Name: Die Beurteilung der Replikation und Beta-Zellfunktion in adenoviral-transduzierten Isoliert Nager Islets (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 31 s
Description: Lernen Sie die Bewertung von Replikation und Beta-Zellfunktion in isolierten Nager-Inseln mittels adenoviralen Vektoren. Diese Methode identifiziert Signalwege zur Regulation der funktionellen Beta-Zellmasse.

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Diese Arbeit wurde von DK078732 Zuschuss von der NIH (bis PTF) unterstützt.

1. Adenovirale Transduktion und Kultivierung von Ratteninseln <ol><li> Vorbereiten einer 6-Well-Gewebekultur nicht beschichteten Platte durch Zugabe von 2 ml Medium (RPMI 1640 Medium mit 8 mM Glukose, 10% fötales Rinderserum, 50 Einheiten / ml Penicillin und 50 ug / ml Streptomycin), um die erforderliche Anzahl von Brunnen. Zum Beispiel kann ein typisches Experiment erfordert drei Vertiefungen - jeweils für einen nicht-Viruskontrolle, ein Virus (zB, GFP-exprimierende Adenovirus), und die experimentelle Gruppe. </li><li> Erwärmen Sie die Platte auf 37 ° C, indem Sie ihn in eine Gewebekultur-Inkubator für mindestens 30 min. </li><li> Unmittelbar nach Ratte Inselisolierung 18,19, Platz 100-200 Inselchen in einzelnen Wells der 6-well Non-Gewebekultur beschichteten Platte. Sechzig Inseln sind für die Insulinsekretion und Thymidineinbau Assays erforderlich. Die übrigen Inseln können zur RNA-Isolierung für Untersuchungen der Genexpression oder Proteinisolierung zum Immunoblotting verwendet werden. </li></ol> [Hinweis: Von diesem Punkt an, folgen Sie bitte institutionellen Protokolle für die Behandlung, Verwendung und Entsorgung biologischer Gefahrenstoffe.] <ol start="4"><li> Die Platte vorsichtig schwenken, um die kleinen Inseln in die Mitte des Brunnens zu bringen. </li><li> Pipettieren Sie die Adenovirus direkt auf den kleinen Inseln in der Mitte des Tellers. Verwenden 100-500 Multiplizitäten der Infektion (MOI, das Verhältnis von Zielzellen, um virale Plaque-bildenden Einheiten). </li><li> Lassen Sie die kleinen Inseln Rest für 5 min. </li><li> Die Platte wird in der Gewebekultur-Inkubator (37 ° C, 5% CO 2). </li><li> Nach 24 h wurde die Platte vorsichtig schwenken, um die Inseln zu den Zentren der Brunnen bringen und übertragen Sie die kleinen Inseln mit einer Mikropipette P200 zu einem neuen Brunnen mit frischem Medien. Wenn die Inseln an der Platte werden, können sie leicht mit der Pipettenspitze abgelöst werden. </li></ol> [Hinweis: Um eine ausreichende Transduktion Effizienz überprüfency, die Verwendung eines Kontrollvirus GFP exprimieren vorteilhaft ist, als Inseln kann dann über der konfokalen Mikroskopie, um das Eindringen des Adenovirus in der Insel Kern zu überprüfen abgebildet werden.] <ol start="9"><li> Kultur die Inseln für eine zusätzliche 24-72 h, je nach dem gewünschten Timing des Experiments von der Optimierung Pilotstudien. Zum Beispiel kann Induktion einer proliferativen Antwort erfordern Zeiten im Bereich von 24-72 h oder Herunterregulierung von dem Gen von Interesse kann 48 oder 72 Stunden benötigen. Übertragen Sie die Inseln an die frische Medien jeden Tag. </li><li> Für die letzten 24 h des Experiments, Kultur der Inseln in einem Medium, 1 Ci [Methyl-3 H] -thymidine/ml Medien (in der Regel 1 ul Thymidin / ml Medium). </li></ol> [Hinweis: Von diesem Punkt an, folgen Sie bitte institutionellen Protokolle für die Behandlung, Verwendung und Entsorgung von radioaktivem Material.] 2. Insulin-Sekretion-Assay <ol><li> Bereiten Sie dieSekretion-Assay-Puffer (SAB) 10X-Stammlösung (1,14 M NaCl, 47 mM KCl, 12 mM KH 2 PO 4, 11,6 mM MgSO 4) und CaCl 2 100x Stocklösung (0,25 M CaCl 2). Diese Stammlösungen können im Voraus geplant werden und bei Raumtemperatur gelagert. </li><li> Frisch zubereiten 50 ml des Arbeits-SAB (5 ml 10X SAB, 1 ml 1 M HEPES, 0,5 ml 100X CaCl 2, 0,28 ml 35% BSA, 0,11 g NaHCO 3 und sterilem Wasser auf 50 ml) in einem 50-ml konischen Röhrchen und warm bis 37 ° C, indem man in einem 37 ° C im Wasserbad. </li><li> 10 ml der Arbeits-SAB in einem 15-ml-Erlenmeyerkolben eingewogen und mit 66,8 ul 2,5 M D-Glucose, um die hohe Glucose (16,7 mM) SAB vorzubereiten. </li><li> In 44,8 ul 2,5 M D-Glucose, um die restlichen 40 ml der Arbeitslösung SAB, um die niedrige Glukose (2,8 mm) SAB vorzubereiten. </li><li> Beschriften Sie drei 1,7-ml-Röhrchen für jede Vertiefung der Platte mit 6 Vertiefungen und 1 ml Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS). </li></ol&gt; [Hinweis: Da die Inseln radioaktiv sind, folgen Sie bitte institutionellen Protokolle für die Behandlung, Verwendung und Entsorgung von radioaktivem Material.] <ol start="6"><li> Platz 20 Inselchen in jedes Mikrozentrifugenröhrchen. Machen jeden Versuch, vergleichbar große Inselchen, um jeden Mikrozentrifugenröhrchen hinzuzufügen. Zum Beispiel kann jedes Rohr enthalten 5 kleine, 10 mittlere