Name: Eine vielseitige Montagemethode für Langzeit Imaging von Zebrabärblingentwicklung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 55 s
Description: Lernen Sie eine vielseitige Montagemethode für Langzeit-Imaging von Zebrabärblingsembryonen. Diese Technik ermöglicht normale Entwicklung und detaillierte Beobachtung zellulärer Verhaltensweisen während der Morphogenese.

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Estelle Hirsinger: Grundfinanzierung durch das Institut Pasteur und die Agence Nationale de la Recherche (ANR-10-BLAN-121801 DEVPROCESS). Estelle Hirsinger ist vom Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS). Benjamin Steventon wurde gefördert von der Agence Nationale de la Recherche (ANR-10-BLAN-121801 DEVPROCESS), dann ein Roux-Stipendium (Institut Pasteur) und dann ein AFM-Téléthon-Stipendium (Nummer 16829). Heute wird er von einem Sir Henry Dale Fellowship des Wellcome Trust/Royal Society unterstützt.

1. Herstellung von Lösungen und Pulled Glasnadel <ol><li> Machen Sie eine 25x Stammlösung von Tricaine (3-Amino benzoesäureethylester, die auch als Ethyl-3-aminobenzoat) bei 4 mg / ml in 20 mM Tris pH 8,8 und bringen diese Lösung bei pH 7. Aliquot von 4 ml und an einem -20 ° C. HINWEIS: Das Anästhetikum Tricaine wirkt bevorzugt auf neuronalen spannungsgesteuerten Natriumkanäle dadurch blockiert Muskelzuckungen und Bewegung 6. </li><li> Machen Sie eine Arbeitslösung von Tricaine bei einer Endkonzentration von 0,17 mg / ml in E3 Embryo Medium. 7 HINWEIS: Stellen Sie die Tricaine Arbeitslösung unvorbereitet wie der pH-Wert dieser Lösung driftet. </li><li> Man löst den niedrigschmelzender Agarose bis zu einer Endkonzentration von 1,5% in E3 embryo-Medium in einem 50 ml-Röhrchen, indem die Lösung in einer Mikrowelle erhitzt wird. entweder in einem Wasserbad oder Benchtop-Inkubator 45 ° C - Lassen Sie diese Lösung auf 42 ins Gleichgewicht. Wenn die Vorbereitung große Gerichte für vertikaleLichtbogen-Bildgebung (Schritt 4), zusätzlich 25 ml 1% Standard Schmelzen Agarose in E3 Embryo Medium. </li><li> Verwenden Sie Borosilikatglas mit Filament Kapillaren mit Abmessungen von 1,20 mm OD, ID 0,69 mm, Länge 10 mm. </li><li> Wenn Kapillaren von der Art der Heizung Faden Nadel Abzieher beschrieben in der Tabelle von Geräten und Reagenzien gezogen wird , verwenden Sie die folgenden Einstellungen: Wärme 600, Pull 120, Geschwindigkeit 50, Zeit 225, Druck 500. Mit einem Paar scharfe Zange, Pause die Nadel gerade hinter dem Punkt, an dem es biegt sich für orientierende Embryonen eine saubere und scharfe Nadel zu schaffen und überschüssige Agarose zu entfernen. Ein Mikroskalpell kann auch verwendet werden, um überschüssige Agarose zu entfernen. </li></ol> 2. Einbettung von Embryonen für Inverted oder Upright Mikroskopie <ol><li> Heben Sie die Embryonen in E3 Embryo Medium auf die entsprechende Bühne. 7 </li><li> Bei der erforderlichen Stufe dechorionate Embryonen mit einem Paar von scharfen Pinzette unter einem Binokular dissecting Mikroskop. </li><li> Inkubieren Sie die dechorionated Embryonen für mindestens 5 min in der Tricaine Arbeitslösung. </li><li> Sobald die geschmolzene Agarose-Lösung auf 45 ° C abgekühlt ist, verwenden, um eine Glaspasteurpipette den dechorionated Embryo direkt in das 50 ml-Röhrchen mit minimaler Übertragung von E3 Medium zu übertragen. </li><li> Entfernen Embryo zusammen mit etwa 1 ml Medium Montage und fügen Sie ca.. 100 &amp; mgr; l mit einem 10 mm Mikrotiterplatten-Medium zusammen mit dem Embryo mit dem zentralen Kreis einer 35 mm Glasboden-Petrischale Montage. </li><li> Da die Montagemedium setzt, um den Embryo an den Rand des Kreises der Agarose mit dem Schwanz nach außen (Abbildung 1A) gegenüber zu bewegen. Verwenden Sie die Kapillarnadel den Embryo in der gewünschten seitlichen Ausrichtung zu halten, bis das Gel vollständig eingestellt. Um das Bild zu hinteren Körperentwicklung, achten Sie darauf, den Embryo in eine seitliche einer Orientierung wie möglich zu orientieren. Daher halten den Embryo in dieser Stellung durch vorsichtiges adjustments mit der Kapillare Nadel. HINWEIS: Mehrere Embryonen kann an dieser Stelle auf die Montageschale gegeben werden, falls erforderlich. Wenn dies der Fall ist, übertragen, das niedrigschmelzende Agarose in die Schale erste und die Embryonen in der Mitte der Agarose Tropfen hinzu. Drücken Sie dann die Embryonen aus zu den Rändern des Glasring und orientieren in die gewünschte Position. Bis zu sechs Embryonen können auf diese Weise montiert werden, bevor die Agarose verfestigt wird. </li></ol> 3. Entfernen von überschüssiger Agarose Rund um den Hinterleib Hinweis: Dieser Abschnitt beschreibt das Verfahren, mit dem Agarose aus dem Bereich entfernt wird, um den hinteren Körper umgibt. Im Falle von posterior Körperdehnung, ist es wichtig, dass der Schwanz normalerweise wachsen-out kann zu gewährleisten. Durch das Entfernen der Agarose