Imaging und 3D-Rekonstruktion der zerebrovaskuläre Strukturen in embryonalen Zebrafisch

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, zerebrovaskuläre Strukturen in embryonalen Zebrafischen zu bewerten. Dies wird erreicht, indem zunächst befruchtete Zebrafischeier gesammelt und die Behandlungsbedingungen festgelegt werden. Nach einer Wachstumsphase von drei Tagen werden die Zebrafische fixiert geopfert und vorsichtig ein Auge entfernt, bevor das Exemplar auf Deckglas montiert wird.

Anschließend wird das Zerebrogefäßsystem durch konfokale Mikroskopie abgebildet. Abschließend werden 3D-Renderings des Gefäßsystems mit Hilfe von Open-Source-Software erstellt. Letztendlich wird die Analyse der Rekonstruktionen verwendet, um die Auswirkungen der Behandlungsbedingungen auf die Verzweigung und Dichte der Blutgefäße zu bestimmen.

Im sich entwickelnden Gehirn von Zebrafischen. Mit dieser Technik wird das gesamte Gefäßsystem des embryonalen Zebrafisches bewertet. Es hat uns ermöglicht, die Biologie von Amyloid-Beta auf der Ebene von Organsystemen zu untersuchen.

Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da das Sezieren und die Bildanalyse schwer zu erlernen sind, da sie technisch anspruchsvoll sind. Zu Beginn wird ein transgener Zebrafischstamm gezüchtet, der in den gewünschten Geweben bei 28,5 Grad Celsius mit einem 14-stündigen Licht- und 10-stündigen Dunkelzyklus verstärktes grün fluoreszierendes Protein exprimiert. In diesem Beispiel werden transgene Fische, die EGFP in vaskulären Endothelzellen exprimieren, in der Nacht vor der Eizellentnahme aufgezogen. Männchen und Weibchen werden in Paarungsbecken mit Netzböden aufgestellt. Entfernen Sie am nächsten Morgen die Trennwand und lassen Sie die Fische sich paaren, wobei Sie alle 15 Minuten nach Eiern suchen.

Nachdem Sie die Eier mit einem Netzsieb aufgefangen und mit E drei gewaschen haben, verwenden Sie E drei, um die Eier in 100-Millimeter-Kulturschalen zu überführen und bei 28 Grad Celsius zu inkubieren, um die zerebrovaskuläre Verzweigung zu verändern. Beginnen Sie 24 Stunden nach der Befruchtung, fügen Sie eine Chemikalie wie einen in DMSO solubilisierten Gamma-Sekretase-Inhibitor hinzu. Falls gewünscht, fügen Sie 0,03 % PTU hinzu, um die Pigmentbildung zu hemmen.

Nach dem Transfer der Embryonen in Lösung in die Vertiefungen einer 12 Vertiefung wird die Platte bei 28,5 Grad Celsius inkubiert, bis die Embryonen das gewünschte Entwicklungsstadium erreicht haben. Nachdem sie Embryonen in Trica geopfert und über Nacht bei vier Grad Celsius mit Aldehyd fixiert hatten. Lagern Sie Embryonen in PBS im Dunkeln bei vier Grad Celsius.

Um das Auge aus dem Embryo zu entfernen, verwenden Sie eine angespitzte Wolframnadel und schneiden Sie um das Gewebe herum, das ein Auge verbindet. Dann durchtrennen Sie die Muskeln und zum Schluss den Sehnerv, um das Auge zu entfernen. Sobald das Auge entfernt ist, drehen Sie den Embryo mit der leeren Augenhöhle nach unten auf ein Deckglas und berühren Sie das Deckglas.

Fügen Sie einen Tropfen 3%ige Methylcellulose hinzu, um den Embryo an Ort und Stelle zu halten und den gesamten Embryo zu bedecken, um ein Austrocknen zu verhindern. Bei der Bildgebung mit einem inversen konfokalen Mikroskop mit einem 20-fach-Plan-APO-Objektiv, dem Embryo, ist der Embryo sofort in der Lage, Gefäßstrukturen nur auf halbem Weg durch diese Probe aufzulösen. Wenn dies der Fall ist, reanimation, suspendieren Sie den Embryo in PBS und montieren Sie ihn auf der kontralateralen Seite wieder für die weitere Bildgebung, um eine 3D-Rekonstruktion von zerebrovaskulären Bildern mit Bild J durchzuführen, das für 3D-Renderings optimiert ist.