und 5 großformatige Inseln (siehe Abbildung 1). </li></ol> [Anmerkung: Islets visualisiert werden kann entweder mit einem Stereoskop sezieren oder einen Standard-Mikroskop.] <ol start="7"><li> Nachdem die Inseln auf der Unterseite des Rohres durch die Schwerkraft (~ 2 min) gelöst ist, absaugen PBS mit einer Mikropipette und zu verwerfen. </li></ol> [Anmerkung: Als Alternative zur Abwicklung durch die Schwerkraft, die Rohre können bei 300 xg für 1 min zentrifugiert werden.] <ol start="8"><li> Für Vorinkubation, fügen Sie 400 ul des niedrigen glucose SAB, stellen Sie die Rohre (mit ihren Mützen offen) in die Gewebekultur-Inkubator (37 ° C, 5% CO 2) und Pre-Inkubation für 60 min. Saugen Sie die Vorinkubation niedrige Glukose SAB und entsorgen. </li><li> Für basale Insulinsekretion, fügen Sie 400 ul des niedrigen Glukose SAB, stellen Sie die Rohre (mit ihren Mützen offen) in die Gewebekultur-Inkubator (37 ° C, 5% CO 2) und Inkubation für 60 min. Sammeln Sie die niedrige Glukose SAB und sparen für die Insulin-Radioimmunoassay. </li><li> Für stimulierte Insulinsekretion, fügen Sie 400 ul der hohen Glukose-SAB, stellen Sie die Rohre (mit ihren Mützen offen) in die Gewebekultur-Inkubator (37 ° C, 5% CO 2) und Inkubation für 60 min. Sammeln Sie die hohe Glukose SAB und sparen für die Insulin-Radioimmunoassay. </li></ol> 3. Thymidineinbau Assay <ol><li> 1 ml PBS; nachdem die Inseln auf dem Boden des Rohres durch die Schwerkraft niedergelassen haben, saugen Sie den PBS mit einer Mikropipette, zu verwerfen, und wiederholen Sie dieseSchritt einmal. </li><li> Fügen Sie 500 ul eiskalter Trichloressigsäure (TCA, 10% w / v) und Inkubation auf Eis für 30 min. </li><li> Zentrifugieren bei 16 000 × g für 3 min bei 4 ° C </li><li> Saugen Sie das TCA, fügen Sie 80 ul 0,3 N NaOH, und inkubieren Sie für 30 Minuten bei Raumtemperatur. Während dieser Zeit kräftig Wirbel die Proben für 5-10 Sekunden alle 10 min. </li><li> 4 ml Econo-sichere Zählen Cocktail bis 7 ml Flüssigkeitsszintillationszählung Röhren. </li><li> Dann werden 50 ul der Probe auf die Szintillationszählung Rohr, Röhrchen verschließen, kurz schütteln, und zählen in einem Flüssigkeits-Szintillationszähler. </li><li> Messung der Proteinkonzentration unter Verwendung des Bicinchoninsäure (BCA)-Probe und 10 ul Probe gemäß dem Protokoll des Herstellers. </li></ol> 4. Datenanalyse <ol><li> Führen Sie die Insulin-Radioimmunoassay nach dem Protokoll des Herstellers. </li><li> Normalisieren der Insulinsekretion und Thymidineinbau Daten mit dem Protein Konzentration. </li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse Ein Beispiel für das Experiment zu Insel Replikation und Beta-Zell-Funktion in Ratteninseln Beurteilung wird in 2 gezeigt. Dieses Beispiel zeigt, dass die adenovirale Überexpression von hypothetischen &quot;Gene # 6&quot; robust stimuliert Inselchen Replikation ohne dass Beta-Zellfunktion. In der oberen Platte, zeigen die Ergebnisse aus der Thymidin-Einbau-Assay dass eine Erhöhung der Expression von &quot;Gene # 6&quot; erhöht DNA-Synthese, wie durch den Einbau von Thymidin gemessen. Da die meisten der Zellen in der Ratte Beta-Inselzellen sind, ist es wahrscheinlich, dass dieser Anstieg der Thymidin-Einbau eine Erhöhung in der Beta-Zell-Replikation zeigt. Allerdings müssen bestätigende Experimente durchgeführt, um fest zu etablieren dies werden. In der Bodenplatte, zeigen die Ergebnisse aus der Insulinsekretion Assay dass die Überexpression von &quot;Gene Nr. 6&quot; ergab keine Änderung eines der primären Beta-Zell-Funktionen, dh insulin Sekretion bei niedrigen und hohen Glucose. Die Qualität der Inselisolierung und die Gesundheit der Inseln nach der Behandlung mit Adenoviren erhält fachen Anstieg der Insulinsekretion bei niedrigen und hohen Glucosekonzentrationen angegeben. Bei Erhöhung der Expression von &quot;Gene # 6&quot; gestörte beta-Zell-Funktion, würde dies wahrscheinlich als eine Abnahme in der Insulin bei hohen, stimulatorische Glucosekonzentrationen (16,7 mM) sezerniert reflektiert werden. Eine Dosis-Wirkungs-Kurve für verschiedene Glucosekonzentrationen könnte auch durchgeführt werden. <img src="/files/ftp_upload/4080/4080fig1.jpg" alt="1"/> 1. Überblick Protokoll Insel Replikation und Beta-Zell-Funktion in isolierten Ratteninseln nach adenoviralen-vermittelten Änderungen in der Genexpression. Frisch isolierte Ratteninseln sind Adenoviren für 24 h ausgesetzt und dann bis zu 96 h kultiviert. Thymidin-Einbau in der letzten 24 h beurteilt, gefolgt von der Messung der Insulinsekretion beiniedrige und hohe Glukose. <img src="/files/ftp_upload/4080/4080fig2.jpg" alt="2"/> 2. Ergebnisse aus einem Experiment unter Verwendung eines Kontroll-Adenovirus und ein Adenovirus-Überexpression eines hypothetischen Gens als &quot;Gene # 6&quot; bezeichnet. Das obere Feld zeigt das Thymidin-Einbau und die Bodenplatte der Insulinsekretion.

