Subkultivierung von Zellen

Passaging Cells

JoVE Science Education
Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

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JoVE Science Education Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

Passaging Cells

2.1: Using a Hemacytometer to Count Cells

2.3: PCR: The Polymerase Chain Reaction

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10:02 min

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April 30, 2023

Overview

Zelllinien werden häufig in biomedizinischen Experimenten benutzt, da sie eine schnelle Kultur und Expansion von verschiedenen Zellarten für die experimentelle Analyse bereitstellen. Zelllinien werden unter ähnlichen Bedingungen kultiviert wir frisch isolierte, oder primäre Zellen. Es gibt jedoch ein paar wichtige Unterschiede: Zellinien benötigen ihre eigenen spezifischen Wachstumsfaktormischungen und ihr Wachstum muss im Gegensatz zu primären Zellen häufiger kontrolliert werden, da sie Mutationen haben, welche es ihnen ermöglichen schnell und unbegrenzt zu wachsen, was zu Überwucherungen führen kann. Deshalb muss man Zellen, welche die Mehrheit der Oberfläche der Zellkulturschale bedecken, also circa 90% konfluent sind, resuspendieren, waschen, experimentell nutzen, für die spätere Benutzung einfrieren, oder eben in neue Zellkulturbehälter subkultivieren.

Dieses Video zeigt wie man die Indikatoren in dem Nährstoffmedium benutzt, um die Zellgesundheit zu beurteilen, welche Reagenzien und Ausrüstung man braucht um sicher die adhärenten Zellen von der Kultur zu entfernen, und verschiedenen Methoden, um schnell expandierende Zellen in eine neue Kultur zu subkultivieren. Außerdem wird gezeigt wie Fütterzellen, die wichtig für das Bereitstellen von unentbehrlichen Wachstumsfaktoren für Zelllinien sind, kultiviert werden und wie man eine größere Anzahl von Zelllinienkulturen auf einmal produziert.

Procedure

Das Passagieren, oder Subkultivieren, von Zellen ist eine häufig angewendete Methode, bei der Zellen von einer bestimmten Kultur unter Verdünnung in eine neue Kultur überführt werden. Dabei werden neue Nährstoffe durch das frische Medium zugesetzt, um eine weitere Expansion zu ermöglichen. Eigentlich ist das Konzept an sich ziemlich einfach, aber in diesem Video erörtern wir einige wichtige Schritte für die erfolgreiche Erhaltung und Expansion von Zelllinien.

Toxische Stoffwechselprodukte sammeln sich mit der Zeit in dem Zellkulturmedium an. Wenn man die Zellen expandieren möchte, ist es besonders wichtig das Medium regelmäßig zu wechseln, um die Zellgesundheit beizubehalten und um das Zellwachstum im Auge zu behalten, so dass eine Überwucherung der Zellen vermieden wird.

Im Allgemeinen werden zwei verschiedene Arten von Zellen subkultiviert: immortale Zelllinien und Stammzelllinien.

Immortale Zelllinien sind Zellen, die von verschiedenen multizellulären Organismen erzeugt worden sind und eine bestimmte Art von Mutation enthalten, welche den Zellzyklus beeinflusst. Dadurch können sie unbegrenzt wachsen. Die vielleicht bekannteste immortale Zelllinie ist die HeLa Zelllinie, welche von einem Zervixkarzinom stammt, das 1951 bei einer Biopsie von Henrietta Lacks entnommen worden ist.

Anders als die Zelllinien, die durch Krebs immortalisiert sind, werden Stammzelllinien durch das Isolieren von sich selbst erneuernden und multipotenten Zellen aus erwachsenen oder embryonalen Geweben gewonnen. Unter den richtigen Bedingungen können diese Zellen, wie die humanen embryonalen Stammzellen, die man hier sieht, unendlich in Kultur erhalten werden.

Zellen können entweder optimal in Suspension wachsen, wie beispielsweise immortale Zellen, die aus dem Blut isoliert worden sind. Andere Zellen wachsen am besten wenn sie an eine Oberfläche haften, was der Fall für viele aus Geweben isolierte Zellen ist.

Das Wachstum der adhärenten Zellen muss im Auge behalten werden, um die optimale Zellgesundheit zu gewährleisten. Abhängig von der Zellart werden die meisten adhärenten Zellen subkultiviert, wenn sie 70-90% konfluent sind, das heißt wenn 70-90% der Oberfläche der Schale bedeckt ist.

Man sollte sich bewusst sein, dass Zelllinien zwar viele Eigenschaften der ursprünglichen Zellkultur beibehalten, aber das jede neue Subkultivierung auch zu dem Erwerb von neuen Eigenschaften, die einzigartig für die gewachsene Kultur sind, führen kann. Deshalb sollte man erwägen die Anzahl der Subkultivierungen einer einzelnen Zelllinie einzuschränken.

