Einführung in die Lichtmikroskopie

Das Lichtmikroskop ist ein Instrument, das zur Vergrößerung von wissenschaftlichen Präparaten dient. Lichtmikroskope sind wertvolle analytische Instrumente, die es dem Wissenschaftler ermöglichen Objekte bis zu 1000 Mal größer als ihre normale Größe anzuschauen. Wie ihr sehen werdet, ist das Funktionsprinzip des Lichtmikroskops sehr einfach. Es hat allerdings schier endlose Anwendungen für das Abbilden von Präparaten im Labor.

Wie der Name schon sagt, braucht das Lichtmikroskop eine Lichtquelle, die Licht produziert, welches mit einer Kondensorlinse auf das Präparat fokussiert werden kann.

Das Licht, das das Präparat beleuchtet, geht zu einer Objektivlinse, in der ein umgekehrtes und vergrößertes Bild entsteht. Das Okular, genauer: die Linse im Okular, vergrößert das Bild nochmals, welches dann durch das Auge wahrgenommen werden kann. Zusätzliche optische Elemente können in den Strahlengang gesetzt werden um das Bild aufzurichten, so dass man es in der richtigen Orientierung betrachten kann. Mikroskope mit mehreren Linsen, wie dieses hier, werden zusammengesetzte Mikroskope genannt.

In einem zusammengesetzten Mikroskop wird die absolute Vergrößerung berechnet, indem man die Vergrößerungen der Objektivlinse und der Okularlinse multipliziert. Mit einer 40X Objektivlinse und einer 10X Okularlinse ist die Gesamtvergrößerung dementsprechend 400X.

Um die Größe eines Objektes unter dem Mikroskop zu bestimmen, benutzt man ein Fadenkreuz, also eine Art Skala, die über das Bild projiziert wird. Bei einer höheren Vergrößerung bedeuten die Skalenstriche im Fadenkreuz kleinere Längen als bei kleineren Vergrößerungen.

Zusätzlich zu der Vergrößerung ist ein anderer wichtiger Aspekt der Mikroskopoptik die Auflösung. Auflösung bezieht sich auf den kleinsten noch wahrnehmbaren Abstand zwischen zwei verschiedenen Objekten unter dem Mikroskop. Wenn die Köpfe dieser Strichmännchen immer klarer werden, bedeutet das, das die Auflösung größer und die kleinste wahrnehmbare Distanz zwischen ihnen kleiner wird.

Die Hauptbestandteile eines Lichtmikroskops sind die Objektive, das Okular, der Objekttisch und der Objekthalter, die Lichtquelle, die Feldblende, der Kondensor und die Apertur, und der Grob- und Feintrieb.

Die Objektive sind für den größten Teil der Vergrößerung und für die Auflösung des Mikroskops zuständig. Sie sind so auf einem Objektivrevolver aufgesetzt, das wenn man zwischen verschiedenen Objektiven wechselt, die Brennebene die Gleiche bleibt – eine Eigenschaft die man Parafokalität nennt. Auf dem Objektiv steht normalerweise die Vergrößerung, die numerische Apertur oder NA, die Art des Immersionsmediums das benutzt werden muss, die Dicke des Deckglases das verwendet werden soll, und die Arbeitsdistanz, also der Entfernung von der Spitze der Linse zur Brennebene.

Die numerische Apertur, wie schon erwähnt als NA definiert, misst wie gut das Mikroskopobjektiv Licht sammeln kann. Objektive mit hoher NA Nummer erlauben das Licht mit einem schiefen Winkel einstrahlt, während Objektive mit niedriger NA Nummer nur sehr direkt einstrahlendes Licht aufnehmen können. Die Auflösung eines Objektivs kann von der numerischen Apertur berechnet werden, wenn die Wellenlänge des Lichts bekannt ist.