<ol><li>Ferrannini, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((beta-Cell+function+in+subjects+spanning+the+range+from+normal+glucose+tolerance+to+overt+diabetes%3A+a+new+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Endocrinol.+Metab%22%5BJournal%5D)">beta-Cell function in subjects spanning the range from normal glucose tolerance to overt diabetes: a new analysis.</a> J. Clin. Endocrinol. Metab. 90, 493-500 (2005).</li>
<li>Weyer, C., Bogardus, C., Mott, D. M., Pratley, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+natural+history+of+insulin+secretory+dysfunction+and+insulin+resistance+in+the+pathogenesis+of+type+2+diabetes+mellitus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">The natural history of insulin secretory dysfunction and insulin resistance in the pathogenesis of type 2 diabetes mellitus.</a> J. Clin. Invest. 104, 787-794 (1999).</li>
<li>Keenan, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Residual+insulin+production+and+pancreatic+ss-cell+turnover+after+50+years+of+diabetes%3A+Joslin+Medalist+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Residual insulin production and pancreatic ss-cell turnover after 50 years of diabetes: Joslin Medalist Study.</a> Diabetes. 59, 2846-2853 (2010).</li>
<li>Bain, J. R., Schisler, J. C., Takeuchi, K., Newgard, C. B., Becker, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+adenovirus+vector+for+efficient+RNA+interference-mediated+suppression+of+target+genes+in+insulinoma+cells+and+pancreatic+islets+of+langerhans%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">An adenovirus vector for efficient RNA interference-mediated suppression of target genes in insulinoma cells and pancreatic islets of langerhans.</a> Diabetes. 53, 2190-2194 (2004).</li>
<li>Fueger, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trefoil+factor+3+stimulates+human+and+rodent+pancreatic+islet+beta-cell+replication+with+retention+of+function%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Trefoil factor 3 stimulates human and rodent pancreatic islet beta-cell replication with retention of function.</a> Mol. Endocrinol. 22, 1251-1259 (2008).</li>
<li>Schisler, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulation+of+human+and+rat+islet+beta-cell+proliferation+with+retention+of+function+by+the+homeodomain+transcription+factor+Nkx6.1%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Stimulation of human and rat islet beta-cell proliferation with retention of function by the homeodomain transcription factor Nkx6.1.</a> Mol. Cell Biol. 28, 3465-3476 (2008).</li>
<li>Chan, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+uncoupling+protein+2+inhibits+glucose-stimulated+insulin+secretion+from+rat+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Overexpression of uncoupling protein 2 inhibits glucose-stimulated insulin secretion from rat islets.</a> Diabetes. 48, 1482-1486 (1999).</li>
<li>Cozar-Castellano, I., Takane, K. K., Bottino, R., Balamurugan, A. N., Stewart, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+beta-cell+proliferation+and+retinoblastoma+protein+phosphorylation+in+rat+and+human+islets+using+adenovirus-mediated+transfer+of+cyclin-dependent+kinase-4+and+cyclin+D1%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Induction of beta-cell proliferation and retinoblastoma protein phosphorylation in rat and human islets using adenovirus-mediated transfer of cyclin-dependent kinase-4 and cyclin D1.</a> Diabetes. 53, 149-159 (2004).</li>
<li>Icyuz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus+infection+activates+akt1+and+induces+cell+proliferation+in+pancreatic+islets1%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Adenovirus infection activates akt1 and induces cell proliferation in pancreatic islets1.</a> Transplantation. 87, 821-824 (2009).</li>
<li>Kaneto, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+the+hexosamine+pathway+leads+to+deterioration+of+pancreatic+beta-cell+function+through+the+induction+of+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Activation of the hexosamine pathway leads to deterioration of pancreatic beta-cell function through the induction of oxidative stress.</a> J. Biol. Chem. 276, 31099-31104 (2001).</li>
<li>Antinozzi, P. A., Berman, H. K., O'Doherty, R. M., Newgard, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+engineering+with+recombinant+adenoviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Nutr%22%5BJournal%5D)">Metabolic engineering with recombinant adenoviruses.</a> Annu. Rev. Nutr. 19, 511-544 (1999).</li>
<li>Newgard, C. B., Becker, T. C., Berman, H. K., O'Doherty, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+overexpressed+hexokinases+in+liver+and+islet+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Soc.+Trans%22%5BJournal%5D)">Regulation of overexpressed hexokinases in liver and islet cells.</a> Biochem. Soc. Trans. 25, 118-122 (1997).</li>
