phase der Kultur mit siRNA transfiziert werden müssen, wird der Knockdown während der ALI-Kultur aufgrund der langen Kulturdauer nicht ausreichend aufrechterhalten, es sei denn, die siRNA-Transfektion wird während der Kultur häufig wiederholt52. Nichtsdestotrotz können siRNAs erfolgreich zur Modifikation der Genexpression in submersen Basalzellen eingesetzt werden. Andere haben die CRISPR/Cas9-Technologie erfolgreich eingesetzt, um Genom-Editierung in primären ALI-Epithelzellkulturen der Atemwege mit Ribonukleoprotein (RNP)-Abgabe zu erreichen 53. Bei der Anwendung solcher Techniken ist es wichtig, dass die Zellen ihre volle Differenzierungsfähigkeit behalten. Da primäre Atemwegszellkulturen nicht unbegrenzt passieren können, ist die klonale Expansion der geneditierten Zellen nicht einfach und die Zugabe von Medium zur Auswahl der transfizierten Zellen ist umständlich. Daher ist es schwierig, den gewünschten Knockdown in allen kultivierten Zellen zu erreichen. Eine Alternative zur Erzeugung von Knockout-Klonen ist die Verwendung von Knock-out-Strategien in hiPS-Zellen54 und die Verwendung dieser Zellen zur Erzeugung von Atemwegsepithelzellen. Eine weitere, wenn auch suboptimale Alternative ist die Etablierung einer immortalisierten PBEC-Linie, um geneditierte Zellen klonal zu vermehren55.
Das hier vorgestellte Protokoll ist eine Möglichkeit, ein gut differenziertes pseudostratifiziertes ALI-PBEC zu erzeugen, aber es wurden auch andere Protokolle gefunden, die eine solche Kultur etablieren, mit kleineren und größeren Unterschieden im Vergleich zum vorgestellten Protokoll. Unserer Meinung nach sind die laborübergreifende Validierung von Kulturmethoden und eine strenge Qualitätskontrolle unerlässlich, damit das ALI-PBEC-System und ähnliche Kultursysteme von Atemwegsepithelzellen eine valide Alternative für Tierversuche darstellen können.

Die Rolle des Atemwegsepithels bei einer Vielzahl von akuten und chronischen Lungenerkrankungen wurde in verschiedenen Übersichtsarbeiten beschrieben 1,2,3,4,5,6,7. Gut differenzierte Kulturen von Atemwegsepithelzellen sind ein wichtiges Werkzeug, um die Rolle des Atemwegsepithels zu entschlüsseln. Die Air-Liquid Interface (ALI) Atemwegsepithelzellkultur wird breit eingesetzt, um die Differenzierung von Atemwegsepithelzellen zu fördern und dadurch das Atemwegsepithel zuverlässig in vitro zu untersuchen 8,9. In den letzten Jahren hat die Verwendung solcher Modelle aufgrund neuer Forschungsinitiativen im Zusammenhang mit der COVID-19-Pandemie und eines weltweiten Übergangs zur tierversuchsfreien Forschung noch weiter zugenommen. Daher unterstreicht die verstärkte Verwendung dieser Modellzelllinie die Notwendigkeit des Austauschs von Verfahren und Erfahrungen, um robuste Ergebnisse zu erzielen. Dies ermöglicht auch den Vergleich der Ergebnisse zwischen Forschungsgruppen. Die Robustheit des Verfahrens ist das Hauptmerkmal und muss daher einer Qualitätskontrolle unterzogen werden. Mehrere Labore haben in die Entwicklung von Protokollen für die Kultivierung von Epithelzellen der primären Atemwege am ALI investiert. Der Zeit-, Arbeits- und Budgetaufwand kann reduziert werden, wenn diese Verfahren im Detail geteilt werden. Zu diesen Details gehört beispielsweise die Auswahl von Zellkulturkunststoffen und -medien, die von verschiedenen Herstellern zur Verfügung gestellt werden, da festgestellt wurde, dass diese die Eigenschaften der erhaltenen Kulturenbeeinflussen 10,11,12. Dies unterstreicht die Bedeutung des Austauschs von Erfahrungen und Details über Kulturverfahren, da ohne solche Erkenntnisse die Ergebnisse beeinträchtigt und/oder die Validierungsbemühungen in verschiedenen Laboratorien behindert werden können.
Das menschliche Lungenepithel besteht aus verschiedenen Zelltypen, darunter Haupttypen wie Basalzellen, Flimmerzellen, Becherzellen und Keulenzellen. Um die Epithelzellschicht in den Atemwegen in vitro zuverlässig nachahmen zu können, müssen diese Zelltypen in den Kulturmodellen abgebildet und ihre Polarisation und Funktion aufrechterhalten werden13,14,15,16. Ebenso wichtig ist die Erkenntnis, dass die Eigenschaften des Spenders (einschließlich des Krankheitszustands) und der anatomische Ursprung der Zellen (d. h. nasale, tracheale, große und kleine Atemwege) die zelluläre Zusammensetzung und die funktionellen Reaktionen der Zellkultur beeinflussen können. Einschlägiges Fachwissen und Praxis sind Voraussetzung, um primäre Atemwegsepithelzellen erfolgreich zu kultivieren und die Qualität der Kultur sowohl intuitiv (durch visuelle Inspektion während der Kultur) als auch quantifizierbar zu beurteilen. Ziel dieses Beitrags ist es, eine kosten- und zeiteffiziente Methode zur Isolierung und Kultivierung von primären humanen Bronchialepithelzellen (PBECs) bereitzustellen, die auch auf die Kultur von trachealen und kleinen Atemwegsepithelzellen angewendet werden kann. Neben der Beschreibung eines Verfahrens zur Isolierung solcher Zellen aus reseziertem Lungengewebe wird ein Verfahren zur Expansion und zum Biobanking sowie schließlich zur Etablierung und Charakterisierung einer gut differenzierten ALI-Kultur innerhalb eines vertretbaren Kosten- und Zeitrahmens vorgestellt und diskutiert.

