Eine vielseitige Montagemethode für Langzeit Imaging von Zebrabärblingentwicklung

Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, Zebrafischembryonen für die Live-Bildgebung zu mounten, die das normale Auswachsen der hinteren Körperregion ermöglichen. Diese Methode kann für die Abbildung anderer Regionen des sich entwickelnden Zebrafisches adaptiert werden. Diese Technik hilft, Schlüsselfragen der Entwicklungsbiologie zu beantworten, z. B. wie das Verhalten einzelner Zellen zur Morphogenese auf der Ebene ganzer Gewebe führt.

Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie den freien Moment des Hinterkörpers ermöglicht und gleichzeitig den Embryo in der richtigen Ausrichtung hält. Geben Sie zunächst Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt in einer Endkonzentration von 1,5 % zum E3-Medium in ein 50-Milliliter-Röhrchen und lösen Sie die Agarose durch Erhitzen in der Mikrowelle auf. Lassen Sie die Lösung in einem Wasserbad oder einem Inkubator auf 42 bis 45 Grad Celsius ausgleichen.

Nach dem Ziehen von Glasnadeln gemäß dem Textprotokoll. Brechen Sie die Nadel mit einer Pinzette knapp über den Punkt hinaus, an dem sie sich biegt, um eine saubere und scharfe Nadel zum Ausrichten von Embryonen und zum Entfernen von überschüssiger Agarose zu schaffen. Heben Sie die Embryonen bis zum entsprechenden Stadium in E3-Medium an.

Verwenden Sie dann unter einem binokularen Präpariermikroskop eine scharfe Pinzette, um die Embryonen zu dechorionieren. Inkubieren Sie die dechorionierten Embryonen mindestens fünf Minuten lang in Tricain-Arbeitslösung. Verwenden Sie dann eine Pasteurpipette aus Glas, um den dechorionierten Embryo mit minimalem E3 direkt in das 50-Milliliter-Röhrchen mit 45 Grad Celsius Agarose zu übertragen.

Entnehmen Sie den Embryo zusammen mit etwa einem Milliliter der einlagernden Agarose und übertragen Sie etwa 100 Mikroliter des Mediums mit dem Embryo in die Mitte einer 10 Millimeter großen Mikrovertiefung am Boden einer 35 Millimeter großen Petrischale mit Glasboden. Während das Eindeckmedium aushärtet, bewegen Sie den Embryo mit dem Schwanz nach außen an den Rand des Agarosekreises. Verwenden Sie die Kapillarnadel, um den Embryo so seitlich wie möglich auszurichten, um die Entwicklung des hinteren Körpers abzubilden.

Halten Sie dann den Embryo mit der Kapillare in der gewünschten lateralen Ausrichtung, bis das Gel vollständig ausgehärtet ist. Sobald der Agarosetropfen fest geworden ist, verwenden Sie Tricain-Arbeitslösung, um die Petrischale zu fluten. Stellen Sie dann unter einem Präpariermikroskop mit Durchlichtsockel die Spiegelposition und den Winkel des einfallenden Lichts so ein, dass der starke Kontrast die Schnitte in der Agarose deutlich sichtbar macht.

Um den ersten Schnitt durchzuführen, verwenden Sie die Kapillarnadel oder das Mikroskalpell, um die Agarose in einer sägenden Auf- und Abwärtsbewegung zu schneiden, neben und in der Mitte des Eigelbs, direkt hinter den sich bildenden Herzfeldern den fünften vorderen Somiten hinunter und vollständig durch die Agarose zum Glas. Entscheidend ist hierbei, dass der Embryo beim Schneiden der Agarose über dem Dottersack nicht beschädigt wird. Machen Sie dann den zweiten und dritten Schnitt, beginnend am Embryo bis zum Glas, tangential zu den ersten fünf Somiten, und ermöglichen Sie die dorsale Entfaltung des hinteren Körpers.

Dann, beginnend am Schnittpunkt von Schnitt eins und drei, machen Sie einen langsamen diagonalen Schnitt gegen Ende von Schnitt drei, während Sie sich langsam nach oben heben, um das Quadrat der Agarose, das den hinteren Körper umgibt, zu lösen. Entfernen Sie mit einer scharfen Pinzette die gelösten Agaroseblöcke aus dem Embryomedium, indem Sie die Wand der Petrischale als Stütze verwenden, während Sie die Agarosestücke herausheben. Vor der Probenmontage wird eine 100 Millimeter dicke Kunststoffschale mit 1 % Agarose in E3 auf eine Höhe von fünf Millimetern beschichtet und fest werden gelassen.

Geben Sie dann einen Tropfen von einem Milliliter Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt in die Mitte der Form und lassen Sie es ebenfalls fest werden. Betten Sie die Embryonen in Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt ein, wie weiter oben in diesem Video gezeigt. Nehmen Sie dieses Mal jedoch den Embryo mit einem kleineren Tropfen Lösung aus dem 50-Milliliter-Röhrchen Agarose und legen Sie diesen kleinen Tropfen auf den einen Milliliter-Tropfen in der Mitte der Schale.

Positionieren Sie den Embryo mit der Kapillarnadel in der Mitte des kleinen Tropfens und behalten Sie seine korrekte Ausrichtung bei, bis das Gel fest ist. Zum Schluss verwenden Sie Tricain-Arbeitslösung, um die Schale zu fluten und die überschüssige Agarose zu entfernen. In diesem animierten Video wird ein Beispiel für einen Zebrafischembryo gezeigt, der mit mRNA injiziert wurde, die für das photokonvertierbare fluoreszierende Protein kikumeGR kodiert, dann im 15-Somiten-Stadium montiert und 12 Stunden lang einem Zeitraffer-Imagine unterzogen wurde.

Der hintere Körper kann sich frei bewegen und zeigt ähnliche Veränderungen in der Morphologie wie bei Embryoen, die sich unter normalen Kulturbedingungen frei von ihrem Chorion entwickeln dürfen. In diesem Video wurden Embryonen im 16-Zellstadium mRNA injiziert, die für Histon 2BRFP kodiert, das die Zellkerne markiert, und CAAXGFP, das die Zellmembranen markiert. Die Bilder wurden drei Stunden lang mit einem aufrechten Multiphotonenmikroskop mit einem 25-fachen Wasserimmersionsobjektiv aus dem 10-Somiten-Stadium aufgenommen, um das Zellverhalten während der Schwanzknospenbildung zu visualisieren.

Man kann sehen, wie Zellen aktive Vorsprünge und Richtungsbewegungen erzeugen, während sich die Schwanzknospe normal bildet. Einmal gemeistert, kann diese Technik in 20 Minuten ausgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Bei der Durchführung dieses Eingriffs ist es wichtig sicherzustellen, dass sich der Embryo in einer seitlichen Position befindet, während das Agarose-Gel aushärtet.

Andernfalls bewegt sich der interessierende Bereich während der Bildgebung schnell aus dem Sichtfeld. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein klares Verständnis davon haben, wie man Zebrafischembryonen für die Live-Bildgebung der hinteren Körperdehnung montiert.