<li>Becker, T. C., BeltrandelRio, H., Noel, R. J., Johnson, J. H., Newgard, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+hexokinase+I+in+isolated+islets+of+Langerhans+via+recombinant+adenovirus.+Enhancement+of+glucose+metabolism+and+insulin+secretion+at+basal+but+not+stimulatory+glucose+levels%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Overexpression of hexokinase I in isolated islets of Langerhans via recombinant adenovirus. Enhancement of glucose metabolism and insulin secretion at basal but not stimulatory glucose levels.</a> J. Biol. Chem. 269, 21234-21238 (1994).</li>
<li>Csete, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenoviral-mediated+gene+transfer+to+pancreatic+islets+does+not+alter+islet+function%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant+Proc%22%5BJournal%5D)">Adenoviral-mediated gene transfer to pancreatic islets does not alter islet function.</a> Transplant Proc. 26, 756-757 (1994).</li>
<li>Csete, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+transfer+to+pancreatic+islets+mediated+by+adenoviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Efficient gene transfer to pancreatic islets mediated by adenoviral vectors.</a> Transplantation. 59, 263-268 (1995).</li>
<li>Meng, Z. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+liver+X+receptors+inhibits+pancreatic+islet+beta+cell+proliferation+through+cell+cycle+arrest%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Activation of liver X receptors inhibits pancreatic islet beta cell proliferation through cell cycle arrest.</a> Diabetologia. 52, 125-135 (2009).</li>
<li>Ronnebaum, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pyruvate+cycling+pathway+involving+cytosolic+NADP-dependent+isocitrate+dehydrogenase+regulates+glucose-stimulated+insulin+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">A pyruvate cycling pathway involving cytosolic NADP-dependent isocitrate dehydrogenase regulates glucose-stimulated insulin secretion.</a> J. Biol. Chem. , (2006).</li>
<li>Milburn, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+beta-cells+in+obesity.+Evidence+for+induction+of+functional%2C+morphologic%2C+and+metabolic+abnormalities+by+increased+long+chain+fatty+acids%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Pancreatic beta-cells in obesity. Evidence for induction of functional, morphologic, and metabolic abnormalities by increased long chain fatty acids.</a> J. Biol. Chem. 270, 1295-1299 (1995).</li>
<li>Szot, G., Koudria, P., Bluestone, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+Pancreatic+Islet+Isolation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Murine Pancreatic Islet Isolation.</a> J. Vis. Exp. (7), e255(2007).</li>
</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Einrichtung Wege, die moduliert werden, um die Replikation stimulieren und die Funktion der Beta-Zellen können relevant sind beiden Hauptformen von Diabetes. Da funktionale Betazellmasse ist abhängig von der Existenz und Funktion von Insulin-sezernierenden Zellen, die Beurteilung dieser Determinanten gleichzeitig hat seine Vorteile. Dieses Protokoll beschreibt eine optimierte Protokoll zum Identifizieren, ob die Überexpression oder Unterdrückung eines Proteins an Veränderungen in der funktionellen Betazellmasse in v...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> RPMI 1640 Medien </td><td> Gibco </td><td> 11879 </td><td></td></tr><tr><td> Penicillin / Streptomycin </td><td> Gibco </td><td> 15140 </td><td></td></tr><tr><td> 6-Well-Platte </td><td> BD-Falcon </td><td> 35-1146 </td><td> Non-TC behandelt </td></tr><tr><td> [Methyl-3 H]-Thymidin </td><td> Perkin Elmer </td><td> NET027Z001MC </td><td> 1 mCi / ml </td></tr><tr><td> Mikro-Zentrifugenröhrchen </td><td> Denville </td><td> C2170 </td><td> 1,7 ml </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Sigma </td><td> 59888 </td><td></td></tr><tr><td> KCl </td><td> Acros </td><td> 42409 </td><td></td></tr><tr><td> KH 2 &lt;/ Sub&gt; PO 4 </td><td> Acros </td><td> 20592 </td><td></td></tr><tr><td> MgSO 4 </td><td> Acros </td><td> 41348 </td><td></td></tr><tr><td> CaCl 2 </td><td> Acros </td><td> 34961 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Sigma </td><td> H0887 </td><td> 1 M Lösung </td></tr><tr><td> 35% BSA </td><td> Sigma </td><td> A7979 </td><td></td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> Acros </td><td> 42427 </td><td></td></tr><tr><td> d-Glucose </td><td> Sigma </td><td> G8769 </td><td></td></tr><tr><td> TCA </td><td> Fisher Scientific </td><td> SA9410-1 </td><td> 10% w / v </td></tr><tr><td> NaOH </td><td> Acros </td><td> 12426 </td><td></td></tr><tr><td> Szintillationszählung Rohr </td><td> Sarstedt </td><td> 58,536 </td><td> 7 ml, PP </td&gt; </tr><tr><td> Szintillationszählung Tubenkappe </td><td> Sarstedt </td><td> 65,816 </td><td></td></tr><tr><td> Econo-Safe Zählen Cocktail </td><td> RPI </td><td> 111175 </td><td></td></tr><tr><td> Insulin-RIA </td><td> Siemens </td><td> TKIN2 </td><td></td></tr><tr><td> BCA Assay Kit </td><td> Thermo Scientific </td><td> 23250 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Ausrüstung </td></tr><tr><td> Zentrifugieren </td><td> Eppendorf </td><td> 5415R </td><td></td></tr><tr><td> Szintillationszählung Röhrchenständer </td><td> Sarstedt </td><td> 93.1431.001 </td><td></td></tr><tr><td> Flüssigkeits-Szintillationszähler </td><td> Perkin Elmer </td><td> Tri-Carb 2910TR </td><td></td></tr></tbody></table>