<table><tbody><tr><td>1.000 Ohm Prüfwiderstand</td><td>World Precision Instruments</td><td>N/A</td><td>Wird zur Kalibrierung des EVOM2 Epithel-Voltohmmeters</td></tr><tr><td>verwendet 4-[2-(5,6,7,8-Tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2-naphthalenyl)ethynyl)-benzoesäure (EC 23)</td><td>Tocris</td><td>4011</td><td>Wird in cBD-Medium</td></tr><tr><td>verwendet 6-Well-Clear-TC-behandelte Mehrfach-Well-Platten</td><td>Corning</td><td>3506</td><td>Wird im ersten Schritt verwendet, um die aus den Bronchien isolierten Zellen zu züchten klingeln&nbsp;</td></tr><tr><td>Epithelzellwachstumsmedium Kit für die Atemwege</td><td>PromoCell</td><td>C-21160</td><td>Wird zum Vergleich mit cBD-Medium</td></tr><tr><td>Bead Bath 20 Liter</td><td>Lab Armor</td><td>74220-720</td><td>Wird zum Vorwärmen von Zellkulturlösungen</td></tr> verwendet <tr><td>BEGM Bronchial Epithel Cell Growth Medium BulletKit</td><td>LONZA</td><td>CC-3170</td><td>Wird zum Vergleich mit cBD-Medium</td></tr><tr><td>Rinderalbuminfraktion V (BSA)</td> <td>verwendetThermo Fisher Scientific 15260037</td><td></td><td>Wird in der Beschichtungslösung</td></tr><tr><td>Rinder-Hypophysen-Extrakt (BPE)</td> <td>verwendetThermo Fisher Scientific</td><td>37000-015</td><td>Wird in c-KSFM</td></tr><tr><td>Bronchialepithelzellwachstumsergänzung (BEpiCGS)</td> <td>verwendetScienCell Research Laboratories</td><td>3262</td><td>Verwendet in cBD-Medium</td></tr><tr><td>Bronchialepithelzell-Medium-basal (BEpiCM-b)</td><td>ScienCell Research Laboratories</td><td>SCC3211-b</td><td>Verwendet in cBD-Medium</td></tr><tr><td>Zellkultur-Einsätze; 12 mm Transwell mit 0,4 & Mikro; m pore Polyester-Membraneinsatz</td><td>Corning</td><td>3460</td><td>Zellkultureinsätze, die im Protokoll verwendet werden</td></tr><tr><td>Zellkultureinsätze; 12-Well-Einsätze, 0,4 &; Mikro; m PET klares</td><td>CellQART von SABEU</td><td>9310412</td><td>Zellkultureinsätze zum Vergleich mit Corning</td></tr><tr><td>Zellkultureinsätzen Zellkultureinsätze; 12-Wells ThinCert Gewebekultureinsätze</td><td>Greiner Bio-One</td><td>82050-032</td><td>Zellkultureinsätze zum Vergleich mit Corning Zellkultureinsätzen</td></tr><tr><td>CELLSTAR Kolben, TC, PS, 250 ml, 75 cm2</td><td>Greiner Bio-One</td><td>658170</td><td>Zur Erweiterung der Zellzahl</td></tr><tr><td>CFX Maestro 1.0</td><td>Bio-Rad</td><td>N/A</td><td>Softwareprogramm zur Analyse von qPCR-Daten, die mit dem CFX384 System</td></tr><tr><td>erzeugt wurden CFX384 Touch Real-Time PCR Detection System</td><td>Bio-Rad</td><td>1855484</td><td>qPCR Nachweissystem</td></tr><tr><td>Essstäbchen-Elektrodenset</td><td>World Precision Instruments</td><td>STX2</td><td>Zur Messung des elektrischen Widerstands im ALI-PBEC</td></tr><tr><td>CO2-Inkubator</td><td>PHCbi</td><td>MCO-170AICUV-PE</td><td>Zellkultur-Inkubator für mycplasmenfreie Zellkulturen</td></tr><tr><td>CO2-Inkubator</td><td>Hereaus</td><td>Heracell 150</td><td>Zellkultur-Inkubator für möglicherweise mit Mycplasma infizierte Zellkulturen</td></tr><tr><td>Coolcell Container</td><td>Corning</td><td>432006</td><td>Zur Kryokonservierung von Zellen bei -80 & Grad; C vor dem Transfer in Flüssigkeit N2</td></tr><tr><td>Countess 3 Automatisierter Zellzähler</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AMQAX2000</td><td>Zur Zellzählung und zur Bestimmung der Zellkonzentration</td></tr><tr><td>Kryofläschchen</td><td>Nalgene</td><td>479-3224</td><td>Zur Kryokonservierung von Zellen in</td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Avantor VWR BDH CHEMICALS</td><td>101174Y</td><td>Zur Verwendung in weichem Trypsin-Dimethylsulfoxid</td></tr><tr><td>(DMSO)</td><td>Avantor VWR</td><td>0231</td><td>Zur Verwendung in Zellgefriermedium</td></tr><tr><td>dNTP (10 mM)</td><td>Promega</td><td>U1515</td><td>Zur Verwendung bei der Synthese von cDNA</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) + 4500 mg/l D-Glucose</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>36250</td><td>Verwendet in cBD</td></tr> Medium <tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) 4,5 g/l Glukose mit L-Glutamin</td><td>LONZA</td><td>LOBE12-604F</td><td>Wird in cBD-Medium zum Vergleich mit DMEM anderer Hersteller verwendet&nbsp;</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), hoher Glukosegehalt, Pyruvat</td><td>Thermo Fisher Scientific 41966029</td><td></td><td>Wird in cBD-Medium verwendet, um es mit DMEM anderer Hersteller zu vergleichen&nbsp;</td></tr><tr><td>Epidermaler Wachstumsfaktor (EGF)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>37000-015</td><td>Wird in c-KSFM</td></tr><tr><td>Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)</td><td>Avantor VWR BDH CHEMICALS</td><td>443885J</td><td>Verwendet in weichem Trypsin</td></tr><tr><td>EVOM2 Epithel-Voltohmmeter</td><td>World Precision Instruments</td><td>91799</td><td>Wird mit dem Essstäbchen-Elektrodensatz zur Messung des elektrischen Widerstands in ALI-PBEC</td></tr><tr><td>Fibronektin-Lösung, Mensch&nbsp;</td><td>PromoCell</td><td>C-43060</td><td>Wird in der Beschichtungslösung</td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35050038</td><td>Wird in cBD-Medium</td></tr><tr><td>verwendet Hanks ausgewogene Salzlösung (HBSS)</td><td>ScienCell Research