Importieren Sie konfokale Stacks, indem Sie zu Plugins, Loci, Bio Formats Importer gehen und dann die konfokale Datei für Nikon-Stacks auswählen. Wählen Sie View Stack mit Hyper-Stack und stellen Sie den Farbmodus auf Graustufen ein. Aktivieren Sie dann die Option Automatische Skalierung und Kanäle teilen. Diese Auswahl öffnet vier separate Kanalfenster.

Schließen Sie alle Bilder mit Ausnahme des 16-Bit-Bildes, wobei der Dateiname gefolgt von c gleich eins ist. Passen Sie den Schwellenwert an, indem Sie die Registerkarte "Bildlauf" am unteren Rand verwenden, um ein Segment zu durchsuchen, das den gewünschten Bereich oder die gewünschte Struktur aufweist. Gehen Sie dann zum Schwellenwert für die Bildanpassung.

Schieben Sie in dem angezeigten Fenster die obere Leiste nach links, so dass die Struktur gut über dem Hintergrund zu sehen ist, und lassen Sie die untere Folie dort, wo sie ist, um ein neues Acht-Bit-Bild zu erstellen. Wählen Sie b und w. Dann dunkler Hintergrund.

Wählen Sie nicht für jedes Bild die Option "Schwellenwert berechnen" aus, es sei denn, für jedes Segment sind unterschiedliche Anpassungen erforderlich. Gehen Sie als Nächstes zu Plugins 3D-Viewer Schwellenwert Null Resampling-Faktor eins oder zwei und deaktivieren Sie die roten und blauen Farbfelder, um eine grüne 3D-Ausgabe zu erstellen. Andernfalls wird ein weißes Rendering erzeugt.

Wählen Sie dann Anwenden aus. Verwenden Sie die Maus- und Tastatursteuerung, um das 3D-Bild zu drehen, zu drehen und zu zoomen, um Standbilder an beliebiger Stelle zu speichern. Verwenden Sie die Aufnahmeoption im Menü.

Die Größe des Bildfelds auf dem Bildschirm bestimmt die Pixelabmessungen des erzeugten Bildes. Wenn Sie also ein Bild mit hoher Auflösung wünschen, vergrößern Sie das Feld, indem Sie die untere rechte Ecke ziehen. Erstellen Sie einen sich drehenden 3D-Film, indem Sie "360-Grad-Drehung anzeigen" auswählen. Speichern Sie schließlich die Datei in einem von mehreren verfügbaren Formaten und verwenden Sie den kostenlosen Open-Source-Mediaplayer VLC zum Betrachten von 3D.

Die Rekonstruktion von Gefäßstrukturen bietet eine umfassende und visuell interessante Perspektive auf die Entwicklung der Zebrafische. Hier sind mehrere Winkel von Gefäßstrukturen in einem Zebrafischembryo sechs Tage nach der Befruchtung gezeigt, der EGFP in Endothelzellen mit monochromen grünen oder weißen Farben exprimierte. Es kann schwierig sein, die Signalintensität zu schätzen, aber die Pseudofärbung liefert die Bildintensität aus einer Nachschlagetabelle, die eine bessere Tiefenwahrnehmung von überlappenden Strukturen ermöglicht.

Diese Abbildung zeigt zum Beispiel ein pseudofarbiges 3D-Bild des Gefäßsystems in einem Zebrafisch sechs Tage nach der Befruchtung Nach seiner Entwicklung. Diese Technik ermöglichte es uns, die vaskulären Wirkungen von Amyloid-Beta im Gehirn eines Wirbeltiers zu untersuchen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die Gefäßnetzwerke im embryonalen Zebrafisch visualisiert, was ein kostengünstiges und zugängliches System zur Untersuchung der Angiogenese darstellt.