Subkultivierung von Zellen

Das Passagieren, oder Subkultivieren, von Zellen ist eine häufig angewendete Methode, bei der Zellen von einer bestimmten Kultur unter Verdünnung in eine neue Kultur überführt werden. Dabei werden neue Nährstoffe durch das frische Medium zugesetzt, um eine weitere Expansion zu ermöglichen. Eigentlich ist das Konzept an sich ziemlich einfach, aber in diesem Video erörtern wir einige wichtige Schritte für die erfolgreiche Erhaltung und Expansion von Zelllinien.

Toxische Stoffwechselprodukte sammeln sich mit der Zeit in dem Zellkulturmedium an. Wenn man die Zellen expandieren möchte, ist es besonders wichtig das Medium regelmäßig zu wechseln, um die Zellgesundheit beizubehalten und um das Zellwachstum im Auge zu behalten, so dass eine Überwucherung der Zellen vermieden wird.

Im Allgemeinen werden zwei verschiedene Arten von Zellen subkultiviert: immortale Zelllinien und Stammzelllinien.

Immortale Zelllinien sind Zellen, die von verschiedenen multizellulären Organismen erzeugt worden sind und eine bestimmte Art von Mutation enthalten, welche den Zellzyklus beeinflusst. Dadurch können sie unbegrenzt wachsen. Die vielleicht bekannteste immortale Zelllinie ist die HeLa Zelllinie, welche von einem Zervixkarzinom stammt, das 1951 bei einer Biopsie von Henrietta Lacks entnommen worden ist.

Anders als die Zelllinien, die durch Krebs immortalisiert sind, werden Stammzelllinien durch das Isolieren von sich selbst erneuernden und multipotenten Zellen aus erwachsenen oder embryonalen Geweben gewonnen. Unter den richtigen Bedingungen können diese Zellen, wie die humanen embryonalen Stammzellen, die man hier sieht, unendlich in Kultur erhalten werden.

Zellen können entweder optimal in Suspension wachsen, wie beispielsweise immortale Zellen, die aus dem Blut isoliert worden sind. Andere Zellen wachsen am besten wenn sie an eine Oberfläche haften, was der Fall für viele aus Geweben isolierte Zellen ist.

Das Wachstum der adhärenten Zellen muss im Auge behalten werden, um die optimale Zellgesundheit zu gewährleisten. Abhängig von der Zellart werden die meisten adhärenten Zellen subkultiviert, wenn sie 70-90% konfluent sind, das heißt wenn 70-90% der Oberfläche der Schale bedeckt ist.

Man sollte sich bewusst sein, dass Zelllinien zwar viele Eigenschaften der ursprünglichen Zellkultur beibehalten, aber das jede neue Subkultivierung auch zu dem Erwerb von neuen Eigenschaften, die einzigartig für die gewachsene Kultur sind, führen kann. Deshalb sollte man erwägen die Anzahl der Subkultivierungen einer einzelnen Zelllinie einzuschränken.

Wenn Zellen subkultiviert werden, ist es wichtig steril zu arbeiten und die angebrachten Reagenzien und Geräte zu benutzen.

Es ist wichtig, dass man das passende Medium für optimales Zellwachstum und die Expansion der Zelllinie benutzt. Jede Zelllinie braucht eine spezielle Wachstumsfaktormischung. Die meisten Zelllinien brauchen mindestens die folgenden Zusätze: Serum, wie zum Beispiel fetales Kälberserum, das Hitzebehandelt werden muss, um das bovine Komplement zu inaktivieren und welches die nötigen Wachstumsfaktoren für die Zellen enthält; das Antibiotikum wie Penizillin und Streptomycin, welches dabei hilft die Kontamination der Zellkultur einzuschränken; und andere Wachstumsfaktoren wie der Fibroblasten-Wachstumsfaktor, um das Wachstum und die Expansion der Zellen zu begünstigen. Das supplementierte, oder “komplette” Medium wird bei 4°C gelagert wenn man es nicht braucht.

Zuerst sollte man auf die Farbe des Zellkulturmediums achten. Frisches Zellkulturmedium, das reich an Nährstoffen ist, erscheint klar und orange, was teilweise mit dem Zusatz des pH-Indikators Phenol-Rot zusammen hängt.

Wenn die Zellen anfangen die Nährstoffe in dem Medium aufzubrauchen, sammeln sich Abfallprodukte und Säure in der Zellkultur an, die zu einer Senkung des pH-Werts führen. Deshalb sind viele Zellkulturmedien mit Phenol-Rot versetzt, welches das Medium orange-gelb erscheinen lässt, wenn die Zellen das Medium in den sauren Bereich umgeschlagen haben. Das Medium sollte gewechselt werden bevor es orange ist!

Wenn das Phenol-Rot in eine pinke Farbe umschlägt, heißt das, das der pH-Wert zu basisch für das Zellwachstum ist, und es höchste Zeit ist den Co2 Tank und das Medium zu wechseln.

Die meisten Zelllinien setzen sich ganz natürlich auf unbeschichtete Plastik ab. Deshalb werden häufig Plastikschalen, wie Petrischalen oder 6-Well-Platten, für das Subkultivieren von Zellen benutzt.