Wenn Zellen subkultiviert werden, ist es wichtig steril zu arbeiten und die angebrachten Reagenzien und Geräte zu benutzen.

Es ist wichtig, dass man das passende Medium für optimales Zellwachstum und die Expansion der Zelllinie benutzt. Jede Zelllinie braucht eine spezielle Wachstumsfaktormischung. Die meisten Zelllinien brauchen mindestens die folgenden Zusätze: Serum, wie zum Beispiel fetales Kälberserum, das Hitzebehandelt werden muss, um das bovine Komplement zu inaktivieren und welches die nötigen Wachstumsfaktoren für die Zellen enthält; das Antibiotikum wie Penizillin und Streptomycin, welches dabei hilft die Kontamination der Zellkultur einzuschränken; und andere Wachstumsfaktoren wie der Fibroblasten-Wachstumsfaktor, um das Wachstum und die Expansion der Zellen zu begünstigen. Das supplementierte, oder “komplette” Medium wird bei 4°C gelagert wenn man es nicht braucht.

Zuerst sollte man auf die Farbe des Zellkulturmediums achten. Frisches Zellkulturmedium, das reich an Nährstoffen ist, erscheint klar und orange, was teilweise mit dem Zusatz des pH-Indikators Phenol-Rot zusammen hängt.

Wenn die Zellen anfangen die Nährstoffe in dem Medium aufzubrauchen, sammeln sich Abfallprodukte und Säure in der Zellkultur an, die zu einer Senkung des pH-Werts führen. Deshalb sind viele Zellkulturmedien mit Phenol-Rot versetzt, welches das Medium orange-gelb erscheinen lässt, wenn die Zellen das Medium in den sauren Bereich umgeschlagen haben. Das Medium sollte gewechselt werden bevor es orange ist!

Wenn das Phenol-Rot in eine pinke Farbe umschlägt, heißt das, das der pH-Wert zu basisch für das Zellwachstum ist, und es höchste Zeit ist den Co2 Tank und das Medium zu wechseln.

Die meisten Zelllinien setzen sich ganz natürlich auf unbeschichtete Plastik ab. Deshalb werden häufig Plastikschalen, wie Petrischalen oder 6-Well-Platten, für das Subkultivieren von Zellen benutzt.

Plastikzellkultur-Flaschen werden auch benutzt. Die T25 Zellkultur-Flasche wird zum Beispiel oft verwendet, um kleine Zelllinienpopulationen zu erweitern oder um das Wachstum einer langsam wachsenden Zelllinie zu starten. T75 Zellkultur-Flaschen werden häufig für Zelllinien benutzt, die sehr schnell wachsen, oder um eine größere Anzahl von Zellen zu produzieren als in eine T25 Zellkultur-Flasche passen.

Wenn die adhärenten Zellen entfernt werden, müssen erst die Proteine, durch welche die Zellen mit der Plastikoberfläche verbunden sind, abgelöst werden. Für diesen Zweck wird das Verdauungsenzym Trypsin benutzt. Es ist wichtig, dass man bei der Trypsinierung auf die Zeit achtet, denn eine zu lange Behandlung kann zu der Schädigung der Zelloberflächenproteine führen.

Das Zellkulturmedium kann Stoffe enthalten, die das Trypsin neutralisieren. Deshalb werden die Zellen mit phosphatgepufferter Salzlösung, oder PBS, vor der Trypsinisierung gewaschen.

EDTA ist ein Kalziumchelat, das manchmal benutzt wird, um die proteolytische Funktion des Trypsins zu unterstützen.

Für die Expansion der Kolonie werden frisch passagierte Zellen in einem Brutschrank unter den angemessenen Bedingungen, die normalerweise 37°C, 5% CO2 und 95% Luftfeuchtigkeit sind, inkubiert .

Nun subkultivieren wir ein paar Zellen!

Bevor man anfängt, ist es wichtig zu verstehen wie oft die Zellen beobachtet werden müssen, was davon abhängt wie schnell die Zellen wachsen.

Nun dass das Medium eine fröhlich orange Farbe hat, sollte man sich die anderen Kulturbedingungen, zum Beispiel ob die Zellkultur trüb ist oder nicht –was möglicherweise eine Kontamination anzeigt – die Größe und Dichte der Zellkolonie und die allgemeine Qualität der Zellen, anschauen.

Wenn die Zellen circa 90% Konfluenz erreicht haben, saugt man das Zellkulturmedium ab und wäscht die Zellen mit PBS ohne Kalzium und Magnesium.