nach der Embryo durch Agarose vollständig aufgenommen wurde, wird der Embryo durch den Kopfbereich und etwa die Hälfte der Dottersack eingeschlossen gelassen. <ol><li> Nachdem die Agarose Tropfen gesetzt hat, überfluten die Petri-dish mit der Tricaine Arbeitslösung. </li><li> Unter einem Sezieren Binokular mit einer Durchlichtbasis, passen Sie die Spiegelposition und der Winkel des einfallenden Lichts, so dass der starke Kontrast für die Schnitte in der Agarose ermöglicht, durch den Betrieb deutlich zu sehen. </li><li> Zur Durchführung geschnitten 1 (Abbildung 1), verwenden Sie die Kapillar - Nadel oder die Mikro-Skalpell die Agarose auf halbem Weg entlang der Dotter zu schneiden, aus einer Position posterior nur zur Formherzfeld in die Position des somite 5 (5. anterioren Somiten). </li><li> Starten Sie den ersten Schnitt neben dem Inneres bilden, wie gezeigt, und die vollständige Weg durch die Agarose auf das Glas. </li><li> Halten Sie die Kapillare oder Mikroskalpell tief in der Agarose und langsam sah nach oben und unten , während beginnen einen langen Schnitt über den Embryo zu machen , wie 1 gezeigt Abbildung. Schneiden Sie so nah an der Embryo wie möglich, ohne den Embryo oder Eigelb Punktierung. </li><li> Als nächstes stellen Schnitte 2 und 3 (Abbildung 1 </strong&gt;) Aus der Position gegenüber dem Embryo beginnt und mit dem Schnitt bis auf das Glas ganzen Weg Bodenschale. Machen Sie 2 geschnitten, so dass sie tangential zu den ersten 5 Somiten ist, so dass eine uneingeschränkte dorsalwärts des hinteren Körpers entfaltet. Machen Sie 3 schneiden in einem Winkel von 90 ° mit dem Eigelb Oberfläche und ausgehend von der Heartfield. HINWEIS: Das Schneiden des Agarose , bis der Rand des Glaskreis hilft bei der Entfernung der Agarose als kompletter Block (Schritt 3.6) (wie in Abbildung 1 gezeigt). Jedoch ist dies nicht notwendig. </li><li> Beginnend an der Kreuzung der Schnitte 1 und 3 machen einen langsamen Diagonalschnitt gegen Ende des Schnitts 2, während sich langsam nach oben, um das Anheben des quadratischen Agarose rund um den hinteren Körper zu entfernen. Anmerkungen: In einigen Fällen wird dies in einem Block freigegeben werden und der Betrieb wird in einem Arbeitsgang abgeschlossen. In anderen Fällen kann es mehrere Versuche, dis-lodge alle Agarose rund um den Embryo nehmen. </li><li> Mit einem Paar scharfe Zange, entfernen Sie das verdrängt bSchlösser von Agarose aus dem Embryo Medium. in diesem Prozess zu unterstützen, die Agarose-Stücke auf die Seite der Schale bewegen und die Wand der Petrischale als Träger verwenden, während die Agarose-Stücke herausheben. </li></ol><img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/55210/55210fig1.jpg" /> Abbildung 1: Diagramme von Montage - Set-ups. (A) Das Diagramm zeigt die Position des montierten Embryo innerhalb der Mitte Glasring einer Petrischale. Auf der rechten Seite ist ein lautes Summen des Embryos mit jedem aufeinanderfolgenden Schnitt durch die mit dottted roten Linien Agarose gezeigt umgibt. (B) Die montierten Embryonen ist in der Seitenansicht diagrammed Anzeige der Leichtigkeit des Zugangs für Kehr- und aufrecht Ziele. (C) Ein ähnliches digram zeigt , wie Embryonen können für vertikale Lichtbogen Abbildungsaufbauten montiert werden. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55210/55210fig1large.jpg" target="_blank">Bitte cl</a>ick hier eine größere Version dieser Figur zu sehen. <ol start="9"><li> Wenn Muskelzucken nicht vollständig an diesem Punkt blockiert wird, fügen Tropfen Tricaine aus der Stammlösung von 4 mg / ml, pH 7. </li></ol> 4. Montage von Embryonen für vertikale Lichtbogen-Mikroskopie Hinweis: Dies ist eine Variante der oben beschriebenen Methode, dass für den Zugriff mehrerer Ziele umrissenen ermöglicht Abbilden von Proben durch vertikal orientierte SPIM. Die Idee hinter dieser Variante wird die Probe geringfügig höher als der Boden der Schale zu heben, um einen einfachen Zugang von zwei Abbildungsziele zu ermöglichen. <ol><li> Vor Montage zu probieren, Mantel eine 100 mm Petrischale aus Kunststoff mit 1% Agarose in E3 Medium bis zu einer Höhe von 5 mm und stehen lassen. </li><li> Geben Sie einen Tropfen von 1 ml mit niedrigem Schmelzpunkt Agarose in die Mitte des Tellers und stehen lassen. </li><li> Einbetten von Embryonen in niedrigschmelzender Agarose, wie in Abschnitt 2. Dieses Mal jedoch, entfernen Sie den Embryo aus dem 50-ml-TubeAgarose mit einem kleineren Tropfen Lösung (0,5 ml) und legen diese kleinen Tropfen auf dem 1 ml in der Mitte der Schale fallen. </li><li> Verwenden Sie die Kapillarnadel den Embryo in der Mitte des kleinen Tropfen zu platzieren und zu pflegen ihre korrekte Ausrichtung bis Gel festgelegt ist. </li><li> Fluten die Schale mit Tricaine Arbeitslösung und entfernen Sie das überschüssige Agarose, wie in Abschnitt 3, jedoch ohne durch das Polster von 1% Standard-Agarose-Schneiden. </li></ol>

