Isolation der Native Soil Mikroorganismen mit Potenzial für den Abbau von biologisch abbaubaren Kunststoff Mulch Films in der Landwirtschaft eingesetzt

Das übergeordnete Ziel des folgenden Versuchs ist es, Bodenpilze und Bakterien zu isolieren, die biologisch abbaubare Mulchfolien besiedeln und abbauen. Dies wird erreicht, indem biologisch abbaubare Mulchfolien in Netzbeuteln zunächst lange genug im Boden inkubiert werden, um eine substanzielle Besiedlung durch einheimische Bodenmikroben zu ermöglichen. Nach der Inkubation werden die Mulche extrahiert und verdünnt, wodurch einzelne isolierte Kolonien jeder kultivierbaren Art von eng miteinander verbundenen Mikroben entstehen.

Dann werden isolierte Mikroben auf frische, nicht befallene, biologisch abbaubare Mulche sowie auf Agarplatten mit oder ohne Kohlenstoffquelle geflickt. Um das Wachstum vergleichen zu können, werden die Ergebnisse dann in flüssigem Medium bestätigt. Die Ergebnisse zeigen eine Besiedlung und/oder Degradation durch bestimmte Isolate auf der Grundlage der Rasterelektronenmikroskopie und können durch Gelpermeationschromatographie verifiziert werden.

Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit nicht identifizierten Pilz- und Bakterienisolaten gefährlich sein kann, und bei der Durchführung dieses Verfahrens sollten immer Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden, z. B. das Tragen von Handschuhen, das Versiegeln von Kulturröhrchen und -schalen und das Arbeiten in einer Biosicherheitswerkbank. Nach dem Inkubieren von Mulchstücken in Erde und der Vorbereitung von Medien und Reagenzien gemäß dem Textprotokoll werden neue Mulchstücke in 4,25 Zentimeter große Quadrate geschnitten, um die Mulchstücke zu dekontaminieren. Autoklavieren Sie sie, wenn sie nicht verändert oder zersetzt werden, z. B. für nicht autoklavierbare Mulchstücke, z. B. aus Kunststoffen.

Nachdem Sie eine Biosicherheitswerkbank gemäß dem Textprotokoll vorbereitet haben, legen Sie die Mulchstücke in Reihen in die dekontaminierte Haube und inkubieren Sie die Mulchstücke zwei Stunden lang unter UV-Licht, wobei Sie eine saubere sterilisierte Pinzette verwenden und mit der ersten Reihe beginnen und sich nach hinten vorarbeiten, um zu vermeiden, dass Hände und Arme über die neu dekontaminierten Oberflächen gelegt werden. Drehen Sie die Mulchstücke um und legen Sie die nicht befallene Seite nach unten auf eine saubere Stelle, die UV-Licht ausgesetzt ist, aber noch nicht mit Mulch in Berührung gekommen ist. Nach zwei Stunden UV-Behandlung auf jeder Seite wieder von vorne nach hinten arbeiten.

Entfernen Sie die Mulchstücke mit einer sterilen Pinzette aus der Biosicherheitswerkbank und legen Sie sie in sterile, trocken abgedeckte Behälter, wie z. B. mit Folie bedeckte Becher. Lagern Sie sie bei Raumtemperatur im Dunkeln unter einer sterilen Transferhaube. Legen Sie die UV-befallenen Mulchstücke mit aseptischer Technik auf die Oberfläche der Agarplatten, indem Sie eine Ecke zuerst und vorsichtig aufsetzen und den Rest des Quadrats in Kontakt mit dem Agar rollen lassen.

Bei nicht wasserdurchlässigen Folien geben Sie vier 10-Mikroliter-Tropfen geschmolzenes, halbfestes, minimales Medium auf die Ecken der Mulchstücke, um eine Wasser- und Nährstoffquelle für die erste Besiedlung von hydrophoben Kunststoffen zu schaffen. Berühren Sie nicht die Oberfläche der Mulchstücke. Mit der Pipettenspitze härten die Tropfen zu Kügelchen aus.