Nun gibt man Trypsin zu der Kultur hinzu und inkubiert sie bei 37°C. Nach circa 5 Minuten bestätigt man, dass die Zellen abgelöst sind und stoppt die Proteolyse durch die Zugabe von neuem Zellkulturmedium.

Nun transferiert man die Zellkultur in ein Gefäß zum Zentrifugieren. Dann, nach der Zentrifugation der Zellen, saugt man den Überstand ab ohne dabei das Pellet zu berühren, und resuspendiert die Zellen in frischem Zellkulturmedium. Nun zählt man die Zellen, die man abgelöst hat und kultiviert sie entsprechend der Dichte, die für die jetzige oder spätere Expansion benötigt wird.

Nun das wir die Zellen subkultiviert haben, schauen wir uns einige verschiedene Anwendungen der Methode an.

Wie schon vorher erwähnt sind humane embryonale Stammzellen eine Zellart, die subkultiviert werden müssen. Sie werden normalerweise mit embryonalen Fibroblasten der Maus, oder MEFs, kultiviert, welche die Faktoren herstellen, die es den Stammzellen ermöglichen ihre Pluripotenz zu erhalten.

Stammzellkolonien, die auf Fütterzellen gewachsen werden, müssen selektiert werden wenn sie ihre richtige Entwicklungsstufe erreicht haben. Sie können mit einer Mikropipette oder mit einem Glas Selektierwerkzeug selektiert, und dann in einer neuen Kultur gewachsen werden.

Einige Zelllinien sind empfindlich gegenüber enzymatischen Verdauen, oder sie binden sich so fest, dass sie nicht nur allein mit Trypsin von der Zellkulturschale abgelöst werden können. Ein Zellschaber kann benutzt werden, um die Zellen sanft von der Zellkulturschale zu entfernen. Wenn die Zellen besonders adhärent sind, kann man versuchen eine serologischen Pipette mit einer festen Schabebewegung über den Boden des Zellbehälters zu führen während man die Zellen abspült. Bei dieser mechanischen Methode sollte man jedoch vorsichtig sein, denn empfindliche Zellen können bei der Ablösung beschädigt werden.

Um schneller und reproduzierbar das Zellkulturvolumen zu erhöhen als in Einzelschicht-Flaschen möglich ist, kann man auch Multischicht-Flaschen nehmen, welche im Gegensatz zu Einzelschicht-Flaschen die Zellkulturen um das 3-5 fache expandieren können.

Das war die Einführung in die Subkultivierung von Zellen von JoVE. In diesem Viedeo haben wir wiederholt was eine Zelllinie ist, wie man diese Subkultiviert, und welche verschiedenen Anwendungen es für die Subkultivierung von Zellen gibt. Danke für eure Aufmerksamkeit und denkt daran eure Zellen mit frischem Medium zu kultivieren!

Transcript

Passaging, or subculturing, of cells, is a common procedure wherein cells from a given culture are divided, or “split”, into new cultures and fed with fresh media to facilitate further expansion. While the concept itself is relatively simple, in this video we will discuss some of the more important steps for the successful maintenance and expansion of cell lines.

Toxic metabolites accumulate in cell culture media over time. When expanding cells, it is particularly important to change the media regularly to maintain cell health and to monitor the cell expansion to avoid cell overgrowth.

Generally, two main types of cells are subcultured: immortalized cell lines and stem cell lines

Immortalized cell lines are cells that are derived from multicellular organisms that have experienced some type of mutation affecting their cell cycle regulation, allowing them to proliferate indefinitely. Perhaps the most famous immortalized cell line is the HeLa cell line, which was derived from a cervical cancer lesion found on a biopsy taken from Ms. Henrietta Lacks in 1951.

In contrast to cell lines immortalized by cancer, stem cell lines are generated by isolating self-renewing and multipotent cells from a variety of tissues both from adult and embryonic tissues. Under the right conditions these cells, like the human embryonic stem cells you see here, can be maintained in culture indefinitely.

Cells are either optimally cultured in suspension, like immortalized cells isolated from blood, or they grow best when adhered to a surface, as is the case for many tissue-derived cells.

The growth of these adherent cells must be closely monitored to ensure cell health. Depending on the cell type, most adherent cells need to be passaged when they are 70-90% confluent, that is, when they cover 70-90% of the culture container surface.

Bear in mind that cell lines retain many characteristics of the original cell culture, but with each successive passage they can also begin to acquire characteristics unique to the expanded culture. Therefore, consider limiting the number of times you continue to passage an individual cell culture.

When passaging cells, it is important to use sterile technique and the appropriate reagents and equipment.

