1.13: Einführung in die Lichtmikroskopie

Das Lichtmikroskop ist ein Instrument zur Vergrößerung von Forschungspräparaten. Lichtmikroskope sind ein unschätzbares Analysewerkzeug, das es wissenschaftlichen Forschern ermöglichen kann, Objekte in der 1000-fachen Größe ihrer ursprünglichen Größe zu betrachten. Wie Sie sehen werden, funktioniert das Lichtmikroskop nach einigen sehr grundlegenden Prinzipien, hat aber nahezu unbegrenzte Anwendungen für die Visualisierung von Proben im Labor.

Wie der Name schon sagt, benötigt das Lichtmikroskop eine Lichtquelle, die Licht erzeugt, das durch eine Kondensorlinse auf die Probe fokussiert werden kann.

Das Licht, das die Probe beleuchtet, erreicht eine Linse, die als Objektivlinse bekannt ist und ein vergrößertes Bild erzeugt, das invertiert oder auf den Kopf gestellt wird. Das Okular oder die Okularlinse vergrößert das Bild weiter, das das Auge dann erhält. Zusätzliche optische Elemente können in den Strahlengang eingebracht werden, um das Bild zu korrigieren, so dass das Auge es in der richtigen Ausrichtung sieht. Mikroskope, die mehrere Linsen verwenden, wie das hier gezeigte, werden als Verbundmikroskope bezeichnet.

In einem Verbundmikroskop wird die Gesamtvergrößerung berechnet, indem die Vergrößerung der Objektivlinse mit der Vergrößerung der Okularlinse oder des Okulars multipliziert wird. Mit einer 40-fachen Objektivlinse und einer 10-fachen Okularlinse beträgt die Gesamtvergrößerung das 400-fache.

Um die Größe von Objekten unter dem Mikroskop abzuschätzen, kann ein Okularabsehen, eine Skala, die über das Bild projiziert wird, verwendet werden. Bei höherer Vergrößerung stellen die Teilstriche im Okularabsehen kleinere Entfernungen dar als bei niedrigeren Vergrößerungen.

Neben der Vergrößerung ist ein weiterer Aspekt der Mikroskopoptik die Auflösung. Die Auflösung bezieht sich auf die kürzeste auflösbare Entfernung zwischen zwei Objekten innerhalb des Oszilloskops. In dem Maße, wie die Köpfe dieser Zeichen immer klarer werden und die Auflösung zunimmt, verringert sich der kürzeste beobachtbare Abstand zwischen ihnen.

Zu den Hauptkomponenten des Lichtmikroskops gehören die Objektive, die Okulare, der Probentisch und der Probenhalter, die Lichtquelle, die Feldblende, der Kondensor und die Apertur sowie die Grob- und Feinfokusknöpfe.

Die Objektive sind für den größten Teil der Vergrößerung und Auflösung des Mikroskops verantwortlich. Sie sind so auf einem drehbaren Objektivrevolver montiert, dass bei einem Wechsel der Objektive die Fokusebene gleich bleibt ? Eine Eigenschaft, die als Parafokalität bezeichnet wird. Ein Objektiv kann mit der Vergrößerung, der numerischen Blende oder NV, der Art des erforderlichen Immersionsmediums, der Deckglasdicke, die bei der Aufnahme von Proben verwendet werden sollte, und dem Arbeitsabstand - dem Abstand von der Spitze des Linsenelements zur Brennebene in der Probe - gekennzeichnet werden.

Die numerische Apertur, wiederum definiert als N.A., ist ein Maß dafür, wie gut ein Mikroskopobjektiv Licht sammeln kann. Objektive mit hohem N.A.-Gehalt lassen Licht in schrägen Winkeln durch, während Objektive mit niedrigem N.A.-Gehalt direkteres Licht erfordern. Die Auflösung eines Objektivs kann aus der numerischen Apertur bei gegebener Wellenlänge des Lichts berechnet werden.

Die Lichtquelle, die Feldblende, die Apertur und der Kondensor sind alle für die Erzeugung des Lichts und dessen Abgabe an die Probe verantwortlich.

Die Lichtquelle ist in der Regel eine Niederspannungs-Halogenlampe, die zur Steuerung der Lichtintensität eingestellt werden kann.