Laboratories</td><td>SCC0313</td><td>Wird zum Auflösen von Protease XIV &</td></tr><tr><td>IQ SYBR Green Super Mix</td><td>Bio-Rad</td><td>170887</td><td>qPCR-Reagenz</td></tr><tr><td>Isoproterenolhydrochlorid, (-)-</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I-6504</td><td>Verwendet in c-KSFM</td></tr><tr><td>Keratinozyten-SFM (KSFM)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17005-034</td><td>Verwendet in c-KSFM</td></tr><tr><td>Maxwell RSC Instrument</td><td>Promega</td><td>AS4500</td><td>Automatisiertes RNA-Isolationssystem</td></tr><tr><td>Maxwell RSC simplyRNA Tissue Kit</td><td>Promega</td><td>AS1340</td><td>Zur Isolierung von Gesamt-RNA mit dem Maxwell RSC Instrument</td></tr><tr><td>M-MLV Reverse Transkriptase</td><td>Promega</td><td>M5301</td><td>Wird bei der Synthese von cDNA</td></tr><tr><td>M-MLV Reverse Transkriptase 5X Reaktionspuffer</td><td>Promega</td><td>M531A</td><td>Wird bei der Synthese von cDNA</td></tr><tr><td>MycoStrip</td><td>InvivoGen</td><td>rep-mys-10</td><td>verwendet zum Nachweis des Vorhandenseins von Mykoplasmen in Zellkulturproben</td></tr><tr><td>N-2-Hydroxyethylpiperazin-N-2-ethansulfonsäure (HEPES)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15630056</td><td>Verwendung in cBD-Medium</td></tr><tr><td>Oligo(dT)15</td><td>Qiagen</td><td>79237</td><td>Verwendung bei der Synthese von</td>cDNA-Penicillin</tr><tr><td>/Streptomycin-Lösung (Pen/Streptomycin)</td><td>ScienCell Research Laboratories</td><td>SCC0513</td><td>Verwendung als Antibiotikum in c-KSFM und cBD-Medium</td></tr><tr><td>Phosphatgepuffert Kochsalzlösung (PBS)</td><td>LUMC Apotheke</td><td>N/A</td><td>Wird in verschiedenen Schritten des Protokolls verwendet</td></tr><tr><td>Pneumacult-ALI Medium</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>05002</td><td>Wird verwendet, um Zellen in der Differenzierungsphase zu züchten, um sie mit cBD-Medium zu vergleichen</td></tr><tr><td>Pneumacult-Ex Plus Medium</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>05040</td><td>Wird verwendet, um Zellen im Unterwasserstadium zu züchten, um sie mit cBD-Medium zu vergleichen</td></tr><tr><td>Primer, ATP5B, vorwärts</td><td>Integrierte DNA Technologies</td><td>N/A</td><td>Nukleotidsequenz: TCACCCAGGCTGGTTCAGA</td></tr><tr><td>Primer, ATP5B, reverse</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A</td><td>Nukleotidsequenz: AGTGGCCAGGGTAGGCTGAT</td></tr><tr><td>Primer, FOXJ1, forward</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A</td><td>Nukleotidsequenz: GGAGGGGACGTAAATCCCTA</td></tr><tr><td>Primer, FOXJ1, reverse</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A</td><td>Nukleotidsequenz: TTGGTCCCAGTAGTTCCAGC</td></tr><tr><td>Primer, MUC5AC, vorwärts</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A</td><td>Nukleotidsequenz: CCTTCGACGGACAGAGCTAC</td></tr><tr><td>Primer, MUC5AC, reverse</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A</td><td>Nukleotidsequenz: TCTCGGTGACAACACGAAAG</td></tr><tr><td>Primer, MUC5B, vorwärts</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A</td><td>Nukleotidsequenz: GGGCTTTGAAGAGAGT</td></tr><tr><td>Primer, MUC5B, reverse</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A</td><td>Nukleotidsequenz: AGGATGGTCGTGTGTGATGCG</td></tr><tr><td>Primer, RPL13A, forward</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A</td><td>Nukleotidsequenz: AAGGTGGTGGTCGTACGCTGTG</td></tr><tr><td>Primer, RPL13A, reverse</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A</td><td>Nukleotidsequenz: CGGGAAGGGTTGGTGTTCATCC</td></tr><tr><td>Primer, SCGB1A1, weiter</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A</td><td>Nukleotidsequenz: ACATGAGGGAGGCAGGGGCTC</td></tr><tr><td>Primer, SCGB1A1, umgekehrt</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A</td><td>Nukleotidsequenz: ACTCAAAGCATGGCAGCGGCA</td></tr><tr><td>Primer, TP63, vorwärts</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A</td><td>Nukleotidsequenz: CCACCTGGACGTATTCCACTG</td></tr><tr><td>Primer, TP63, umgekehrt</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A</td><td>Nukleotidsequenz: TCGAATCAAATGACTAGGAGGGG</td></tr><tr><td>Primocin</td><td>InvivoGen</td><td>ant-pm-2</td><td>Wird als antimikrobielles Mittel gegen Bakterien, Mykoplasmen und Pilze im c-KSFM-Medium</td></tr><tr><td>verwendet Protease XIV</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5147</td><td>Wird zur enzymatischen Behandlung der Bronchialring-RNAs</td></tr><tr><td>verwendet Rekombinanter Ribonuklease-Inhibitor</td><td>Promega</td><td>N2515</td><td>Wird bei der Synthese von cDNA-Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor</td></tr><tr><td>( SBTI)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9128</td><td>Wird verwendet, um die Wirkung von weichem Trypsin</td></tr><tr><td>zu hemmen T100 Thermocycler</td><td>Bio-Rad</td><td>1861096</td><td>Wird bei der Synthese von cDNA</td></tr><tr><td>TissueSAFE plus</td><td>MILESTONE MEDICAL</td><td>N/A</td><td>Vakuumtransfersystem für biologische Proben</td></tr> verwendet <tr><td>Trypanblau-Lösung</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15250061</td><td>Wird verwendet, um lebende und tote Zellen zu zählen&nbsp;</td></tr><tr><td>Trypsin 1:250</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>27250-018</td><td>Wird in weicher Trypsin-Kollagenlösung</td></tr><tr><td>Typ I (PureCol)</td> <td>verwendetAdvanced BioMatrix</td><td>5005-B</td><td>Wird in Beschichtungslösung</td></tr><tr><td>verwendet Universalbehälter, PP, mit PE-Schraubverschluss</td><td>Avantor VWR</td><td>216-2053</td><td>Wird im Protokoll für die Protease XIV-Behandlung des Bronchialrings</td></tr></tbody></table> verwendet