Plastikzellkultur-Flaschen werden auch benutzt. Die T25 Zellkultur-Flasche wird zum Beispiel oft verwendet, um kleine Zelllinienpopulationen zu erweitern oder um das Wachstum einer langsam wachsenden Zelllinie zu starten. T75 Zellkultur-Flaschen werden häufig für Zelllinien benutzt, die sehr schnell wachsen, oder um eine größere Anzahl von Zellen zu produzieren als in eine T25 Zellkultur-Flasche passen.

Wenn die adhärenten Zellen entfernt werden, müssen erst die Proteine, durch welche die Zellen mit der Plastikoberfläche verbunden sind, abgelöst werden. Für diesen Zweck wird das Verdauungsenzym Trypsin benutzt. Es ist wichtig, dass man bei der Trypsinierung auf die Zeit achtet, denn eine zu lange Behandlung kann zu der Schädigung der Zelloberflächenproteine führen.

Das Zellkulturmedium kann Stoffe enthalten, die das Trypsin neutralisieren. Deshalb werden die Zellen mit phosphatgepufferter Salzlösung, oder PBS, vor der Trypsinisierung gewaschen.

EDTA ist ein Kalziumchelat, das manchmal benutzt wird, um die proteolytische Funktion des Trypsins zu unterstützen.

Für die Expansion der Kolonie werden frisch passagierte Zellen in einem Brutschrank unter den angemessenen Bedingungen, die normalerweise 37°C, 5% CO2 und 95% Luftfeuchtigkeit sind, inkubiert .

Nun subkultivieren wir ein paar Zellen!

Bevor man anfängt, ist es wichtig zu verstehen wie oft die Zellen beobachtet werden müssen, was davon abhängt wie schnell die Zellen wachsen.

Nun dass das Medium eine fröhlich orange Farbe hat, sollte man sich die anderen Kulturbedingungen, zum Beispiel ob die Zellkultur trüb ist oder nicht –was möglicherweise eine Kontamination anzeigt - die Größe und Dichte der Zellkolonie und die allgemeine Qualität der Zellen, anschauen.

Wenn die Zellen circa 90% Konfluenz erreicht haben, saugt man das Zellkulturmedium ab und wäscht die Zellen mit PBS ohne Kalzium und Magnesium.

Nun gibt man Trypsin zu der Kultur hinzu und inkubiert sie bei 37°C. Nach circa 5 Minuten bestätigt man, dass die Zellen abgelöst sind und stoppt die Proteolyse durch die Zugabe von neuem Zellkulturmedium.

Nun transferiert man die Zellkultur in ein Gefäß zum Zentrifugieren. Dann, nach der Zentrifugation der Zellen, saugt man den Überstand ab ohne dabei das Pellet zu berühren, und resuspendiert die Zellen in frischem Zellkulturmedium. Nun zählt man die Zellen, die man abgelöst hat und kultiviert sie entsprechend der Dichte, die für die jetzige oder spätere Expansion benötigt wird.

Nun das wir die Zellen subkultiviert haben, schauen wir uns einige verschiedene Anwendungen der Methode an.

Wie schon vorher erwähnt sind humane embryonale Stammzellen eine Zellart, die subkultiviert werden müssen. Sie werden normalerweise mit embryonalen Fibroblasten der Maus, oder MEFs, kultiviert, welche die Faktoren herstellen, die es den Stammzellen ermöglichen ihre Pluripotenz zu erhalten.

Stammzellkolonien, die auf Fütterzellen gewachsen werden, müssen selektiert werden wenn sie ihre richtige Entwicklungsstufe erreicht haben. Sie können mit einer Mikropipette oder mit einem Glas Selektierwerkzeug selektiert, und dann in einer neuen Kultur gewachsen werden.

Einige Zelllinien sind empfindlich gegenüber enzymatischen Verdauen, oder sie binden sich so fest, dass sie nicht nur allein mit Trypsin von der Zellkulturschale abgelöst werden können. Ein Zellschaber kann benutzt werden, um die Zellen sanft von der Zellkulturschale zu entfernen. Wenn die Zellen besonders adhärent sind, kann man versuchen eine serologischen Pipette mit einer festen Schabebewegung über den Boden des Zellbehälters zu führen während man die Zellen abspült. Bei dieser mechanischen Methode sollte man jedoch vorsichtig sein, denn empfindliche Zellen können bei der Ablösung beschädigt werden.

Um schneller und reproduzierbar das Zellkulturvolumen zu erhöhen als in Einzelschicht-Flaschen möglich ist, kann man auch Multischicht-Flaschen nehmen, welche im Gegensatz zu Einzelschicht-Flaschen die Zellkulturen um das 3-5 fache expandieren können.

Das war die Einführung in die Subkultivierung von Zellen von JoVE. In diesem Viedeo haben wir wiederholt was eine Zelllinie ist, wie man diese Subkultiviert, und welche verschiedenen Anwendungen es für die Subkultivierung von Zellen gibt. Danke für eure Aufmerksamkeit und denkt daran eure Zellen mit frischem Medium zu kultivieren!