die beurteilung der replikation und beta-zellfunktion in adenoviral-transduzierten isoliert nager islets

Assessing Replication and Beta Cell Function in Adenovirally-transduced Isolated Rodent Islets

Glukosehomöostase wird hauptsächlich durch die endokrine Hormone Insulin und Glucagon gesteuert, sekretiert von der Pankreas-Beta und Alpha-Zellen. Funktionelle Betazellmasse wird durch die anatomische Betazellmasse sowie der Fähigkeit der Betazellen zu einer Nährstoffbelastung reagieren bestimmt. Ein Verlust der funktionellen Betazellmasse ist zentral für beide Hauptformen des Diabetes 1-3. Während die sinkende funktionale Betazellmasse ergibt sich aus einer Autoimmun-Attacke beim Typ 1 Diabetes, bei Typ 2 Diabetes entwickelt sich dieser Dekrement sowohl aus der Unfähigkeit der Beta-Zellen gegenüber Insulin angemessen absondern und die Zerstörung der Beta-Zellen aus einem Kader von Mechanismen. Daher sind Bemühungen um eine funktionale Betazellmasse wieder vorrangig für die bessere Therapie und mögliche Heilmittel für Diabetes. Es sind Bemühungen im Gange, um molekulare Signalwege, die ausgenutzt, um die Replikation zu stimulieren und verbessern die Funktion der Beta-Zellen identifizieren kann.Im Idealfall würde therapeutische Ziele verbessern sowohl Beta-Zell-Wachstum und Funktion. Vielleicht noch wichtiger ist jedoch zu erkennen, ob eine Strategie, die Beta-Zellen stimuliert das Wachstum auf Kosten der Beeinträchtigung der Beta-Zellen-Funktion (wie mit einigen Onkogene) und umgekehrt wird. Durch die systematische Unterdrückung oder Überexpression der Expression von Zielgenen in isolierten Ratten-Inseln, kann man potenzielle therapeutische Ziele für die Erhöhung funktionale Betazellmasse 4-6. Adenovirus-Vektoren können, um effizient überexprimieren oder Knockdown Proteine ​​in isolierten Ratteninseln 4,7-15 eingesetzt werden. Hier präsentieren wir eine Methode, um die Genexpression Nutzung adenoviralen Transduktion zu manipulieren und zu bewerten Inselchen Replikation und Beta-Zellfunktion in isolierten Ratten-Inseln (Abbildung 1). Diese Methode wurde bereits auf neue Ziele, die Beta-Zell-Vermehrung oder Funktion modulieren 5,6,8,9,16,17 zu identifizieren.

Dieses Protokoll erlaubt es, Faktoren, die funktionelle Betazellmasse modulieren, um potentielle therapeutische Ziele für die Behandlung von Diabetes zu finden identifizieren. Das Protokoll besteht aus einem optimierten Verfahren zur Insel Replikation und Beta-Zellfunktion in isolierten Ratteninseln nach Manipulation der Genexpression mit Adenoviren zu beurteilen.

