Die Beurteilung der Replikation und Beta-Zellfunktion in adenoviral-transduzierten Isoliert Nager Islets

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Signalwege zu identifizieren, die Veränderungen der funktionellen Betazellmasse regulieren. Dies wird in isolierten Rattenösen erreicht, indem die Expression eines Gens mit adenoviralen Vektoren überexprimiert oder unterdrückt wird. Nach dieser Manipulation wird die Betazellfunktion durch Insulinsekretion und Eyelet-Replikation beurteilt, gemessen durch tritiierten Thymidineinbau.

Letztendlich können diese Assays zeigen, ob ein Gen von Interesse die Betazellproliferation reguliert und/oder in vitro funktioniert. Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Bereich der Augenlidbiologie zu beantworten, wie z.B. ob eine bestimmte Komponente eines Signalwegs das Wachstum und die Funktion von Betazellen beeinflusst? Bereiten Sie eine Platte mit sechs Vertiefungen vor, die nicht mit Gewebekulturen beschichtet ist, indem Sie zwei Milliliter modifiziertes Medium zur erforderlichen Anzahl von Vertiefungen hinzufügen.

Zum Beispiel kann ein typisches Experiment drei Vertiefungen erfordern, jeweils eine für eine virusfreie Kontrolle, eine Viruskontrolle, und die Versuchsgruppe erwärmt die Platte in einem Gewebekultur-Inkubator für mindestens 30 Minuten auf 37 Grad Celsius. Unmittelbar nach der Isolierung der Rattenöse eine bis 200 Ösen in jede Vertiefung der vorbereiteten Platte setzen. 60 Ösen werden für biochemische Assays verwendet, und die restlichen Ösen können für Genexpressionsstudien oder Immunblotting verwendet werden: Schwellen Sie die Platte sanft an, um die Ösen in die Mitte jeder Platte zu bringen.

Nun, dann pipettieren Sie das Adenovirus sofort direkt auf die Ösen. In der Mitte der Schüssel. Verwenden Sie eine bis 500 Multiplizitäten von Infektionen, abhängig von der Wirksamkeit des Adenovirus bei der Überexpression oder Niederschlagung Ihres interessierenden Proteins.

Eine effiziente adenovirale Penetration in den Kern des Augenlids erhöht die Konsistenz der Ergebnisse. Transduzieren der Augenlider unmittelbar nach dem Augenlid. Isolation ist unerlässlich.

Stören Sie die Platte fünf Minuten lang nicht und stellen Sie sie dann für 24 Stunden in den Inkubator. Nehmen Sie am nächsten Tag die Platte aus dem Inkubator und quellen Sie die Ösen vorsichtig bis zur Mitte der Vertiefungen auf. Übertragen Sie die Ösen mit einer 200-Mikroliter-Mikropipette in eine neue Vertiefung mit frischem Medium.

Bleiben die Ösen an der Platte hängen, können sie mit der Pipettenspitze vorsichtig gelöst werden. Es ist hilfreich, ein Kontrollvirus zu verwenden, das GFP exprimiert, um eine angemessene Transduktionseffizienz zu überprüfen, indem mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie die Penetration des Adenovirus in die Inselkernkultur sichtbar gemacht wird. Die Inselchen noch ein bis drei Tage, täglich wechselnd die Medien.

Der Zeitpunkt der Kultur muss durch Pilotstudien optimiert werden und variiert je nach experimentellen Zielen. In den letzten 24 Stunden wird tritiiertes Thymidin in einer Konzentration von einem Mikrocurie pro Millimeter Medium in das Medium eingearbeitet. Zuerst 50 Milliliter des Arbeits-SAB in einer 50 Milliliter konischen Tube frisch zubereiten und in einem 37 Grad Celsius warmen Wasserbad erwärmen.

Pipettieren Sie 10 Milliliter einarbeitendes SAB in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen und fügen Sie 66,8 Mikroliter 2,5 molare D-Glukose hinzu. Um den SAB mit hohem Glukosegehalt herzustellen, fügen Sie 44,8 Mikroliter 2,5 Monolo D-Glukose zu den restlichen 40 Millilitern des Arbeits-SAB hinzu. Zur Herstellung des SAB mit niedrigem Glukosegehalt markieren Sie als nächstes drei 1,7-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen.

Geben Sie für jede Vertiefung der Sechs-Well-Platte einen Milliliter PBS in jedes Röhrchen. Vergessen Sie nicht, die institutionellen Protokolle für den Umgang und die Entsorgung der radioaktiven Ösen zu befolgen. Mit einem Stereoskop oder Standardmikroskop werden 20 vergleichbar große Ösen ausgewählt und in jedes Mikrozentrifugenröhrchen übertragen.