<ol><li>Graeden, E., Sive, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+Imaging+of+the+Zebrafish+Embryonic+Brain+by+Confocal+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy.</a> J Vis Exp. (26), e1-e2 (2009).</li>
<li>Delaune, E. A., François, P., Shih, N. P., Amacher, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Cell-Resolution+Imaging+of+the+Impact+of+Notch+Signaling+and+Mitosis+on+Segmentation+Clock+Dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Single-Cell-Resolution Imaging of the Impact of Notch Signaling and Mitosis on Segmentation Clock Dynamics.</a> Dev Cell. 23 (5), 995-1005 (2012).</li>
<li>Lawton, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulated+tissue+fluidity+steers+zebrafish+body+elongation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Regulated tissue fluidity steers zebrafish body elongation.</a> Development. 140 (3), 573-582 (2013).</li>
<li>Dray, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-Fibronectin+Interactions+Propel+Vertebrate+Trunk+Elongation+via+Tissue+Mechanics%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell-Fibronectin Interactions Propel Vertebrate Trunk Elongation via Tissue Mechanics.</a> Curr Biol. 23 (14), 1335-1341 (2013).</li>
<li>Steventon, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Species+tailoured+contribution+of+volumetric+growth+and+tissue+convergence+to+posterior+body+elongation+in+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Species tailoured contribution of volumetric growth and tissue convergence to posterior body elongation in vertebrates.</a> Development. 143, 1732-1741 (2016).</li>
<li>Attili, S., Hughes, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anaesthetic+Tricaine+Acts+Preferentially+on+Neural+Voltage-Gated+Sodium+Channels+and+Fails+to+Block+Directly+Evoked+Muscle+Contraction%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Anaesthetic Tricaine Acts Preferentially on Neural Voltage-Gated Sodium Channels and Fails to Block Directly Evoked Muscle Contraction.</a> PLoS ONE. 9 (8), 103751-103756 (2014).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="https://zfin.org/zf_info/zfbook/zfbk.html">The Zebrafish Book, 5th Edition; A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio)</a>. , University of Oregon Press. Eugene. Paperback (2007).</li>
<li>Schröter, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+zebrafish+somitogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Dynamics of zebrafish somitogenesis.</a> Dev Dyn. 237 (3), 545-553 (2008).</li>
<li>Megason, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+toto+imaging+of+embryogenesis+with+confocal+time-lapse+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol+%28Clifton%2C+N.J.%29%22%5BJournal%5D)">In toto imaging of embryogenesis with confocal time-lapse microscopy.</a> Methods Mol Biol (Clifton, N.J.). 546, Chapter 19 317-332 (2009).</li>
<li>Sugiyama, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Illuminating+cell-cycle+progression+in+the+developing+zebrafish+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Illuminating cell-cycle progression in the developing zebrafish embryo.</a> PNAS. 106 (49), 20812-20817 (2009).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Diese Befestigungstechnik ermöglicht Embryonen noch während der Übertragung an das Mikroskop und über an folgenden hinteren Körperdehnung mehrere Längenskalen dem Ziel eines langfristigen Zeitraffer-Imaging Experimente gehalten werden. Darüber hinaus ist es vielseitig, dass sie für die Bildgebung auf beiden aufrechten und der inversen Mikroskopie Aufbauten erlaubt, und ein Vorschlag gemacht wird, wie dies weiter vertikal ausgerichtet SPIM angepasst werden. Ein entscheidender Schritt in diese...