Die Beurteilung der Replikation und Beta-Zellfunktion in adenoviral-transduzierten Isoliert Nager Islets

Die Glukosehomöostase wird primär durch die endokrinen Hormone Insulin und Glukagon gesteuert, die von den Beta- und Alpha-Zellen der Bauchspeicheldrüse sekretiert werden, ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Signalwege zu identifizieren, die Veränderungen der funktionellen Beta-Zellmasse regulieren. Dies wird in isolierten Ratten-Inseln erreicht, indem die Expression eines Gens mittels adenoviraler Vektoren überexprimiert oder unterdrückt wird. Nach dieser Manipulation wird die Funktion der Beta-Zellen anhand der Insulinsekretion beurteilt und die Inselzellreplikation durch die Inkorporation von tritiiertem Thymidin gemessen.Schließlich können diese Assays zeigen, ob ein Gen der Interesse die Proliferation und/oder Funktion von Beta-Zellen in vitro reguliert. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Augenlidbiologie zu beantworten, beispielsweise ob eine bestimmte Komponente eines Signalwegs das Wachstum und die Funktion von Beta-Zellen beeinflusst. Bereiten Sie eine sechsfach nicht mit Gewebekultur beschichtete Platte vor, indem Sie zwei Milliliter modifiziertes Medium in die erforderliche Anzahl von Vertiefungen geben.Beispielsweise kann ein typisches Experiment drei Vertiefungen erfordern, jeweils eine für eine Kontrolle ohne Virus, eine Virus-Kontrolle und die experimentelle Gruppe. Erwärmen Sie die Platte mindestens 30 Minuten lang in einem Zellkultur-Inkubator auf 37 Grad Celsius. Unmittelbar nach der Isolierung der Ratten-Augenlöcher werden jeweils ein bis 200 Augenlöcher in jede Vertiefung der vorbereiteten Platte gegeben. 60 Augenlöcher werden für biochemische Assays verwendet, die verbleibenden Augenlöcher können für Genexpressionsstudien oder Immuno-Blotting genutzt werden. Schwenken Sie die Platte vorsichtig, um die Augenlöcher in die Mitte jeder Vertiefung zu bringen.Pipettieren Sie das Adenovirus anschließend unverzüglich direkt auf die Ösen in der Mitte der Schale. Verwenden Sie eine Multiplizität der Infektion von 1 bis 500, abhängig von der Wirksamkeit des Adenovirus bei der Überexpression oder Herunterregulierung Ihres Proteins von Interesse.Eine effiziente adenovirale Penetration bis zum Kern des Augenlids erhöht die Konsistenz der Ergebnisse. Die Transduktion der Augenlider unmittelbar nach der Isolierung des Augenlids ist entscheidend.Stören Sie die Platte fünf Minuten lang nicht, dann bringen Sie sie für 24 Stunden in den Inkubator. Am nächsten Tag nehmen Sie die Platte aus dem Inkubator und quellen die Öhrchen vorsichtig auf die Zentren der Vertiefungen auf. Überführen Sie die Öhrchen mit einer 200-Mikroliter-Mikropipette in eine neue Vertiefung, die frisches Medium enthält.Wenn die Augenlöcher mit der Platte verkleben, können sie vorsichtig mit der Pipettenspitze gelöst werden. Es ist hilfreich, ein Kontrollvirus, das GFP exprimiert, zu verwenden, um die ausreichende Transduktionseffizienz mittels konfokaler Mikroskopie zu überprüfen und die Penetration des Adenovirus in die Inselzellkultur zu visualisieren. Die Inseln werden für ein bis drei weitere Tage kultiviert, wobei das Medium täglich gewechselt wird.Die Kulturdauer muss anhand von Vorstudien optimiert werden und variiert je nach den experimentellen Zielen. Fügen Sie für die letzten 24 Stunden tritiertes Thymidin in das Medium mit einer Konzentration von einem Mikrocurie pro Millimeter Medium hinzu. Bereiten Sie zunächst frisch 50 Milliliter des Arbeits-SAB in einem 50-Milliliter-Konischgefäß vor und erwärmen Sie es in einem 37 Grad Celsius warmen Wasserbad.Pipettieren Sie 10 Milliliter des arbeitsfertigen SAB in ein 15-Milliliter-Konischgefäß und geben Sie 66,8 Mikroliter 2,5-molarer D-Glucose hinzu. Um das SAB mit hohem Glucosespiegel herzustellen, geben Sie 44,8 Mikroliter 2,5-molarer D-Glucose zu den verbleibenden 40 Millilitern des arbeitsfertigen SAB. Um das SAB mit niedrigem Glucosespiegel herzustellen, beschriften Sie zunächst drei 1,7-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen.Für jede Vertiefung der sechsstelligen Platte geben Sie einen Milliliter PBS in jedes Röhrchen. Vergessen Sie nicht, den institutionellen Vorschriften für die Handhabung und Entsorgung der radioaktiven Augenringe zu folgen. Wählen Sie mithilfe eines Stereomikroskops oder eines herkömmlichen Mikroskops 20 vergleichbar große Augenringe aus und überführen Sie diese in jedes