Zum Beispiel kann jede Tube fünf kleine, 10 mittlere und fünf große Ösen enthalten. Obwohl die Ergebnisse am Ende des Experiments auf den Gesamtproteingehalt normalisiert werden, ist es wichtig, dass die Ösen zwischen den Gruppen mit der Größe übereinstimmen. Nachdem Sie die Ösen durch Schwerkraft oder durch Zentrifugation auf dem Boden des Röhrchens abgesetzt haben, aspirieren, wiegen Sie das PBS mit einer Mikropipette und fahren Sie dann mit der Vorbereitung der Ösen für die biochemischen Assays fort.

Um die Ösen für den Insulinsekretionstest vorzubereiten, müssen sie zunächst mit niedrigem Glukose-SAB vorinkubiert werden. Geben Sie dazu 400 Mikroliter des niedrigen Glukose-SAB in die Röhrchen und legen Sie sie mit Kappen in den Gewebekultur-Inkubator. Aspirieren Sie nach einer Stunde 60 Minuten lang den niedrigen Glukose-SAB vor der Inkubation, um die Basalinsulinsekretion zu messen. Wiederholen Sie den Vorgang vor der Inkubation.

Um jedoch die stimulierte Insulinsekretion zu messen, verwenden Sie 400 Mikroliter SAB mit hohem Glukosegehalt anstelle von SAB mit niedrigem Glukosegehalt und inkubieren Sie die Ösen wie zuvor 60 Minuten lang nach der Inkubation entweder in SAB-Aspirat mit hohem oder niedrigem Glukosegehalt und dem SAB für den Insulin-Radioimmunoassay, der gemäß dem Protokoll des Herstellers durchgeführt wird. Fahren Sie dann mit dem Thymidin-Inkorporationsassay fort, indem Sie die gleiche Sammlung von Ösen verwenden. Beginnen Sie mit den Ösen, die gerade für den Insulinsekretionstest verwendet wurden.

Fügen Sie einen Milliliter PBS hinzu und lassen Sie die Ösen durch die Schwerkraft absetzen. Aspirieren Sie dann das PBS mit einer Mikropipette. Verwerfen Sie diesen Schritt und wiederholen Sie ihn erneut.

Als nächstes gibst du 500 Mikroliter eiskalte Trichloressigsäure auf die Ösen und inkubierst sie 30 Minuten lang auf Eis. Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei vier Grad Celsius. Dann Aspiration, verwerfen Sie das TCA.

Als nächstes fügen Sie 80 Mikroliter 0,3 normales Natriumhydroxid hinzu und inkubieren Sie die Ösen 30 Minuten lang bei Raumtemperatur. Während dieser Inkubation werden die Proben alle 10 Minuten fünf bis 10 Sekunden lang kräftig vortext. Geben Sie parallel dazu vier Milliliter eines Conno-Safe-Zählcocktails in sieben Milliliter Flüssigszintillationszählröhrchen.

Wenn die Inkubation der Ösen beendet ist, geben Sie 50 Mikroliter der Ösen in ein Szintillationsröhrchen. Schütteln Sie das verschlossene Röhrchen kurz und messen Sie die Radioaktivität der Proben in einem Flüssigszintillationszähler. Um die Proteinkonzentration zu messen, übertragen Sie 10 Mikroliter Vilas in einen kommerziellen Bionsäure-Assay und befolgen Sie das Protokoll des Herstellers.

Normalisieren Sie die Ergebnisse später während der Datenanalyse mit den beschriebenen Protokollen auf die Proteinkonzentration. Ösenreplikation und Betazellfunktion. In Rattenösen wurde untersucht, dass eine adenovirale Überexpression des hypothetischen Gens sechs die Replikation der Ösen robust stimulierte, ohne die Betazellfunktion zu verändern.

Erhöhte Expression des sechsten Gens, erhöhte DNA-Synthese, gemessen am Einbau von Thymidin, da die meisten Zellen in der Rattenöse Betazellen sind. Weitere Experimente konnten zeigen, dass diese Zunahme des Thymidineinbaus auf eine Zunahme der Betazellreplikation zurückzuführen ist. Der Insulinsekretionsassay zeigte, dass die Überexpression des sechsten Gens eine der primären Betazellfunktionen, die Insulinsekretion bei niedrigem und hohem Glukosespiegel, nicht veränderte.

Der Anstieg der Insulinsekretion bei niedrigen und hohen Glukosekonzentrationen spiegelt die Gesundheit der Ösen nach der Behandlung mit Adenoviren wider. Wenn eine Erhöhung der Expression des sechsten Gens die Betazellfunktion beeinträchtigt, würde sich dies wahrscheinlich in einer Abnahme des Insulins widerspiegeln, das bei hohen stimulierenden Glukosekonzentrationen ausgeschüttet wird. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Betazellreplikation und die Insulinsekretion messen können, um festzustellen, ob ein bestimmtes Gen das Wachstum oder die Funktion von Betazellen beeinflusst.