isolierung von bronchialepithelzellen aus reseziertem lungengewebe für biobanken und etablierung gut differenzierter luft-flüssigkeits-grenzflächenkulturen

Isolating Bronchial Epithelial Cells from Resected Lung Tissue for Biobanking and Establishing Well-Differentiated Air-Liquid Interface Cultures

Die Epithelzellschicht der Atemwege bildet die erste Barriere zwischen Lungengewebe und der äußeren Umgebung und ist dadurch ständig eingeatmeten Substanzen, einschließlich Infektionserregern und Luftschadstoffen, ausgesetzt. Die Epithelschicht der Atemwege spielt eine zentrale Rolle bei einer Vielzahl von akuten und chronischen Lungenerkrankungen, und verschiedene Behandlungen, die auf dieses Epithel abzielen, werden durch Inhalation verabreicht. Um die Rolle des Epithels in der Pathogenese zu verstehen und zu verstehen, wie es gezielt für die Therapie eingesetzt werden kann, sind robuste und repräsentative Modelle erforderlich. In-vitro-Epithelkulturmodelle werden zunehmend eingesetzt und bieten den Vorteil, Experimente in einer kontrollierten Umgebung durchzuführen, bei denen die Zellen verschiedenen Arten von Reizen, Giftstoffen oder Infektionserregern ausgesetzt werden. Die Verwendung von Primärzellen anstelle von immortalisierten oder Tumorzelllinien hat den Vorteil, dass sich diese Zellen in Kultur zu einer pseudostratifizierten polarisierten Epithelzellschicht differenzieren, die im Vergleich zu Zelllinien eine bessere Repräsentation des Epithels aufweist.
Hier wird ein robustes Protokoll vorgestellt, das in den letzten Jahrzehnten für die Isolierung und Kultivierung von Atemwegsepithelzellen aus Lungengewebe optimiert wurde. Dieses Verfahren ermöglicht die erfolgreiche Isolierung, Expansion, Kultivierung und mukoziliäre Differenzierung von primären Bronchialepithelzellen (PBECs) durch Kultivierung an der Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche (ALI) und beinhaltet ein Protokoll für das Biobanking. Des Weiteren wird die Charakterisierung dieser Kulturen anhand zellspezifischer Markergene beschrieben. Diese ALI-PBEC-Kulturen können für eine Reihe von Anwendungen verwendet werden, einschließlich der Exposition gegenüber ganzem Zigarettenrauch oder Entzündungsmediatoren und Co-Kultur/Infektion mit Viren oder Bakterien. 
Das in diesem Manuskript enthaltene Protokoll, das das Verfahren Schritt für Schritt veranschaulicht, soll eine Grundlage und/oder Referenz für diejenigen bieten, die an der Implementierung oder Anpassung solcher Kultursysteme in ihrem Labor interessiert sind.

Expansion durch versunkene Kultur Mit der hier vorgestellten Methode können aus einer 6-Well-Platte durchschnittlich acht Kryogefäße mit 400.000 Zellen/Kryo für die Langzeitlagerung in flüssigem Stickstoff gewonnen werden (Abbildung 2A). Um dies zu erreichen, werden isolierte PBECs in 6-Well-Platten für mindestens 7 Tage und maximal 14 Tage (Abbildung 2B) in Gegenwart von Primocin kultiviert, um eine mikrobielle Kontamination (insbesondere Mykoplasmen) auszuschließen. Abbildung 2A,B gibt Aufschluss über die erhaltene Zellzahl und die benötigte Kulturzeit zwischen verschiedenen Isolierungen von verschiedenen Spendern. Vor der Ernte der Zellen durch Trypsinisierung zur Speicherung in flüssigem Stickstoff muss die Konfluenz über 80% liegen. Gelingt dies nicht innerhalb von 14 Tagen, sollten die Zellen nicht kryokonserviert werden. Wichtig ist, dass bei der Ernte zur Lagerung und Durchreichung die Konfluenz der Zellschicht ~95% nicht überschreiten sollte (Abbildung 2C). Nach der Lagerung in flüssigem Stickstoff können die Zellen aufgetaut und für die Expansion kultiviert werden, bis eine ausreichende Anzahl von Zellen für ALI-Kulturen erreicht ist. Das Medium, das für die Expansion der Zellen in diesem Stadium verwendet wird, ist c-KSFM, ähnlich wie bei der ersten Kultur nach der Entnahme aus dem Bronchialring18. In diesem Stadium besteht jedoch kein Bedarf an Primocin, da das Risiko einer zusätzlichen mikrobiellen Kontamination durch das Lungengewebe nicht besteht und Primocin daher gegen Penicillin/Streptomycin ausgetauscht werden kann. Dieses Medium bevorzugt Epithelzellen gegenüber Fibroblasten und verhindert daher ein mögliches Überwachsen der Kultur durch schneller proliferierende Fibroblasten 19,20,21. Bei Verwendung des c-KSFM-Mediums sind die Zellen im Kolben verteilt und verbinden sich nicht miteinander, was sich deutlich von der Morphologie der kultivierten Zellen unterscheidet, die in diesem Stadium in cBD-Medium eingetaucht sind (Abbildung 2D,E). Nach 5 oder 6 Tagen der Kultivierung der aufgetauten Zellen in einem T75-Kolben sollte die Zellschicht zu 80 % bis 95 % konfluent sein, was insgesamt etwa 3 x 106 Zellen entspricht (Abbildung 2F). Daraus können ca. 75 Inserts (12-Well-Plattengröße) für die ALI-Kultur generiert werden.