Mikrozentrifugenröhrchen.Beispielsweise kann jedes Reagenzglas fünf kleine, zehn mittlere und fünf große Augen enthalten. Obwohl die Ergebnisse am Ende des Experiments auf den Gesamtgehalt an Protein normalisiert werden, ist es entscheidend, die Augen zwischen den Gruppen nach Größe zu vergleichen. Nachdem man den Augen ermöglicht hat, sich durch Schwerkraft oder Zentrifugation am Boden des Reagenzglases abzusetzen, aspirations das PBS mit einer Mikropipette, wiegt es ab und fährt dann mit der Vorbereitung der Augen für die biochemischen Assays fort.Um die Augenlöcher für den Insulinsekretionsassay vorzubereiten, müssen sie zunächst mit SAB mit niedrigem Glucosespiegel vorinkubiert werden. Dazu 400 Mikroliter des SAB mit niedrigem Glucosespiegel in die Röhrchen geben und diese mit verschlossenen Deckeln eine Stunde lang in den Zellkulturinkubator stellen. Nach einer Stunde das vorinkubierte SAB mit niedrigem Glucosespiegel abpipettieren, um die basale Insulinsekretion zu messen. Wiederholen Sie den Vorinkubationsschritt erneut.Um jedoch die stimulierte Insulinsekretion zu messen, verwenden Sie 400 Mikroliter SAB mit hohem Glucosespiegel anstelle von SAB mit niedrigem Glucosespiegel und inkubieren Sie die Augenringe wie zuvor 60 Minuten lang. Nach der Inkubation in entweder SAB mit hohem oder niedrigem Glucosespiegel pipettieren Sie das SAB ab und verwenden es für die Insulin-Radioimmunassay, die gemäß der Herstellerprotokoll durchgeführt wird. Fahren Sie anschließend mit dem Thymidin-Einbau-Assay unter Verwendung derselben Augenring-Sammlung fort. Beginnen Sie mit den Augenringen, die gerade für den Insulinsekretions-Assay verwendet wurden.Geben Sie einen Milliliter PBS hinzu und lassen Sie die Ösen durch Schwerkraft absetzen. Danach saugen Sie das PBS mit einer Mikropipette ab. Entsorgen Sie das abgesaugte Medium und wiederholen Sie diesen Schritt noch einmal.Fügen Sie anschließend 500 Mikroliter eiskalte Trichloressigsäure zu den Augenlöchern hinzu und inkubieren Sie diese 30 Minuten lang auf Eis. Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei vier Grad Celsius. Danach aspirationsbedingt die TCA verwerfen.Fügen Sie anschließend 80 µL 0,3 normaler Natronlauge hinzu und inkubieren Sie die Augenlöcher 30 Minuten bei Raumtemperatur. Während dieser Inkubation wirbeln Sie die Proben alle 10 Minuten kräftig 5 bis 10 Sekunden lang im Vortex. Parallel dazu geben Sie vier Milliliter eines Conno-Safe-Zählcocktails in Sieben-Milliliter-Flüssigszintillationszählerrohre.Nach Beendigung der Inkubation der Ösen fügen Sie 50 Mikroliter der Ösen einem Szintillationsröhrchen hinzu. Schütteln Sie das verschlossene Röhrchen kurz und messen Sie die Radioaktivität der Proben in einem Flüssigkeits-Szintillationszähler. Um außerdem die Proteinkonzentration zu bestimmen, übertragen Sie 10 Mikroliter Vilas in einen kommerziellen Bionsäure-Assay und befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers.Später während der Datenanalyse normalisieren Sie die Ergebnisse anhand der Protein­konzentration unter Verwendung der beschriebenen Protokolle. Augenringreplikation und Beta-Zell-Funktion. Bei Ratten wurde durch eine adenovirale Überexpression des hypothetischen Gens sechs eine robuste Stimulation der Augenringreplikation ohne Veränderung der Beta-Zell-Funktion nachgewiesen.Erh&ouml;hte Expression des Gens sechs, erh&ouml;hte DNA-Synthese, gemessen an der Inkorporation von Thymidin, da die meisten Zellen im Ratten-Augen&ouml;hrchen Beta-Zellen sind. Weitere Experimente k&ouml;nnten zeigen, dass die erh&ouml;hte Thymidininkorporation auf eine vermehrte Replikation der Beta-Zellen zur&uuml;ckzuf&uuml;hren ist. Der Insulinsekretions-Assay zeigte, dass die &Uuml;berexpression des Gens sechs eine der Hauptfunktionen der Beta-Zellen – die Insulinsekretion bei niedrigem und hohem Glukosespiegel – nicht ver&auml;ndert hat.Der Anstieg der Insulinsekretion bei niedrigen und hohen Glukosekonzentrationen spiegelt die Gesundheit der Inseln nach der Behandlung mit Adenovirus wider. Wenn eine erhöhte Expression des Gens sechs die Betazellenfunktion beeinträchtigen würde, würde sich dies vermutlich als Verringerung der bei hohen stimulierenden Glukosekonzentrationen freigesetzten Insulinmenge zeigen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die Replikation von Betazellen und die Insulinsekretion misst, um zu bestimmen, ob ein bestimmtes Gen das Wachstum oder die Funktion von Betazellen beeinflusst.