Inkubieren Sie die abgedeckten Platten aufrecht über Nacht bei Raumtemperatur, damit sie fest werden. Lagern Sie die Platten dann mit der Agar-Seite nach oben im Dunkeln bei vier Grad Celsius. Alle für die Biotests erforderlichen Materialien sind nun vorbereitet und Sie können mit der Isolierung potenzieller mulchschädigender Pilze aus Mulchstücken beginnen, die im Boden vergraben wurden.

Graben Sie Netzsäcke aus der Erde aus und entfernen Sie Mulchstücke aus den Netzsäcken. Verwenden Sie einen sterilen Spachtel und eine Pinzette, um die überschüssige Erde vorsichtig von den Mulchen zu entfernen, ohne die an der Oberfläche haftende Erde zu stören. Schneiden Sie die BDM-Folie in einen Zentimeter große Stücke, bis 0,5 Gramm Material zurückgewonnen sind.

Für jeden Wiederholungsprobentransfer werden 0,5 Gramm Mulchstücke und anhaftende Erde in 25 Milliliter umgewandelt. Kulturröhrchen mit 9,5 Millilitern PBS geben 0,5 Gramm Erde in den Boden, nur Kontrollröhrchen oder in Proben, bei denen der Mulch vollständig abgebaut wird, um Biofilme aufzubrechen und Zellen von Mulchstücken zu lösen. Wirbeln Sie die Röhren 30 Sekunden lang bei hoher Geschwindigkeit ein, beschallen Sie sie dann 10 Minuten lang in einem Wasserbad und wirbeln Sie sie erneut ein.

Dadurch soll eine homogene Suspension der mikrobiellen Zellen entstehen, die mit den Mulchstücken assoziiert wurden. Für eine serielle Verdünnung von Proben. Bereiten Sie ein Kulturröhrchen mit 4,5 Millilitern sterilem PBS vor und füllen Sie drei Vertiefungen einer Deep-Well-Platte mit 450 Mikrolitern PBS pro Probe aus den ursprünglichen Suspensionsröhrchen.

Übertragen Sie 0,5 Milliliter in die 4,5 Milliliter steriles PBS, um eine 5,0-fache 10-fache bis negative dritte Verdünnung zu erhalten, nachdem Sie 30 Sekunden lang mit hoher Geschwindigkeit vortexiert haben, fügen Sie 50 Mikroliter bis 450 Mikroliter PBS in der 96-Well-Plattenmischung hinzu, indem Sie 10 Mal vorsichtig auf und ab pipettieren und wiederholen, bis Verdünnungen von bis zu 5,0 mal 10 bis zu minus sechs abgeschlossen sind. Verwenden Sie flammsterilisierte gebogene Glasstäbe, um 100 Mikroliter aus jeder der Verdünnungen gleichmäßig auf der Agaroberfläche von PDA-Platten zu verteilen, die Chloramphenicol enthalten, um das Bakterienwachstum zu hemmen. Lagern Sie die Teller 30 Minuten lang aufrecht, damit die Flüssigkeit einziehen kann.

Versiegeln Sie dann die Platten mit Paraform, um zu verhindern, dass Sporen aus nicht identifizierten Isolaten entweichen. Inkubieren Sie umgedrehte Platten fünf Tage lang bei 20 Grad Celsius in der Dunkelheit, damit sowohl schnell als auch langsam wachsende Pilze in einer Biosicherheitswerkbank Kolonien bilden können. Untersuchen Sie die Verdünnungsplatten für einzelne isolierte Kolonien mit einem einzigen sterilen Zahnstocher.