Die in diesem Beitrag beschriebene Methode zur Isolierung und Kultur kann auch für den Einsatz mit Bronchialbiopsien oder Bronchialbürsten als Ausgangsmaterial adaptiert werden.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65102/65102fig02.jpg"> Abbildung 2: Basalzellexpansion vor und nach der Kryokonservierung. Die Zellen wurden nach dem beschriebenen Protokoll isoliert und mittels c-KSFM kultiviert. Die Anzahl der pro Spender erzeugten Zellen wurde überwacht, die Anzahl der lebenden Zellen wurde mit einem automatisierten Zellzähler (A) durchgeführt, wenn die Zellen der Passage 0 (P0) aus den 6-Well-Platten entnommen wurden (Schritt 2 des Protokolls), n = 123 Spender, die Zellzahl wurde als Anzahl der pro Well geernteten Zellen dargestellt; Jeder Punkt steht für einen Spender und der Median wird durch einen horizontalen Balken angezeigt. (B) Im Rahmen der Qualitätskontrolle wurde die Zeit, die die P0-Zellen benötigten, um eine Konfluenz von 80 % bis 90 % in den 6-Well-Platten zu erreichen, überwacht und als Tage nach Beginn der submersen Kultur in c-KSFM angezeigt (n = 127 verschiedene Spender). Jeder einzelne Spender wird durch einen Punkt gekennzeichnet, alle Punkte, die zu 1 Tag gehören, verschmelzen zu einer Linie; Je breiter die Linie, desto mehr Spender steht sie; Die mittlere Anzahl der Tage, an denen sich die Zellen in Kultur befinden, wird durch einen dünneren horizontalen Balken angezeigt. (C) Repräsentatives Hellfeldbild von P0-Zellen, die in c-KSFM gezüchtet wurden, als die Zellen für die Langzeit-Kryokonservierung geerntet wurden. (D) Repräsentatives Hellfeldbild von P1-Zellen, die in c-KSFM gezüchtet wurden, als die Zellen geerntet und auf Inserts übertragen wurden, und (E) P1-Zellen, die in cBD-Medium gezüchtet wurden. (F) Die Anzahl der pro Spender erzeugten lebenden Zellen wurde bei der Entnahme von P1-Zellen aus dem T75-Kolben (Abschnitt 4 des Protokolls) mit einem automatisierten Zellzähler überwacht, n = 63 verschiedene Spender; Die Zellzahl wird als Anzahl der Zellen pro T75-Flasche angegeben, jeder Spender wird durch einen Punkt und die mittlere Zellzahl durch einen horizontalen Balken angegeben. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65102/65102fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche (ALI)-Kultur 7 Tage nach Beginn der ALI-Kultur wird der elektrische Widerstand der Zellschicht gemessen und sollte mehr als 300 Ω betragen (Abbildung 3A); Gelingt dies nicht, gilt die Kultur als gescheitert, da möglicherweise keine Tight Junction gebildet wird. Es wird empfohlen, niedrige TEER-Werte auszuschließen, die durch eine Schädigung der Epithelschicht in einzelnen Einsätzen verursacht werden, die z. B. durch eine Schädigung der Zellschicht während des Waschens und der Aspiration verursacht wird. Dies kann durch eine visuelle mikroskopische Inspektion der Kultureinsätze überprüft werden. Unserer Erfahrung nach kann die Variabilität des elektrischen Widerstands zwischen den Spendern signifikant sein (Abbildung 3B), was auch in der Literaturberichtet wird 14, und wie beobachtet, auch deutlich von der Herkunft des verwendeten modifizierten Adlermediums (DMEM) von Dulbecco beeinflusst wird (Abbildung 3C).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65102/65102fig03.jpg"> Abbildung 3: Transepithelialer elektrischer Widerstand als Qualitätskontrolle von ALI-PBEC-Kulturen. PBECs wurden isoliert und expandiert, und es wurden gut differenzierte ALI-PBEC-Kulturen etabliert. Zu mehreren Zeitpunkten während der Kultur wurde der elektrische Widerstand gemessen und anschließend der TEER berechnet (Ω·cm2). (A) Der elektrische Widerstand wurde über einen Zeitraum von 14 Tagen nach ALI gemessen. n = 4 verschiedene Spender. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) dargestellt. (B) Im Rahmen der Qualitätskontrolle der ALI-PBEC-Zellkultur wurde der elektrische Widerstand an Tag 7 (n = 50) und Tag 14 nach ALI (n = 25) gemessen; Jeder Punkt steht für einen Spender und der mittlere TEER (Ω·cm2) wird durch einen horizontalen Balken angezeigt. Die Daten wurden mit einem nichtparametrischen Mann-Whitney-Test auf Signifikanz getestet, und es wurde kein signifikanter Unterschied gefunden. (C) Medien von drei verschiedenen DMEM-Lieferanten wurden getestet, um den Einfluss auf die TEER-Bildung zu bewerten. n = 4 verschiedene Spender; Die Mittelwerte sind ± SD dargestellt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65102/65102fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
Bei der Etablierung einer gut differenzierten ALI-PBEC-Kultur steigt die Konzentration von RA ab Beginn der Luftexposition an22. Auf diese Weise wechseln die Zellen von der Proliferation zur mukoziliären Differenzierung, die bereits 9 Tage (spenderabhängig) nach Luftexposition mittels Hellfeldmikroskopie sichtbar wird. Die Bewegung der ersten Zilien ist an dieser Stelle sichtbar, und etwas früher, wenn sie auf der Genexpression von Markern differenzierter luminaler Zellenberuht 23 (Abbildung 4).