Posterioren Körper Dehnung ist ein wesentlicher Prozess bei der Embryonalentwicklung, durch die der Embryo ein großer Teil der Körperachse zu bilden, erstreckt. Es ist ein Beispiel eines komplexen morphogenetic Prozess, bei dem mehrere Zellverhalten koordinativ die Morphogenese auf der Ebene der einzelnen Gewebe zu erzeugen, wirken. Diese unterschiedlichen Gewebedeformationen dann zusammen wirken, um die Dehnung des hinteren Körpers an der gesamten Strukturebene zu erzeugen. Um zu verstehen , wie diese Prozesse werden gesteuert , und während der Entwicklung koordiniert, müssen wir in der Lage sein , diese Verfahren bei mehreren Skalen zu folgen (dh auf der Ebene von Molekülen, Zellen, Zellpopulationen und Gewebe) , und dieses an die Morphogenese der gesamten Struktur direkt zu beziehen . Zebrabärbling-Embryonen sind für die Bildgebung hintere Körperdehnung ideal als ihre optische Transparenz und die geringe Größe ermöglicht die Anwendung der minimal-invasiven Bildgebung Licht nähert sich gut für Live-Bildgebung. 1 Dieses wurde durch eine Reihe neuerer Publikationen belegt worden , die Licht auf hintere Körperentwicklung auf der Ebene von Molekülen vergossen haben, 2 Einzelzellen, 3 und inter Gewebe Verhaltensweisen, 4 sowie auf der Ebene der Zellpopulation und ganze Organ. 5 Advanced Imaging-Techniken wie konfokale Multiphotonenmikroskopie und selektive Ebene Beleuchtung Mikroskopie (SPIM) ermöglichen die langfristige Darstellung von Entwicklungsprozessen mit einer verminderten Wirkung von Licht Toxizität und Photobleaching. Robusten Techniken für die Montage von lebenden Proben benötigt werden drei Ziele zu erreichen: 1) eine ausreichende Unterstützung für das Mikroskop während der Übertragung Proben in der richtigen Ausrichtung zu halten und während der Aufnahme, 2) eine ausreichende Bewegungsfreiheit der Probe für das Auswachsen zu ermöglichen von der hintere Körperbereich ohne seine normale Entwick beeinflussenwicklung und schließlich 3) ein gewisses Maß an Vielseitigkeit des Montageverfahrens Bildgebung auf verschiedenen Imaging-Setups zu ermöglichen. Dieses Protokoll stellt eine Montagetechnik zum Abbilden der Entwicklung der Zebrabärbling D. rerio. Diese Technik beinhaltet Embryonen so dass der Kopf und yolk sac Regionen fast vollständig in Agarose enthalten, während Verlassen der posterior Körperbereich zu verlängern und zu entwickeln, die normalerweise Montage. Als solches ist es auch ein geeignetes Verfahren für die Langzeit-Bildgebung von anderen Regionen des Entwicklungs Körper als die Agarose Bildgebung durch Standardlichtabbildungstechniken ermöglicht. Dieses Protokoll veranschaulicht in einer seitlichen Ausrichtung von Embryonen Befestigungs, obwohl es auch möglich ist, Embryonen in alternativen Orientierungen zu montieren. Es wird weiter zeigen, wie das Verfahren zur aufrechten, umgedreht und vertikale Lichtbogen-Mikroskopie-Setups anzupassen.