Berühren Sie vorsichtig eine Kolonie und berühren Sie dann den Agar aus Pilz-Minimalmedium, Pilz-Minimalmedium plus Kunststoff- und Glukose-Minimalmediumplatten, um Agarkügelchen auf Plastikfolien zu impfen. Reiben Sie den Zahnstocher vorsichtig über die Oberfläche des Agar-Punktes und streichen Sie dann über die Plastikfolie. Wiederholen Sie die Inokulation aus derselben Quellkolonie, bis es vier sind.

Replizieren Sie Schlieren auf jeder Platte, nachdem Sie die Platten fünf Tage lang bei 20 Grad Celsius im Dunkeln inkubiert haben. Vergleichen Sie Platten, um Isolate zu identifizieren, die auf Mulchstücken besser wachsen als auf minimalem Medium, das außer Agar keinen zusätzlichen Kohlenstoff enthält. Dies sind potenzielle Mulchabbauer.

Die GMM-Platte sollte das meiste Wachstum enthalten, da es sich um eine Positivkontrollplatte handelt, in der das Medium Glukose enthält. Bodenisolate sind zu diesem Zeitpunkt möglicherweise noch nicht ganz rein, also verwenden Sie einen sterilen Zahnstocher, um das Inokulum vom Pilz abzukratzen, den Mulch zu besiedeln und ihn zur Isolierung auf Kartoffel-Dextrose-Agar zu streifen, dann die Platte zu versiegeln und fünf Tage lang zu inkubieren. Nach der fünftägigen Inkubation sind einzelne isolierte Völker entstanden.

Bestätigen Sie, dass diese neuen gereinigten Kolonien im Platten-Bioassay eine Mulchbesiedlung aufweisen, die derjenigen ähnelt, die bei den ursprünglichen potenziell unreinen Isolaten beobachtet wurde. Sobald potenzielle Mulchabbauer durch den Platten-Bioassay identifiziert wurden, der mit einem Flüssig-Bioassay in diesem abschließenden Bestätigungsassay verifiziert wurde, fehlt sogar Agar unter dem Mulch. Stücke sind wirklich die einzige Kohlenstoffquelle für das mikrobielle Wachstum in diesem streng vorbereiteten Medium, um den Assay an einem nicht von der Oberfläche befallenen Mulchstück auf einem Pilzmedium zu beginnen, das für jede Wiederholung eines mikrobiellen Isolats keinen anderen zugesetzten Kohlenstoff enthält.

Bereiten Sie drei Röhrchen für die Inokulation vor. Eines, ein Versuchsrohr mit fünf Millilitern minimalem Medium, hier mit der Bezeichnung FMM, das ein Mulchstück der vorgegebenen Größe enthält. Zweitens, eine Negativkontrolle mit fünf Millilitern minimalem Medium ohne Kohlenstoffquelle.

Und drittens eine Positivkontrolle mit fünf Millilitern glukosehaltiger Flüssigkeit. Hier mit GMM beschriftet. Bereiten Sie außerdem ein Replikröhrchen mit minimalem Medium vor, das jeden zu testenden Mulch enthält, aber impfen Sie ihn nicht.

Dieses Kontrollröhrchen zeigt jegliches mikrobielles Wachstum auf, das aus der Kontamination nach dem Züchten und Sammeln frischer Sporen resultiert. Gemäß dem Textprotokoll werden in einer sterilen Transferhaube die zuvor vorbereiteten Kulturröhrchen mit einer Million Sporen oder Hefezellen beimpft, die Verschlüsse verschlossen und im Dunkeln ohne Schütteln bei 20 Grad Celsius inkubiert. Beobachten Sie die Proben wöchentlich auf Wachstum.

Das Myzelwachstum von Pilzen auf Mulchstücken kann innerhalb der ersten Woche nach der Inokulation sichtbar sein, insbesondere an den Rändern der Mulchstücke, da planktonische Hefen das Wachstum durch optische Dichtemessungen bei 600 Nanometern überwachen, da filamentöse Pilze wahrscheinlich direkt an den Mulchstücken haften. Beurteilen Sie das Wachstum mit dem Auge und bestätigen Sie es durch Lichtmikroskopie und/oder Rasterelektronenmikroskopie in nur minimalen Mediumkontrollen. Suchen Sie nach winzigen weißen Flexen, die zu klein sind, um eine Änderung der optischen Dichte zu registrieren.