Wie im Protokoll beschrieben, kann die Schleimproduktion auch beim Spülen der apikalen Oberfläche während des Mediumwechsels beobachtet werden. RA ist sehr lichtempfindlich, was zu einer sehr schwankenden Aktivität bei gleicher Stammkonzentration führt. Aus diesem Grund wird RA durch das synthetische RA-Analogon EC 23 ersetzt und in gleicher Konzentration eingesetzt, mit ähnlichen Ergebnissen wie experimentell. Aus diesem Grund und um eine Änderung des Verfahrens zu vermeiden, wurde die gewählte EC23-Konzentration auf die zuvor verwendete RA-Konzentration (d. h. 50 nM) 24,25 gehalten (Abbildung 5). Abbildung 5A zeigt die TEER-Werte, die bei Verwendung verschiedener Konzentrationen von EC 23 erreicht wurden, und zeigt einen maximalen TEER bei 50 nM innerhalb dieses getesteten Konzentrationsbereichs. Die in Abbildung 5B gezeigten Ergebnisse bestätigen, dass die Genexpression von Markern für Flimmer- und Becherzellen bei Verwendung von 50 nM EC 23 oder RA ähnlich ist. EC 23 wird auch während der Kultur im submersen Stadium benötigt (wenn auch in einer viel niedrigeren Konzentration), da das Weglassen in diesem submersen Stadium und die Zugabe erst im ALI-Stadium zu einer Kultur führt, die nie die vollständige Konfluenz erreicht. Die Zeit, die benötigt wird, um eine gut differenzierte ALI-PBEC-Kultur mit sichtbarer ziliarer Schlagaktivität und Schleimproduktion zu erzeugen, beträgt etwa 14 Tage, und die meisten Experimente werden daher zwischen 14-21 Tagen ALI-Kulturen begonnen (Abbildung 4). Alle wichtigen verschiedenen Zelltypen (Basal-, Flimmer-, Kelch- und Keulenzellen) werden nach 14 Tagen ALI-Kultur beobachtet, obwohl die Expressionsniveaus stark vom Spender abhängig sind. Dies wird durch die Bestimmung der Genexpression von TP63, FOXJ1, MUC5AC und SCGB1A1 mittels RT-qPCR oder der Proteinexpression mit Antikörpern, die gegen p63, α-Tubulin, Muc5AC und CC-16 gerichtet sind, durch Immunfluoreszenzfärbung (IF) demonstriert, um Marker für basale, Flimmer-, Kelch- bzw. Keulenzellen zu erkennen25,26. Während jedoch 14-21 Tage als Faustregel für die meisten Experimente angesehen werden können, kann für ausgewählte Experimente eine längere Differenzierungsdauer in Betracht gezogen werden, wie sie für den xenobiotischen Stoffwechsel, die SARS-CoV-2-Infektion und die Beurteilung der mukoziliären Clearance gefunden wurde27,28,29.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65102/65102fig04.jpg"> Abbildung 4: Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche (ALI)-Kultur. PBECs wurden isoliert und expandiert, und es wurden gut differenzierte ALI-PBEC-Kulturen etabliert. Die ALI-PBEC-Kulturen wurden über einen Zeitraum von 14 Tagen nach ALI überwacht. Zellkulturen wurden für die Isolierung der RNA an den Tagen 0, 7 und 14 nach ALI lysiert. Es werden Daten von zwei verschiedenen Spendern angezeigt, jeder Punkt steht für einen einzelnen Spender, der im Laufe der Zeit überwacht wurde, und der Median wird durch einen horizontalen Balken angezeigt. Die Genexpression von basalen, Flimmer-, Kelch- und Keulenzellmarkern (TP63, FOXJ1, MUC5B bzw. SCGB1A1) wurde mittels qPCR gemessen und für die RPL13A- und ATP5B-Genexpression normalisiert (siehe Referenz 23 für Details). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65102/65102fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65102/65102fig05.jpg"> Abbildung 5: Vergleich von Retinsäure (RA) und ihrem synthetischen Analogon EC 23. PBECs wurden isoliert und expandiert, und es wurden gut differenzierte ALI-PBEC-Kulturen etabliert. Zu Beginn der Luftexposition der PBEC-Kulturen wurde RA (50 nM) durch verschiedene Konzentrationen von EC 23 ersetzt. (A) Der elektrische Widerstand wurde an Tag 14 post-ALI gemessen und anschließend der TEER berechnet (Ω·cm 2), n =2 Donoren, die Balken stellen den Mittelwert ± SD dar. (B) Am Tag 14 post-ALI wurden Zellkulturen für die RNA-Isolierung und anschließende Genexpressionsanalyse von Zellmarkern für Flimmer- bzw. Becherzellen (FOXJ1, MUC5AC) mittels qPCR lysiert, und normiert für RPL13A (n = 3 Donoren). Eine Faltenzunahme wird gegenüber ALI-PBEC gezeigt, die mit 50 nM RA kultiviert und als Mittelwert ± SD dargestellt wird. (Siehe Referenz 23 für Details) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65102/65102fig05large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
In den letzten Jahren wurde die Leistungsfähigkeit alternativer Produkte im Kultursystem untersucht, wie z. B. Medien und Kulturkunststoffe. Für solche Bewertungen gab es verschiedene Gründe, darunter Änderungen in der Medienzusammensetzung durch die Hersteller, die Einführung neuer Medien sowie eine Verknappung von Produkten während der COVID-19-Pandemie (2020-2022). Es wurde beobachtet, dass ähnliche Produkte von verschiedenen Anbietern zu differenzierten Epithelzellkulturen führen, basierend auf der Bewertung von Markern von Epithelzelltypen, obwohl die endgültige zelluläre Zusammensetzung erheblich variieren kann (Abbildung 6A), während Unterschiede in TEER weniger ausgeprägt waren (Abbildung 6B). Auf der anderen Seite führten Medien von verschiedenen Anbietern zu erheblichen Unterschieden in der zellulären Zusammensetzung; Bei der Verwendung von Wendeschneidplatten verschiedener Marken hielten sich diese Unterschiede in Grenzen (Abbildung 6C). Insbesondere bei der Verwendung des Atemwegsepithelzellkulturmediums PneumaCult von STEMCELL Technologies wurde eine andere Morphologie und eine schnellere Ausbildung der sichtbaren Ziliaraktivität beobachtet. Neben diesen Beobachtungen wurde auch ein Unterschied in den TEER-Werten und ein Unterschied in der zellulären Zusammensetzung des ALI-PBEC im Vergleich zum cBD-Medium festgestellt (Abbildung 6D).