<table><tbody><tr><td>VERBRAUCHSMATERIALIEN</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Schalen mit Glasboden</td><td>Mattek</td><td>P35-1.5-10-C</td><td>35 mm Petrischale, 10 mm Mikrotigramm. Nr. 1.5 Deckglas</td></tr><tr><td>Kapillaren für Injektionsnadeln</td><td>&nbsp; Sutter&nbsp;</td><td>BF 120-94-10</td><td>Wir verwenden Orosilikatglas mit Filament, AD 1,20 mm, ID 0,94 mm, Länge 10 cm. Filamentnadeln sind jedoch nicht erforderlich und die meisten Injektionsstandardnadeln sollten funktionieren.</td></tr><tr><td>Mikroskalpell</td><td>Feather</td><td>P-715</td><td>Micro Feather opthalmisches Einwegskalpell mit Kunststoffgriff</td></tr><tr><td>Pasteurpipetten</td><td></td><td></td><td>230 mm lang</td></tr><tr><td><stark>REAGENZIEN</stark></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tricain</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9414</td><td></td></tr><tr><td>EQUIPMENT</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Feine Pinzette&nbsp;</td><td>FINE SCIENCE TOOLS GMBH&nbsp;</td><td>11252-30&nbsp;</td><td>Dumont #5</td></tr><tr><td>Nadelabzieher&nbsp;</td><td>Sutter&nbsp;</td><td>P97</td><td>Heizfilament-Nadelzieher</td></tr><tr><td>Binokulares Präpariermikroskop</td><td>Leica</td><td>S8 Apo</td><td></td></tr></tbody></table>

eine vielseitige montagemethode für langzeit imaging von zebrabärblingentwicklung

A Versatile Mounting Method for Long Term Imaging of Zebrafish Development

Zebrabärbling-Embryonen bieten eine ideale experimentelle System komplexe morphogenetischen Prozesse zu untersuchen aufgrund ihrer leichten Zugänglichkeit und optische Transparenz. Insbesondere ist hintere Körperdehnung ein wesentlicher Prozess in der embryonalen Entwicklung, durch die Verformungen mehrere Gewebe zusammen, um die Bildung eines großen Teils der Körperachse zu lenken handeln. Um diesen Prozess durch langfristige Zeitraffer-Bildgebung zu beobachten, ist es notwendig, eine Montagetechnik zu verwenden, die ausreichende Unterstützung ermöglicht es, Proben in der richtigen Ausrichtung während der Übertragung an das Mikroskop und den Erwerb zu halten. Darüber hinaus muss die Montage bieten auch ausreichende Bewegungsfreiheit für das Auswachsen des hinteren Körperbereich ohne seine normale Entwicklung zu beeinflussen. Schließlich muss ein gewisses Maß an Vielseitigkeit des Montage Methode, um Bildgebung auf verschiedenen Abbildungsaufbauten ermöglichen. Hier präsentieren wir eine Montagetechnik für die Abbildung der Entwicklung des hinteren Körpers Elongation in der Zebrabärbling D. rerio. Diese Technik beinhaltet Embryonen, so dass der Kopf und Dottersack Regionen sind fast vollständig in Agarose enthalten, während das Weglassen der hinteren Körperbereich zu verlängern und zu entwickeln, die normalerweise Montage. Wir werden zeigen , wie sich dies für aufrecht, umgekehrt und vertikale Lichtbogen - Mikroskopie - Set-ups angepasst werden. Während dieses Protokoll Embryonen für die Bildgebung bei der Montage für den hinteren Körper konzentriert, könnte es leicht für die Live-Bildgebung von mehreren Aspekten der Zebrabärblingentwicklung angepasst werden.

