2.2: Subkultivierung von Zellen

Das Passieren oder Subkultivieren von Zellen ist ein gängiges Verfahren, bei dem Zellen aus einer bestimmten Kultur in neue Kulturen geteilt oder "gespalten" und mit frischen Medien gefüttert werden, um die weitere Expansion zu erleichtern. Während das Konzept an sich relativ einfach ist, werden wir in diesem Video einige der wichtigsten Schritte für die erfolgreiche Wartung und Erweiterung von Zelllinien besprechen.

Toxische Metaboliten reichern sich im Laufe der Zeit in Zellkulturmedien an. Bei der Expansion von Zellen ist es besonders wichtig, das Medium regelmäßig zu wechseln, um die Zellgesundheit zu erhalten und die Zellexpansion zu überwachen, um ein Überwachsen der Zellen zu vermeiden.

Im Allgemeinen werden zwei Haupttypen von Zellen subkultiviert: immortalisierte Zelllinien und Stammzelllinien

Immortalisierte Zelllinien sind Zellen, die von mehrzelligen Organismen abstammen, die eine Art von Mutation erfahren haben, die ihre Zellzyklusregulation beeinflusst und es ihnen ermöglicht, sich unbegrenzt zu vermehren. Die vielleicht berühmteste immortalisierte Zelllinie ist die HeLa-Zelllinie, die aus einer Gebärmutterhalskrebsläsion gewonnen wurde, die bei einer Biopsie von Frau Henrietta Lacks im Jahr 1951 gefunden wurde.

Im Gegensatz zu Zelllinien, die durch Krebs immortalisiert wurden, werden Stammzelllinien durch die Isolierung von selbsterneuernden und multipotenten Zellen aus einer Vielzahl von Geweben sowohl aus adulten als auch embryonalen Geweben erzeugt. Unter den richtigen Bedingungen können diese Zellen, wie die menschlichen embryonalen Stammzellen, die Sie hier sehen, auf unbestimmte Zeit in Kultur gehalten werden.

Zellen werden entweder optimal in Suspension kultiviert, wie immortalisierte Zellen, die aus Blut isoliert werden, oder sie wachsen am besten, wenn sie an einer Oberfläche haften, wie es bei vielen Gewebezellen der Fall ist.

Das Wachstum dieser adhärenten Zellen muss engmaschig überwacht werden, um die Zellgesundheit zu gewährleisten. Je nach Zelltyp müssen die meisten adhärenten Zellen passaget werden, wenn sie zu 70-90 % konfluent sind, d. h. wenn sie 70-90 % der Oberfläche des Kulturbehälters bedecken.

Denken Sie daran, dass Zelllinien viele Eigenschaften der ursprünglichen Zellkultur beibehalten, aber mit jedem weiteren Durchgang können sie auch beginnen, Eigenschaften zu entwickeln, die für die expandierte Kultur einzigartig sind. Erwägen Sie daher, die Anzahl der Male, die Sie eine einzelne Zellkultur weiterhin durchlaufen, zu begrenzen.

Bei der Passage von Zellen ist es wichtig, eine sterile Technik und die entsprechenden Reagenzien und Geräte zu verwenden.

Für das optimale Wachstum und die Erweiterung Ihrer Zelllinie ist es unerlässlich, die geeigneten Medien zu verwenden. Jede Zelllinie benötigt einen spezifischen Wachstumsergänzungscocktail, die meisten Zelllinien benötigen jedoch mindestens eine Supplementierung mit folgenden Elementen: Serum, wie z. B. fötales Rinderserum, das wärmebehandelt werden muss, um das Rinderkomplement zu inaktivieren, und das lebenswichtige Wachstumsfaktoren für die Zellen liefert, Antibiotika wie Penicillin und Streptomycin, die dazu beitragen, das kontaminierende Wachstum in der Kultur zu begrenzen, und andere Wachstumsfaktoren, wie der Fibroblasten-Wachstumsfaktor, um das Wachstum und die Expansion der Zelllinien zu verlängern. Lagern Sie das ergänzte oder "vollständige" Zellkulturmedium bei 4 °C, wenn Sie es nicht verwenden.

Achten Sie zunächst auf die Farbe des Gewebekulturmediums. Frisches Zellkulturmedium ist reich an Nährstoffen und erscheint in einer klaren, orangefarbenen Farbe, was zum Teil auf die Zugabe des pH-Indikators Phenolrot zurückzuführen ist.

Wenn die Zellen beginnen, die Nährstoffe in den Medien zu verbrauchen, beginnen sich Abfallstoffe und Säure in der Zellkultur anzusammeln, wodurch der pH-Wert gesenkt wird. Aus diesem Grund enthalten viele Gewebekulturmedien Phenolrot, das das Medium von orange auf gelb färbt, wenn die Zellen die Kultur sauer machen. Wechseln Sie das Medium, bevor es diese Farbe annimmt!

Wenn das Phenolrot das Medium rosafarben färbt, was darauf hinweist, dass der pH-Wert für ein gesundes Zellwachstum zu basisch geworden ist, ist es möglicherweise an der Zeit, sowohl Ihren CO2-Tank als auch Ihr Medium zu wechseln.

Die meisten adhärenten Zelllinien heften sich auf natürliche Weise an unbeschichteten Kunststoff. Daher werden Zellkulturplatten aus Kunststoff, wie Petrischalen oder 6-Well-Platten, häufig für die Subkultivierung von Zellen verwendet.