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65102/65102fig06.jpg"> Abbildung 6: Vergleich verschiedener Anbieter von Epithelzellmedium und Zellkultureinsätzen. PBEC wurden isoliert, expandiert und gut differenzierte ALI-PBEC-Kulturen etabliert. (A) ALI-PBECs wurden 14 Tage lang kultiviert und dann wurden die Zellschichten für die RNA-Isolierung lysiert. Die Genexpression von Basal-, Flimmer-, Kelch- und Keulenzellmarkern (TP63, FOXJ1, MUC5AC bzw. SCGB1A1) wurde mittels qPCR gemessen und für RPL13A und ATP5B normalisiert. n = 2 Spender; Die Balken stellen den Mittelwert ± SD dar. (B) Im Laufe von 9 Tagen nach ALI wurde der elektrische Widerstand gemessen und anschließend der TEER berechnet (Ω·cm2). n = 3 verschiedene Spender; Die Mittelwerte sind ± SD dargestellt. (C) ALI-PBECs wurden 14 Tage lang mit Zellkultureinsätzen kultiviert, die von drei verschiedenen Lieferanten bezogen wurden, und dann wurden die Zellschichten für die RNA-Isolierung lysiert. Die Genexpression von Flimmer-, Kelch- und Keulenzellmarkern (FOXJ1, MUC5AC bzw. SCGB1A1) wurde mittels qPCR gemessen und für RPL13A normalisiert. n = 18 verschiedene Donoren, die Balken stellen den Mittelwert ± SD dar. Die Daten wurden mit einem unidirektionalen ANOVA-nichtparametrischen Kruskal-Wallis-Test auf Signifikanz getestet und es wurde kein signifikanter Unterschied gefunden. (D) ALI-PBECs wurden entweder in cBD-Medium oder PneumaCult-Medium (STEMMCELL-Technologien) für 14 Tage nach ALI kultiviert, und dann wurden die Zellschichten für die RNA-Isolierung lysiert. Die Genexpression von Basal-, Flimmer-, Kelch- und Keulenzellmarkern (TP63, FOXJ1, MUC5B bzw. SCGB1A1) wurde mittels qPCR gemessen und für RPL13A normalisiert (die Balken stellen den Mittelwert ± SD dar), und der elektrische Widerstand wurde an den Tagen 5 und 12 nach ALI gemessen und zur Berechnung des TEER (Ω·cm2) verwendet. n = 2; der Mittelwert ist ± SD dargestellt (Details siehe Referenz 23). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65102/65102fig06large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
Ergänzende Tabelle 1: Zusammensetzung der im Protokoll verwendeten Lösungen und Medien. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65102/Supplementary%20Table%201.xlsx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>

In dieser Arbeit wird eine reproduzierbare, kostengünstige und robuste Methode zur Isolierung und Expansion von primären Bronchialepithelzellen für das langfristige Biobanking und die Erzeugung differenzierter Epithelzellen durch Kultur an der Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche vorgestellt.

Isolierung von Bronchialepithelzellen aus reseziertem Lungengewebe für Biobanken und Etablierung gut differenzierter Luft-Flüssigkeits-Grenzflächenkulturen

The airway epithelial cell layer forms the first barrier between lung tissue and the outside environment and is thereby constantly exposed to inhaled ...

Dieses Protokoll ist für eine robuste und kostengünstige Methode gedacht, die verwendet werden kann, um eine Vielzahl von Forschungsfragen im Zusammenhang mit der Funktion und der Rolle von Atemwegsepithelzellen bei Gesundheit und Krankheit zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie zu einer Zellschicht führt, die eine gute Darstellung der menschlichen Epithelzellschicht darstellt, einschließlich der Schleimproduktion und der Ziliaraktivität. Diese Technik ist vielseitig und kann verwendet werden, um krankheitsbedingte Beleidigungen oder Therapien zu untersuchen.Spülen Sie zunächst den aus menschlichem Lungengewebe isolierten Bronchialring mit 10 Millilitern sterilem PBS in einer 10 Zentimeter großen Petrischale. Während Sie den Ring mit einer Pinzette halten, verwenden Sie eine kleine Schere, um überschüssiges Bindegewebe und Blutreste zu entfernen. Schneiden Sie den Ring in zwei Teile und tauchen Sie zwei Hälften in 10 Milliliter vorgewärmte Protease 14-Lösung in HBSS mit Primocin in einem geschlossenen, sterilen Behälter.Inkubieren Sie die Bronchialringstücke zwei Stunden lang bei 37 Grad Celsius. Übertragen Sie die Stücke nach der Inkubation in eine Petrischale mit 10 Millilitern warmem PBS und kratzen Sie mit einer gebogenen Pinzette das Innere des Rings ab, um eine Zelllösung zu erhalten. Werfen Sie den Ring weg.Übertragen Sie die Zelllösung in ein 50-Milliliter-Röhrchen und fügen Sie warmes PBS hinzu, um ein Endvolumen von 50 Millilitern zu erhalten. Zentrifugieren Sie die Zelllösung und saugen Sie den Überstand ab, bevor Sie das Pellet in 10 Milliliter warmem PBS wieder suspendieren. Füllen Sie das Volumen mit PBS auf 50 Milliliter auf und wiederholen Sie die Zentrifugation.Suspendieren Sie das Pellet erneut in warmem, vollständigem KSFM, das Primocin enthält. Als nächstes ersetzen Sie die Beschichtungslösung von der Sechs-Well-Platte durch zwei Milliliter Zellsuspension pro Well. Lassen Sie die Zellen wachsen, bis eine Konfluenz von 80 bis 90 % erreicht ist. Für die Kryokonservierung von PBECs wird das Medium aus den Vertiefungen abgesaugt und die Zellen einmal mit zwei Millilitern warmem PBS pro Vertiefung gewaschen.Trypsinisieren Sie die Zellen durch Zugabe von 500 Mikrolitern weichem Trypsin pro Vertiefung und inkubieren Sie sie fünf bis 10 Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Schwenken Sie die Trypsinlösung und lösen Sie die Zellen, indem Sie vorsichtig auf die Platte klopfen. Die abgelösten Zellen werden in ein 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen mit Soja-Trypsin-Inhibitor überführt.Zentrifugieren Sie die Suspension und entsorgen Sie den Überstand, bevor Sie das