Das Protokoll oben skizzierte Details eine vielseitige Technik zur Montage von Genaktivität für die Langzeit Zeitraffer-Bildgebung. Ein Beispiel hierfür ist in 2A und in animierter / Video - 1 gezeigt. Die Embryonen wurden in der 1-Zell-Stadium injiziert mit mRNA, die das Photokonvertierbare fluoreszierendes Protein kikumeGR kodiert. Am 15 Somiten Stadium wurden sie wie oben beschrieben montiert und für 12 h auf einem invertierten konfokalen Mikroskop mi...

Hier präsentieren wir eine vielseitige Einbettungsmethode, die die Langzeit-Zeitraffer-Bildgebung der hinteren Körperentwicklung von lebenden Zebrafischembryonen ermöglicht, ohne die normale Entwicklung zu stören.

Eine vielseitige Montagemethode für Langzeit Imaging von Zebrabärblingentwicklung

Zebrafish embryos offer an ideal experimental system to study complex morphogenetic processes due to their ease of accessibility and optical transparency. ...

Das übergeordnete Ziel dieser Methode besteht darin, Zebrafisch-Embryonen für die Live-Bildgebung so zu montieren, dass ein normales Wachstum der hinteren Körperregion ermöglicht wird. Diese Methode kann an die Bildgebung anderer Bereiche des sich entwickelnden Zebrafischs angepasst werden. Mit dieser Technik lassen sich zentrale Fragen der Entwicklungsbiologie beantworten, beispielsweise wie einzelne Zellverhalten zur Morphogenese auf der Ebene ganzer Gewebe führen.Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie das freie Bewegen des hinteren Körpers ermöglicht, während das Embryo in der korrekten Orientierung bleibt. Geben Sie zunächst Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt in einer Endkonzentration von 1,5 % in E3-Medium in einem 50-Milliliter-Röhrchen hinzu und lösen Sie die Agarose durch Erhitzen in der Mikrowelle auf. Lassen Sie die Lösung in einem Wasserbad oder Inkubator auf der Laborbank auf 42 bis 45 Grad Celsius eintemperieren.Nachdem die Glasnadel gemäß dem Textprotokoll gezogen wurde, brechen Sie mit einer Pinzette die Nadel direkt hinter der Stelle ab, an der sie biegsam ist, um eine saubere und scharfe Nadel zum Ausrichten der Embryonen und zum Entfernen von überschüssigem Agarose zu erhalten. Züchten Sie die Embryonen in E3-Medium bis zum entsprechenden Entwicklungsstadium heran.Danach die Embryonen unter einem binokularen Stereomikroskop mit einem Paar scharfer Pinzetten entchorionieren. Die entchorionierten Embryonen mindestens fünf Minuten in der Tricain-Arbeitslösung inkubieren. Anschließend den entchorionierten Embryo mit einer Glas-Pasteurpipette mit minimalem E3 direkt in die 50-Milliliter-Röhrchen mit 45 Grad Celsius Agarose überführen.Entfernen Sie das Embryo zusammen mit etwa einem Milliliter des Einbettungsagarose und übertragen Sie etwa 100 Mikroliter des Mediums mit dem Embryo in die Mitte einer 10-Millimeter-Mikrokuvette am Boden einer 35-Millimeter-Petrischale mit Glasboden. Während das Einbettungsmedium erstarrt, schieben Sie das Embryo an den Rand des Agarosekreises, wobei der Schwanz nach außen zeigt. Verwenden Sie die Kapillarnadel, um das Embryo so lateral wie möglich auszurichten, um die Entwicklung des hinteren Körpers abbilden zu können.Dann mit der Kapillare das Embryo in der gewünschten seitlichen Orientierung halten, bis das Gel vollständig erstarrt ist. Sobald der Agarose-Tropfen erstarrt ist, verwenden Sie die Tricain-Arbeitslösung, um die Petrischale zu überfluten. Danach stellen Sie unter einem Stereomikroskop mit durchgehender Lichtquelle die Spiegelposition und den Einfallswinkel des Lichts so ein, dass ein starker Kontrast die Schnitte in der Agarose deutlich sichtbar macht.Um den ersten Schnitt durchzuführen, schneiden Sie mit der Kapillarnadel oder dem Mikroskalpell im Sägebewegung auf und ab in den Agarose, benachbart und in der Mitte entlang des Dotters, direkt hinter den sich bildenden Herzbereichen bis zum fünften vorderen Somit, und vollständig durch die Agarose hindurch bis zum Glas. Dabei ist entscheidend, dass das Embryo beim