Das Licht gelangt dann durch eine Vielzahl von Filtern in die Feldblende, die den Bereich der zu beleuchtenden Probe steuert.

Als nächstes kommt der Kondensor, der helles, helles Licht auf die Probe fokussiert, der Beleuchtungskegel um die Probe wird durch den Kondensor gesteuert und muss je nach verwendetem Objektiv eingestellt werden.

Um mit der Verwendung des Lichtmikroskops zu beginnen, platzieren Sie eine Probe mit dem interessierenden Bereich auf dem Mikroskoptisch, zentrieren Sie sie direkt über dem Objektiv und befestigen Sie sie mit den Tischclips.

Schalten Sie als Nächstes die Lichtquelle ein und wechseln Sie zum Objektiv mit der niedrigsten Leistung.

Fokussieren Sie als Nächstes das Objektiv mit geringer Leistung, indem Sie es mit einer ersten Einstellung des groben Einstellknopfes in z-Richtung bewegen und dann die Feineinstellknöpfe drehen, um das Objekt scharf zu fokussieren. Achten Sie darauf, dass Sie mit dem Objektiv nicht gegen den Objektträger oder den Tisch stoßen, da dies das Objektiv beschädigen könnte.

Suchen Sie dann den interessierenden Bereich, indem Sie durch die Okulare schauen, während Sie die Knöpfe einstellen, um den Schieber in x- und y-Richtung zu bewegen. Die Größe des Sichtfelds nimmt drastisch ab, wenn Sie von einer niedrigen Vergrößerung zu einer höheren Vergrößerung wechseln.

Wenn Sie das Objektiv mit der niedrigsten Leistung auf den interessierenden Bereich zentrieren, bevor Sie zu einer höheren Leistung wechseln, erhöhen Sie die Chancen, das gewünschte Exemplar zu finden, erheblich.

Sobald sich die Probe bei geringer Leistung befindet und scharf ist, wechseln Sie zum Objektiv mit höherer Leistung, das für die Bildaufnahme verwendet wird.

Optimieren Sie die Qualität der Beleuchtung, indem Sie zunächst die Feldblende so einstellen, dass sich die Blende selbst knapp außerhalb des Sichtfeldes befindet.

Stellen Sie anschließend die Kondensorblende so ein, dass die Einstellungen mit der numerischen Apertur des verwendeten Objektivs übereinstimmen.

Stellen Sie abschließend den Fokus erneut ein. Diesmal nur mit dem Feineinstellknopf.

Sie können nun Bilder von Ihrer Probe aufnehmen.

Die Lichtmikroskopie hat das Potenzial, eine Vielzahl von Proben sichtbar zu machen, und es gibt verschiedene Konfigurationen des Verbundmikroskops, die für viele verschiedene Anwendungen geeignet sind.

Hier sehen Sie einen Forscher, der sich auf die Arbeit unter einem Operationsmikroskop vorbereitet. Diese Mikroskope sind in der Regel an einem beweglichen Arm aufgehängt und stereoskopisch, was bedeutet, dass sie Licht zum Betrachter und auch zu einer am Mikroskop montierten Kamera durchlassen. Dieses Operationsmikroskop wird bei einer Nierentransplantation bei Mäusen eingesetzt.

In diesem Clip sehen Sie einen Forscher, der durch ein Präpariermikroskop schaut, während er die perfekten Drosophila-Larven für die weitere Sektion auswählt, um die Körperwandmuskulatur freizulegen, damit die neuromuskuläre Verbindung untersucht werden kann.

Hier sehen Sie ein inverses Verbundmikroskop, das ein Objektiv unter dem Tisch hat, das für eine Mikroinjektionstechnik vorbereitet wird. Dieses Verfahren, das als somatischer Zellkerntransfer bekannt ist, ist eine wichtige Methode zur Erzeugung transgener Tiere und zur Erzeugung von Klonen.

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In diesem Video haben wir uns angesehen: Was ein Mikroskop ist und wie es funktioniert, wie viele Komponenten es gibt, wie man Anpassungen an ihnen vornimmt und wie man qualitativ hochwertige Bilder aufnimmt. Danke fürs Zuschauen!