Pellet in 10 Milliliter KSFM, das Penicillin und Streptomycin enthält, wieder suspendieren. Nachdem Sie die Zellen auf einem automatischen Zellzähler gezählt haben, suspendieren Sie die Zellen wieder auf eine Konzentration von 400.000 Zellen pro Milliliter in einem gefrierenden Medium und fügen Sie einen Milliliter dieser Suspension in ein Kryo hinzu. Füllen Sie die Fläschchen in einen Kühlzellenbehälter und stellen Sie ihn bei minus 80 Grad Celsius.Nach 24 Stunden werden die Fläschchen zur Langzeitlagerung auf minus 196 Grad Celsius flüssigen Stickstoff umgefüllt. Um einen T75-Zellkulturkolben zu beschichten, fügen Sie 10 Milliliter Beschichtungslösung in PBS hinzu und schließen Sie den Deckel fest, bevor Sie den Kolben bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid in einen Inkubator stellen. Ersetzen Sie am nächsten Tag die Beschichtungslösung aus dem Kolben durch 10 Milliliter komplettes KSFM.Lassen Sie das Medium im Inkubator mit leicht geöffnetem Deckel auf 37 Grad Celsius erwärmen, damit der Inkubator auslüften kann. Tauen Sie die kryokonservierten PBECs schnell in einem 37 Grad Celsius heißen Perlenbad auf. Geben Sie den gesamten Inhalt des Kryos in den vorgewärmten T75-Kolben und verteilen Sie die Zellen gleichmäßig.Nachdem Sie sich vergewissert haben, dass die Zellen fest anhaften, ersetzen Sie das Medium durch 10 Milliliter frisches und warmes komplettes KSFM und lassen Sie sie wachsen, bis eine Konfluenz von 80 bis 90 % erreicht ist. Beschichten Sie die Zellkultureinsätze mit 400 Mikrolitern Beschichtungslösung pro Einsatz und inkubieren Sie sie über Nacht bei 37 Grad Celsius. Trypsinisieren Sie die PBECs im Kolben, indem Sie zwei Milliliter weiches Trypsin hinzufügen, und inkubieren Sie sie fünf bis 10 Minuten lang.Erleichtern Sie die Zellablösung durch Schwenken und leichtes Klopfen des Kolbens. Als nächstes geben Sie vier Milliliter Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor in den Kolben und geben die Zellsuspension in ein 25-Milliliter-Röhrchen. Zentrifugieren Sie die Suspension und suspendieren Sie das Pellet erneut in sechs Millilitern des vollständigen BD-Mediums.Zählen Sie die Zellen auf einem automatischen Zellzähler. Entfernen Sie nach dem Beschichten die Beschichtungslösung aus den Einsätzen. Verdünnen Sie die Zellsuspension mit vollständigem BD-Medium, das mit einem Nanomol EC 23 ergänzt wird, und geben Sie 500 Mikroliter auf die Oberseite der Membran der Einsätze.Geben Sie 1,5 Milliliter komplettes BD-Medium in die Vertiefung unter dem Einsatz. Wenn die Zellen für den Transfer in die Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche (ALI) bereit sind, entfernen Sie das Medium aus den Einsätzen und der Vertiefung und geben Sie ein neues, vollständiges BD-Medium, das nur mit 50 Nanomolar EC 23 ergänzt wird, in die Vertiefung. Wechseln Sie das Medium in den Vertiefungen dreimal pro Woche.Um überschüssigen Schleim und Zelltrümmer zu entfernen, fügen Sie vorsichtig 200 Mikroliter warmes PBS auf der apikalen Seite der Zellschicht im Inneren des Einsatzes hinzu und inkubieren Sie es 10 Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Nach der Inkubation wird das PBS abgesaugt, das überschüssigen Schleim und Zelltrümmer enthält. Der TEER wurde gemessen, um die Qualität der ALI-PBEC-Kulturen zu beurteilen.Nach sieben Tagen gilt der elektrische Widerstand der Zellschicht von mehr als 300 Ohm als erfolgreiche Kultur. Darüber hinaus verringerte sich die Variabilität des elektrischen Widerstands zwischen den Donoren im Laufe der Zeit zwischen dem siebten und dem 14. Tag der Kultivierung an der Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche und wird deutlich durch die Herkunft des verwendeten DMEM beeinflusst. Alle wichtigen verschiedenen Zelltypen, wie Basal-, Flimmer-, Kelch- und Keulenzellen, wurden nach 14-tägiger ALI-Kultur beobachtet, und die Expressionsniveaus waren spenderabhängig.Unter den verschiedenen Konzentrationen von EC 23 wurde ein maximaler TEER bei 50 Nanomolaren beobachtet. Ein Vergleich von Retinsäure und ihrem synthetischen Analogon EC 23 bestätigt, dass die Genexpression von Markern für Flimmer- und Kelchzellen zwischen 50 nanomolaren EC 23 und Retinsäure ähnlich war. Die Verwendung von Medien von verschiedenen Anbietern führte zu erheblichen Unterschieden in der zellulären Zusammensetzung, während die Unterschiede im TEER weniger ausgeprägt waren.Andererseits führte die Verwendung von Inserts verschiedener Anbieter nicht zu wesentlichen Unterschieden in der zellulären Zersetzung. Darüber hinaus wurde ein Unterschied in den TEER-Werten und der zellulären Zusammensetzung des ALI-PBEC- und des PneumaCult-Mediums im Vergleich zum vollständigen BD-Medium beobachtet. Wenn die Zellen bereit sind, in ALI zu transferieren, erhöhen Sie die EC 23-Konzentrationen.Zentrifugieren Sie die Zellen nach dem Auftauen auch nicht und entfernen Sie die Zellen nach der Zugabe von SBTI schnell aus Zellkulturkunststoffen. Mit Hilfe von Kulturen von Atemwegsepithelzellen, wie es in diesem Protokoll vorgesehen ist, können Sie dies mit einer Vielzahl von Analysemethoden verfolgen, um z. B. die Funktion, die Genexpression, die Mediatorproduktion der Atemwegsepithelzellen zu untersuchen und so beispielsweise einen Einblick in die Folgen einer Exposition gegenüber z. B. Zigarettenrauch zu erhalten. Der nächste Schritt für dieses Zellkulturprotokoll ist die Integration weiterer Zelltypen, wie z. B. Immunzellen oder Gefäßzellen, um die Geweberepräsentation zu erhöhen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

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