Durchtrennen der Agarose über dem Dottersack nicht beschädigt wird. Führen Sie anschließend den zweiten und dritten Schnitt durch, beginnend an der Embryoseite bis zum Glas, tangential zu den ersten fünf Somiten, wodurch die dorsale Entfaltung des hinteren Körpers ermöglicht wird.Dann, ausgehend vom Schnittpunkt der Schnitte eins und drei, einen langsamen diagonalen Schnitt in Richtung des Endes von Schnitt drei ausführen, während langsam nach oben angehoben wird, um das Agarose-Quadrat um den Hinterleib zu lösen. Mit einer Pinzette die gelösten Agarose-Blöcke aus dem Embryomedium entfernen, wobei die Wand der Petrischale als Stütze dient, während die Agarose-Stücke herausgehoben werden. Vor der Probenaufbringung eine 100 Millimeter große Kunststoffschale mit einer 1 %igen Agarose-Lösung in E3 auf eine Höhe von fünf Millimetern beschichten und aushärten lassen.Danach einen Tropfen mit einem Milliliter Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt in die Mitte der Petrischale geben und ebenfalls erstarren lassen. Die Embryonen wie zuvor in diesem Video gezeigt in die Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt einbetten. Dieses Mal jedoch den Embryo mit einem kleineren Tropfen der Lösung aus dem 50-Milliliter-Röhrchen mit Agarose entnehmen und diesen kleinen Tropfen auf den einen Milliliter großen Tropfen in der Mitte der Schale aufbringen.Verwenden Sie die Kapillarnadel, um den Embryo in der Mitte des kleinen Tropfens zu positionieren, und halten Sie die korrekte Orientierung bei, bis das Gel erstarrt ist. Schließlich überspülen Sie die Petrischale mit der Tricain-Arbeitslösung und entfernen Sie das überschüssige Agarose. Ein Beispiel für einen Zebrafisch-Embryo, der mit mRNA für das photokonvertierbare fluoreszierende Protein kikumeGR injiziert wurde, anschließend im Stadium von 15 Somiten fixiert und 12 Stunden lang einer Zeitrafferaufnahme unterzogen wurde, ist in diesem animierten Video dargestellt.Der hintere Körperbereich kann sich frei bewegen und zeigt ähnliche morphologische Veränderungen wie Embryonen, die unter normalen Kulturbedingungen frei von ihrer Chorion entwickelt werden. In diesem Video wurden Embryonen im Stadium von 16 Zellen mit mRNA injiziert, die für das Histon 2B-RFP codiert, um die Kerne zu markieren, und für CAAX-GFP, um die Zellmembranen zu markieren. Die Aufnahmen wurden an einem aufrechten Mehrphotonen-Mikroskop mit einer 25×-Wasser-Immersionsoptik ab dem Stadium von 10 Somiten über einen Zeitraum von drei Stunden durchgeführt, um das Zellverhalten während der Ausbildung des Schwanzknospen zu visualisieren.Es ist zu erkennen, wie die Zellen aktive Ausstülpungen und gezielte Bewegungen erzeugen, während sich der Schwanzknospen normal ausbildet. Wenn man die Technik einmal beherrscht, kann sie bei korrekter Durchführung innerhalb von 20 Minuten durchgeführt werden. Während des Verfahrens ist es wichtig sicherzustellen, dass das Embryo in einer Seitenlage positioniert ist, während das Agarosegel erstarrt.Andernfalls bewegt sich der interessierende Bereich während der Bildaufnahme schnell außerhalb des Sichtfelds. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein klares Verständnis dafür haben, wie man Zebrafischembryonen zur Live-Bildgebung der posterioren Körperverschiebung präpariert.

a-versatile-mounting-method-for-long-term-imaging-zebrafish

Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Montage Zebrafischembryonen für langfristige Bildgebung, Zwei-Photonen-Imaging-und Gewebe-Schaden Techniken und Zeitraffer-konfokale Bildgebung.

Zwei-Photonen-Axotomie und Zeitraffer-konfokale Bildgebung in lebenden Zebrafisch-Embryonen

Dieser Artikel beschreibt eine Methode zur Montage lebender Zebrafischembryonen für Langzeitbildgebung. Diese Methode ist kostengünstig und einfach durchzuführen mit normalen Mikroskopischalen mit Glasboden für die Bildgebung am inversen Mikroskop. Die Einbettung erfolgt in Schichten von Agarose in unterschiedlichen Konzentrationen.