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Forschung

JoVE Journal

Medicine

Medizin

Wir beschreiben hepatische neo-Inselzellen Formation in STZ (Streptozotocin)-induzierte diabetische Mäuse durch Gentransfer von Neurogenin3 (Ngn3) und Betacellulin (BTC) Verwendung von Helfer-abhängigen Adenovirus-Vektor (HDAd) und der Umkehrung von Hyperglykämie. Unsere Methode nutzt die Vorteile von Helfer-abhängigen Adenovirus-Vektoren mit ihren hocheffizienten in vivo Transduktion und der lang anhaltende Genexpression.

Neo-Islet Formation in Leber der diabetischen Mäuse von Helper-abhängigen Adenovirus-Vektor-vermittelten Gentransfer

Die Untersuchung in vitro β-Zell-Funktion mit isolierten Maus-Langerhans-Inseln ist ein wichtiger Bestandteil in der Studie der Diabetes Pathophysiologie und Therapie. Während viele Downstream-Anwendungen zur Verfügung stehen, dieses Protokoll beschreibt speziell die Messung der intrazellulären zyklischen Adenosinmonophosphat (cAMP) als wesentlicher Parameter, der β-Zellfunktion.

Eine Methode zur Maus-Inselzellen der Bauchspeicheldrüse Isolation und intrazellulären cAMP-Bestimmung

Wir präsentieren hier ein Protokoll für die Isolierung von Inselzellen aus dem Mausmodell für Typ-2-Diabetes, Leprdb und Details eines Lebendzell-Assays zur Messung der Insulinsekretion von intakten Inseln, der 2-Photonenmikroskopie verwendet.

Lepr<sup&gt; Db</sup&gt; Mausmodell des Typ-2-Diabetes: Pancreatic Islet Isolation und Live-cell 2-Photonen-Imaging von intakten Inseln

In vitro - Kolonie - Assays Selbsterneuerung und Differenzierung von Vorläuferzellen , isoliert aus adulten murinen Bauchspeicheldrüse sind entwickelt zu detektieren. In diesen Assays geben Bauchspeicheldrüsen Progenitoren Anlass zu Zellkolonien in 3-dimensionalen Raum in Methylcellulose-enthaltende halbfeste Medium. Protokolle für die sind einzelne Zellen und Charakterisierung von einzelnen Kolonien Handhabung beschrieben.

In - vitro - Assays für Colony Tri-potente Progenitorzellen Charakterisieren von den Adult Murine Pancreas Isoliert

Kritische Herausforderungen für die Diabetesforschung Bereich sind die molekularen Mechanismen zu verstehen, die Insel β-Zellreplikation regulieren und β-Zellregeneration zur Stimulierung der Methoden zu entwickeln. Hierin ist ein High-Content-Screening-Verfahren zur Identifizierung und der β-Zellreplikation fördernden Aktivität von kleinen Molekülen bewerten dargestellt.

Ein hoher Gehalt<em&gt; In Vitro</em&gt; Pancreatic Islet β-Zell-Replikation-Discovery-Plattform

Hier stellen wir eine Methodik zur Erzeugung und Verabreichung von Verbindungen aus zinsgeladenen Poly(milchsäure-co-glykolsäure) (PLGA)-Mikrosphären an intakte Mausinseln in Kultur mit anschließender Immunfluoreszenzanalyse der β-Zellproliferation vor. Diese Methode eignet sich zur Bestimmung der Wirksamkeit von Kandidaten-β-Zell-Mitogenen.

Sustained Verabreichung von β-Zellen-Mitogene zu Intact Maus Inselchen<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Verwendung von biologisch abbaubaren Poly (Milch-co-Glykolsäure) Microspheres

Ein Protokoll zur Erstellung genmodifizierter menschlicher Pseudoislets aus dispergierten menschlichen Inselzellen, die durch Lentivirus mit kurzer Haarnadel-RNA (shRNA) transduziert werden, wird vorgestellt. Dieses Protokoll verwendet leicht verfügbare Enzym- und Kulturgefäße, kann leicht durchgeführt werden und produziert genetisch veränderte menschliche Pseudoislets, die für funktionelle und morphologische Studien geeignet sind.

Lentiviral vermittelte Gen-Silencing in humanem Pseudoislet in niedrigen Befestigungsplatten zubereitet

Ziel dieses Protokolls ist es, die Dynamik des menschlichen Pankreas-Islet-Entransplantierungsprozesses und des beitragenden Wirts- und Spenderzellen kontinuierlich zu überwachen. Dies wird durch die Transplantation menschlicher Inselchen in die vordere Augenkammer (ACE) eines NOD erreicht. (Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/-Mausempfänger gefolgt von wiederholter 2-Photonen-Bildgebung.

Längsschnitt in Vivo Bildgebung und Quantifizierung der menschlichen Pankreas-Islet-Grafting- und Beitragenden Wirtszellen in der Vorderen Augenkammer

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur synchronen Erfassung und Co-Registrierung von intrazellulären Signalereignissen und der Sekretion von Insulin und Glukagon durch primäre humane Pseudoinseln unter Verwendung der adenoviralen Verabreichung eines zyklischen Adenosinmonophosphat (cAMP)-Biosensors, eines cAMP-Differenzdetektors in situ (cADDis) und eines Mikroperifusionssystems.

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