Die Lichtquelle, Feldblende, Apertur und der Kondensor sind alle verantwortlich um das Licht zu produzieren und zu formen, welches dann das Präparat durchleuchtet. Eine Lichtquelle ist typischerweise eine Niederspannung Halogenlampe, die auf die gewünschte Intensität eingestellt werden kann. Das Licht wird dann durch verschiedene Filter in die Feldblende geleitet, welche die Fläche, die beleuchtet werden soll, bestimmt. Danach kommt der Kondensor, der das helle, gleichförmige Licht auf das Präparat fokussiert. Der Lichtkegel um das Präparat wird von dem Kondensor kontrolliert und muss abhängig vom Objektiv neu eingestellt werden.

Zum Benutzen eines Lichtmikroskops legt man zuerst das Präparat auf den Objekttisch und zentriert es direkt unter dem Objektiv. Man sichert das Präparat auf dem Objekttisch mit den Objektklammern.

Nun schaltet man die Lichtquelle an und wählt das Objektiv mit der niedrigsten Vergrößerung aus.

Danach fokussiert man das Objektiv mit der niedrigsten Vergrößerung, indem man den Objekttisch vertikal erst mit dem Grobtrieb verstellt, und dann den Feintrieb benutzt um das Präparat scharf zu stellen. Man muss allerdings vorsichtig sein, damit man nicht den Objektträger oder den Objekttisch mit dem Objektiv berührt, weil so die Linse beschädigt werden kann.

Dann sucht man die zu abzubildende Fläche durch das Okular aus, während man den Objekttisch in der x-y Fläche verschiebt. Die Größe des abzubildenden Feldes verkleinert sich drastisch, wenn man von einer niedrigen zu einer höheren Vergrößerung wechselt. Wenn man das Präparat zuerst mit der niedrigsten Vergrößerung zentriert, erhöht das die Wahrscheinlichkeit die richtige Stelle zu finden.

Wenn die richtige Stelle gefunden und fokussiert worden ist, wechselt man zu einem Objektiv mit höherer Vergrößerung, mit dem man das Bild aufnimmt.

Nun optimiert man die Qualität der Beleuchtung, indem man zuerst die Feldblende so einstellt, das die Blende selbst, knapp außerhalb des Feldes ist. Jetzt stellt man die Aperturblende so ein, dass sie mit der NA Nummer des Objektivs übereinstimmt.

Nun stellt man das Bild nochmals scharf, diesesmal allerdings nur mit dem Feintrieb. Jetzt kann man das Präparat abbilden.

Mit einem Lichtmikroskop kann man viele verschiedene Präparate abbilden. Außerdem gibt es viele verschiedene Konfigurationen des zusammengesetzten Mikroskops, die für verschiedene Anwendungen geeignet sind.

Hier sieht man einen Forscher der sich gerade vorbereitet um mit einem Operationsmikroskop zu arbeiten. Diese Art von Mikroskop ist normalerweise mit einem bewegbaren Arm ausgestattet und ist stereoskopisch, das heißt das Licht sowohl an den Betrachter als auch an eine Kamera weitergegeben wird. Dieses Operationsmikroskop wird für eine Nierentransplantation einer Maus gebraucht.

In diesem Film sieht man wie ein Forscher mit einem Seziermikroskop arbeitet, um eine Drosophila Larve zu finden, bei der dann durch weiteres sezieren Muskeln freigelegt werden sollen, um die neuromuskuläre Endplatte zu untersuchen.

Hier sieht man ein umgekehrtes Mikroskop, bei dem das Objektiv unter dem Objekttisch angebracht ist, und das für ein Mikroinjektionsexperiment vorbereitet wird. Dieses Verfahren, auch als somatischer Zellkerntransfer bekannt, ist eine wichtige Methode um transgene Tiere und Klone herzustellen.

Das war die Einführung in die Lichtmikroskopie von JoVE. In diesem Video haben wir behandelt was ein Mikroskop ist und wie es funktioniert, welche Bestandteile es hat, wie man es einstellt und wie man Bilder von guter Qualität aufnimmt. Danke für eure Aufmerksamkeit!