Layered Agar Mounting: Vorbereitung lebender Zebrafischembryonen für die Langzeitbildgebung mit einem inversen Mikroskop

Dieses Video beschreibt Schritt für Schritt eine Anleitung zum Montieren von lebenden Zebrafischembryonen auf einer 6-Well-Platte mit niedrigschmelziger Agarose. Es bietet auch die Möglichkeit, Bilder von lebenden Embryonen zu erfassen und sie mit Hilfe von Software zu analysieren.

Agar-Einbettung: Eine grundlegende Methode zur Einbettung lebender Zebrafisch-Embryonen für die Langzeitbildgebung

Die Entwicklung von Zebrafisch kann über Tage mit Licht-Mikroskopie Blatt, wenn Embryonen werden in optisch klare Polymerrohren mit niedriger Konzentration Agarose eingebettet folgen.

Multilayer-Halterung für Langzeit-Licht-Mikroskopie Blatt der Zebrafisch

Die Abbildung des dynamischen Verhaltens von Organellen und anderen subzellulären Strukturen in vivo kann Aufschluss über ihre Funktion unter physiologischen und Krankheitsbedingungen geben. Hier stellen wir Methoden vor, mit denen zwei Organellen, Zentrosomen und Mitochondrien, genetisch markiert und ihre Dynamik in lebenden Zebrafischembryonen mittels Weitfeld- und Konfokalmikroskopie abgebildet werden können.

Imaging subzellulärer Strukturen in der Living Zebrafischembryo

Dieses Manuskript beschreibt die zWEDGI (Zebrafisch daraus und verlockende Falle Gerät für Wachstum und Imaging), die ist ein unterteilte Gerät zu orientieren und zurückhalten Zebrafischlarven. Das Design erlaubt Schweif Durchtrennung und langfristige Sammlung von hochauflösender Fluoreszenz-Mikroskopie-Bildern der Wundheilung und Regeneration.

Langfristige Live Imaging-Gerät für verbesserte experimentelle Manipulation von Zebrafischlarven

Dieser Artikel beschreibt eine Methode zur Montage zerbrechlicher Zebrafischembryonen für eine längere konfokale Zeitraffermikroskopie. Diese kostengünstige Methode ist einfach mit normalen Glasbodenmikroskopie-Geschirr für die Bildgebung auf jedem invertierten Mikroskop durchzuführen. Die Montage erfolgt in Agaroseschichten in unterschiedlichen Konzentrationen.

Eine geschichtete Montagemethode für die verlängerte Zeitraffer-Konfokalmikroskopie ganzer Zebrafisch-Embryonen

Dieses Protokoll beschreibt einen Ansatz zur In-toto-Markierung und mehrdimensionalen Bildgebung der frühen Augenentwicklung von Zebrafischen. Wir beschreiben die Markierung, Einbettung und vierdimensionale (4D) Bildgebung mit hilfe der konfokalen Laserscanning-Mikroskopie und Überlegungen zur Optimierung der Erfassung von Datensätzen zur Sezierung von Mechanismen der optischen Cup-Morphogenese.

4-dimensionale Bildgebung der Zebrafisch-Optikbecher-Morphogenese

Dieses Protokoll verwendet Lichtblatt-Bildgebung, um die kontraktile Funktion des Herzens in Zebrafischlarven zu untersuchen und Einblicke in die Herzmechanik durch Zellverfolgung und interaktive Analyse zu gewinnen.

4D-Lichtblatt-Bildgebung der Herzkontraktion von Zebrafischen

Eine Probenvorbereitungsstrategie für die Abbildung früher Zebrafischembryonen in einem intakten Chorion mit einem Lichtblattmikroskop wird beschrieben. Es analysiert die verschiedenen Orientierungen, die Embryonen innerhalb des Chorions in den 70% Epibolie- und Knospenstadien annehmen, und beschreibt bildgebende Strategien, um mit Hilfe des Lichtblattsystems eine zelluläre Auflösung im gesamten Embryo zu erzielen.

Lichtblattmikroskopie: Bildgebung und Montagestrategien für frühe Zebrafischembryonen

Lernen Sie eine vielseitige Montagemethode für Langzeit-Imaging von Zebrabärblingsembryonen. Diese Technik ermöglicht normale Entwicklung und detaillierte Beobachtung zellulärer Verhaltensweisen während der Morphogenese.

Eine vielseitige Montagemethode für Langzeit Imaging von Zebrabärblingentwicklung

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