It is essential to use the appropriate media for the optimal growth and expansion of your cell line. Each cell line will require a specific growth supplement cocktail, however, most cell lines at minimum require supplementation with the following: Serum, such as Fetal Bovine Serum, which must be heat-treated to inactivate the bovine complement and which provides vital growth factors for the cells, antibiotics, like penicillin and streptomycin, which help limit contaminating growth in the culture, and other growth factors, like fibroblast growth factor, to help prolong the growth and expansion of the cell lines. Store the supplemented, or “complete”, cell culture media at 4 C when you’re not using it.

First, take note of the color of the tissue culture media. Fresh, cell culture media is rich in nutrients and appears a clear, orange color, partly due to the addition of the pH indicator, phenol red.

As cells begin to use up nutrients in the media, waste and acid begin to build up in the cell culture, lowering the pH. For this reason, many tissue culture medias contain phenol red, which turns the media from orange to yellow when cells turn the culture acidic. Change the media before it turns this color!

When the phenol red turns the media a pinkish color, indicating that the pH has become too basic for healthy cell growth, it may be time to change your CO2 tank as well as your media.

Most adherent cell lines attach naturally to uncoated plastic. Therefore plastic cell culture plates, like petri dishes or 6 well plates, are frequently used for subculturing cells.

Plastic cell culture flasks are also used. The T25 cell culture flask, for example, is often used to expand small cell line populations or to start the growth of a slowly expanding cell line. T75 culture flasks are commonly used for cell lines that proliferate more quickly or to generate larger numbers of cells than can fit in a T25 flask.

When removing adherent cells, the proteins that bind the cells to the plastic must first be cleaved. For this purpose, the digestive enzyme trypsin is frequently used. It is important to carefully time the trypsin exposure, as treatment for too long can result in damage to other cell surface proteins.

Cell culture media can contain trypsin neutralizers. Therefore, phosphate buffered saline, or PBS, is often used to wash the cells before trypsinization.

EDTA, a calcium chelator, is sometimes also used to enhance the proteolytic function of trypsin.

For expansion of the cell colony, the freshly-passaged cells are then grown in a cell culture incubator under the conditions appropriate to that cell line, typically at about 37 C, 5% CO2, and 95% humidity.

Before you begin, it is important to understand how frequently your cells should be monitored, which will depend on how fast your cells proliferate.

Now that your media is a happy orange color, observe the other culture conditions, such as whether or not the culture is cloudy – possibly indicating contamination — the size and density of the cell colonies, and the overall quality of the cells.

If the cells have reached about 90% confluency, remove the tissue culture media and wash the cells with calcium- and magnesium-free PBS.

Now add trypsin to the cells and then incubate them at 37 C. After about 5 minutes, confirm that the cells have detached, and then stop the proteolysis by adding fresh tissue culture media.

Transfer the cell suspension into a conical tube for centrifugation. Then, after spinning down the cells, carefully remove the supernatant without disturbing the pellet and resuspend the cells in fresh media. Count how many cells you’ve collected and then seed the cells according to the density appropriate for immediate or later expansion.

Now that you know how to passage cells, let’s look at some different applications of the method.

As mentioned earlier, human embryonic stem cells are a type of cell that must be passaged. They are typically cocultured with mouse embryonic fibroblasts, or MEFs, which provide factors that help stem cells retain their pluripotent state.

Stem cell colonies grown on feeder cells need to be “picked” once they’ve reached the proper stage of development. They can be selected by micropipette or by gentle scraping with a glass picking tool and then plated in a new culture for expansion.

Some cell lines are sensitive to enzymatic digest or they are so tightly adherent they can’t be resuspended with trypsin treatment alone. A cell scraper can be used to gently remove the cells from the bottom of the culture plate. If the cells are particularly adherent, try moving a serological pipette in a firm scraping motion while rinsing the bottom of the cell container with media or another appropriate solution. Take care with this method, as delicate cells can be damaged by this mechanical method of dissociation.

To more quickly and reproducibly scale up the expansion of your cells than can be achieved in single layer flasks, multilayer flasks, which can expand cell cultures 3-5 fold compared to single layer flasks, can be used.

You’ve just watched JoVE’s introduction to passaging cells. In this video we reviewed what a cell line is, how to subculture one, and some different applications of passaging cells. Thanks for watching and remember to keep your media fresh!

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Passaging Cells Subculturing Cells Cell Culture Cell Lines Media Change Cell Health Cell Expansion Immortalized Cell Lines Stem Cell Lines HeLa Cell Line Cancer Cells Self-renewing Cells Multipotent Cells Embryonic Stem Cells Suspension Culture