Mit spektrophotometrischen Methoden. Verwenden Sie eine Pasterpipette, um den Flex anzusaugen und ihn mit differentieller Interferenz zu beobachten. Kontrastmikroskopie nach Isolierung von drei potenziell mulchabbauenden Isolaten im Platten-Bioassay sowohl aus einem Zellulose-Mulch namens Weed Guard Plus, der unsere Positivkontrolle war, als auch aus einem stärkebasierten Kunststoffmulch namens Biore.

Sie wurden 68 Tage lang im Flüssig-Bioassay inkubiert und geerntet, bevor sie einer Rasterelektronenmikroskopie unterzogen wurden. Erwartungsgemäß. Pilzhyphy wurde bei allen Proben beobachtet, mit Ausnahme von XX und YY, wo stäbchenförmige Zellen für die Isolate auf unserem Zellulose-Kontrollmulch beobachtet wurden.

Bei den FMM-Kontrollen wurde kein Wachstum beobachtet, wie hier bei den UN-Kontrollen für den Unkrautschutz und den Mulchreste der Luftröhre der pflanzlichen Fasern war nur als leichte Pockenmarkierung in Reihen auf einigen der Fasern nachweisbar, obwohl Pilzhyphy in allen drei inokulierten Proben unseres Zellulose-Kontrollmulchs beobachtet wurde. Tracheöse Elemente waren nur in den SS-Proben deutlich sichtbar, was darauf hindeutet, dass der Aufschluss von zellulosehaltigem Material die verholzten Luftröhrenelemente unter dem Isolat enthüllte. SS wurde vorläufig unter Verwendung von 18 s ribosomaler DNA als Soda Mye innerhalb der Ordnung Soda-Soden für den stärkebasierten Kunststoffmulch identifiziert. Bei den Isolaten wurde kein signifikantes Wachstum beobachtet, sondern nur bei den Kontrollen, einzelne weiße Flecken, die beim Verwirbeln in den Kulturröhrchen der Isolate sichtbar waren, VV und ZZ wurden mit Hilfe der differentiellen Interferenzkontrastmikroskopie für das Isolat VV beobachtet.

Bei der Spezifikation handelte es sich um eine Sporenmasse, vermutlich ein Überbleibsel der Erstimpfung. Für isolate zz. Die Masse bestand aus einem lockeren Netz aus Hyphy mit einem Durchmesser von etwa 0,2 Millimetern, was darauf hindeutet, dass das ursprüngliche Sporeninokulum gekeimt, aber nicht über die hier abgebildete Masse hinausgewachsen war.

Wie hier bei den UN-Impfkontrollen für den stärkebasierten Kunststoffmulch zu sehen, ist eine holprige Textur zu beobachten. Die Identität der weißen Merkmale ist unbekannt, aber sie fehlen in einem Film, der hier mit dem Isolat VV besiedelt ist. Sowohl die weißen Partikel als auch die Beulen sind in einem Film verschwunden, der von Isolat zz besiedelt ist.

Darüber hinaus zeigte die letztere Probe das gleichmäßige Auftreten von Fissuren über die BDM-Oberflächenisolate hinweg. VV und ZZ wurden vorläufig anhand von at s ribosomaler DNA als Penicillium und ACE in der Größenordnung von Hypo identifiziert. Obwohl diese Methode Aufschluss über den biologischen Abbau von Kunststoffmulchen für die Agrarindustrie geben kann, kann sie auch auf jeden anderen Kunststoff angewendet werden, dessen biologischer Abbau in der Umwelt in Frage gestellt wird.

Zum Beispiel Kunststoffe, die in die Meeresumwelt gelangen könnten. Werden diese für die Lebensmittelindustrie verwendet? Ich.