Es werden auch Zellkulturflaschen aus Kunststoff verwendet. Der T25-Zellkulturkolben wird beispielsweise häufig verwendet, um kleine Zelllinienpopulationen zu erweitern oder das Wachstum einer langsam expandierenden Zelllinie zu starten. T75-Kulturflaschen werden häufig für Zelllinien verwendet, die sich schneller vermehren, oder um eine größere Anzahl von Zellen zu erzeugen, als in einen T25-Kolben passen.

Bei der Entnahme von anhaftenden Zellen müssen zunächst die Proteine gespalten werden, die die Zellen an den Kunststoff binden. Zu diesem Zweck wird häufig das Verdauungsenzym Trypsin eingesetzt. Es ist wichtig, die Trypsin-Exposition sorgfältig zu planen, da eine zu lange Behandlung zu einer Schädigung anderer Zelloberflächenproteine führen kann.

Zellkulturmedien können Trypsin-Neutralisatoren enthalten. Daher wird phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) häufig verwendet, um die Zellen vor der Trypsinisierung zu waschen.

EDTA, ein Calciumchelator, wird manchmal auch verwendet, um die proteolytische Funktion von Trypsin zu verbessern.

Zur Erweiterung der Zellkolonie werden die frisch durchgeflossenen Zellen dann in einem Zellkultur-Inkubator unter den für diese Zelllinie geeigneten Bedingungen gezüchtet, typischerweise bei etwa 37 °C, 5 % CO2 und 95 % Luftfeuchtigkeit.

Bevor Sie beginnen, ist es wichtig zu verstehen, wie häufig Ihre Zellen überwacht werden sollten, was davon abhängt, wie schnell sich Ihre Zellen vermehren.

Jetzt, da Ihre Medien eine fröhliche orange Farbe haben, beobachten Sie die anderen kulturellen Bedingungen, z. B. ob die Kultur bewölkt ist oder nicht. Möglicherweise deutet dies auf eine Kontamination hin - die Größe und Dichte der Zellkolonien und die Gesamtqualität der Zellen.

Wenn die Zellen eine Konfluenz von etwa 90 % erreicht haben, entfernen Sie die Gewebekulturmedien und waschen Sie die Zellen mit kalzium- und magnesiumfreiem PBS.

Geben Sie nun Trypsin zu den Zellen und inkubieren Sie sie dann bei 37 °C. Bestätigen Sie nach ca. 5 Minuten, dass sich die Zellen abgelöst haben, und stoppen Sie dann die Proteolyse, indem Sie frische Gewebekulturmedien hinzufügen.

Übertragen Sie die Zellsuspension zur Zentrifugation in ein konisches Röhrchen. Entfernen Sie dann nach dem Schleudern der Zellen vorsichtig den Überstand, ohne das Pellet zu stören, und resuspendieren Sie die Zellen in frischem Medium. Zählen Sie, wie viele Zellen Sie gesammelt haben, und säen Sie die Zellen dann entsprechend der Dichte aus, die für eine sofortige oder spätere Expansion geeignet ist.

Nachdem Sie nun wissen, wie man Zellen durchläuft, schauen wir uns einige verschiedene Anwendungen der Methode an.

Wie bereits erwähnt, sind menschliche embryonale Stammzellen eine Art von Zelle, die durchgelassen werden muss. Sie werden in der Regel mit embryonalen Fibroblasten (MEFs) der Maus kokultiviert, die Faktoren liefern, die den Stammzellen helfen, ihren pluripotenten Zustand zu behalten.

Stammzellkolonien, die auf Feeder-Zellen gezüchtet werden, müssen "gepflückt" werden. sobald sie das richtige Entwicklungsstadium erreicht haben. Sie können durch Mikropipette oder durch sanftes Schaben mit einem Glaspickwerkzeug ausgewählt und dann zur Expansion in einer neuen Kultur plattiert werden.

Einige Zelllinien reagieren empfindlich auf enzymatische Verdauung oder sind so fest anhaftend, dass sie mit einer Trypsin-Behandlung allein nicht resuspendiert werden können. Mit einem Zellschaber können die Zellen vorsichtig vom Boden der Kulturplatte entnommen werden. Wenn die Zellen besonders adhärent sind, versuchen Sie, eine serologische Pipette in einer festen Schabebewegung zu bewegen, während Sie den Boden des Zellbehälters mit Medium oder einer anderen geeigneten Lösung spülen. Seien Sie vorsichtig mit dieser Methode, da empfindliche Zellen durch diese mechanische Dissoziationsmethode geschädigt werden können.

Um die Expansion Ihrer Zellen schneller und reproduzierbarer zu skalieren, als dies mit Einschichtkolben erreicht werden kann, können Mehrschichtkolben verwendet werden, die Zellkulturen im Vergleich zu Einschichtkolben um das 3-5-fache erweitern können.

Sie haben gerade die Einführung von JoVE in die passagierenden Zellen gesehen. In diesem Video haben wir uns angesehen, was eine Zelllinie ist, wie man sie subkultiviert und einige verschiedene Anwendungen von passagierenden Zellen. Vielen Dank fürs Zuschauen und denken Sie daran, Ihre Medien frisch zu halten!