Eine vielseitige Montagemethode für Langzeit Imaging von Zebrabärblingentwicklung

Das übergeordnete Ziel dieser Methode besteht darin, Zebrafisch-Embryonen für die Live-Bildgebung so zu montieren, dass ein normales Wachstum der hinteren Körperregion ermöglicht wird. Diese Methode kann an die Bildgebung anderer Bereiche des sich entwickelnden Zebrafischs angepasst werden. Mit dieser Technik lassen sich zentrale Fragen der Entwicklungsbiologie beantworten, beispielsweise wie einzelne Zellverhalten zur Morphogenese auf der Ebene ganzer Gewebe führen.

Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie das freie Bewegen des hinteren Körpers ermöglicht, während das Embryo in der korrekten Orientierung bleibt. Geben Sie zunächst Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt in einer Endkonzentration von 1,5 % in E3-Medium in einem 50-Milliliter-Röhrchen hinzu und lösen Sie die Agarose durch Erhitzen in der Mikrowelle auf. Lassen Sie die Lösung in einem Wasserbad oder Inkubator auf der Laborbank auf 42 bis 45 Grad Celsius eintemperieren.

Nachdem die Glasnadel gemäß dem Textprotokoll gezogen wurde, brechen Sie mit einer Pinzette die Nadel direkt hinter der Stelle ab, an der sie biegsam ist, um eine saubere und scharfe Nadel zum Ausrichten der Embryonen und zum Entfernen von überschüssigem Agarose zu erhalten. Züchten Sie die Embryonen in E3-Medium bis zum entsprechenden Entwicklungsstadium heran.

Danach die Embryonen unter einem binokularen Stereomikroskop mit einem Paar scharfer Pinzetten entchorionieren. Die entchorionierten Embryonen mindestens fünf Minuten in der Tricain-Arbeitslösung inkubieren. Anschließend den entchorionierten Embryo mit einer Glas-Pasteurpipette mit minimalem E3 direkt in die 50-Milliliter-Röhrchen mit 45 Grad Celsius Agarose überführen.

Entfernen Sie das Embryo zusammen mit etwa einem Milliliter des Einbettungsagarose und übertragen Sie etwa 100 Mikroliter des Mediums mit dem Embryo in die Mitte einer 10-Millimeter-Mikrokuvette am Boden einer 35-Millimeter-Petrischale mit Glasboden. Während das Einbettungsmedium erstarrt, schieben Sie das Embryo an den Rand des Agarosekreises, wobei der Schwanz nach außen zeigt. Verwenden Sie die Kapillarnadel, um das Embryo so lateral wie möglich auszurichten, um die Entwicklung des hinteren Körpers abbilden zu können.

Dann mit der Kapillare das Embryo in der gewünschten seitlichen Orientierung halten, bis das Gel vollständig erstarrt ist. Sobald der Agarose-Tropfen erstarrt ist, verwenden Sie die Tricain-Arbeitslösung, um die Petrischale zu überfluten. Danach stellen Sie unter einem Stereomikroskop mit durchgehender Lichtquelle die Spiegelposition und den Einfallswinkel des Lichts so ein, dass ein starker Kontrast die Schnitte in der Agarose deutlich sichtbar macht.

Um den ersten Schnitt durchzuführen, schneiden Sie mit der Kapillarnadel oder dem Mikroskalpell im Sägebewegung auf und ab in den Agarose, benachbart und in der Mitte entlang des Dotters, direkt hinter den sich bildenden Herzbereichen bis zum fünften vorderen Somit, und vollständig durch die Agarose hindurch bis zum Glas. Dabei ist entscheidend, dass das Embryo beim Durchtrennen der Agarose über dem Dottersack nicht beschädigt wird. Führen Sie anschließend den zweiten und dritten Schnitt durch, beginnend an der Embryoseite bis zum Glas, tangential zu den ersten fünf Somiten, wodurch die dorsale Entfaltung des hinteren Körpers ermöglicht wird.

Dann, ausgehend vom Schnittpunkt der Schnitte eins und drei, einen langsamen diagonalen Schnitt in Richtung des Endes von Schnitt drei ausführen, während langsam nach oben angehoben wird, um das Agarose-Quadrat um den Hinterleib zu lösen. Mit einer Pinzette die gelösten Agarose-Blöcke aus dem Embryomedium entfernen, wobei die Wand der Petrischale als Stütze dient, während die Agarose-Stücke herausgehoben werden. Vor der Probenaufbringung eine 100 Millimeter große Kunststoffschale mit einer 1 %igen Agarose-Lösung in E3 auf eine Höhe von fünf Millimetern beschichten und aushärten lassen.

Danach einen Tropfen mit einem Milliliter Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt in die Mitte der Petrischale geben und ebenfalls erstarren lassen. Die Embryonen wie zuvor in diesem Video gezeigt in die Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt einbetten. Dieses Mal jedoch den Embryo mit einem kleineren Tropfen der Lösung aus dem 50-Milliliter-Röhrchen mit Agarose entnehmen und diesen kleinen Tropfen auf den einen Milliliter großen Tropfen in der Mitte der Schale aufbringen.

Verwenden Sie die Kapillarnadel, um den Embryo in der Mitte des kleinen Tropfens zu positionieren, und halten Sie die korrekte Orientierung bei, bis das Gel erstarrt ist. Schließlich überspülen Sie die Petrischale mit der Tricain-Arbeitslösung und entfernen Sie das überschüssige Agarose. Ein Beispiel für einen Zebrafisch-Embryo, der mit mRNA für das photokonvertierbare fluoreszierende Protein kikumeGR injiziert wurde, anschließend im Stadium von 15 Somiten fixiert und 12 Stunden lang einer Zeitrafferaufnahme unterzogen wurde, ist in diesem animierten Video dargestellt.

Der hintere Körperbereich kann sich frei bewegen und zeigt ähnliche morphologische Veränderungen wie Embryonen, die unter normalen Kulturbedingungen frei von ihrer Chorion entwickelt werden. In diesem Video wurden Embryonen im Stadium von 16 Zellen mit mRNA injiziert, die für das Histon 2B-RFP codiert, um die Kerne zu markieren, und für CAAX-GFP, um die Zellmembranen zu markieren. Die Aufnahmen wurden an einem aufrechten Mehrphotonen-Mikroskop mit einer 25×-Wasser-Immersionsoptik ab dem Stadium von 10 Somiten über einen Zeitraum von drei Stunden durchgeführt, um das Zellverhalten während der Ausbildung des Schwanzknospen zu visualisieren.

Es ist zu erkennen, wie die Zellen aktive Ausstülpungen und gezielte Bewegungen erzeugen, während sich der Schwanzknospen normal ausbildet. Wenn man die Technik einmal beherrscht, kann sie bei korrekter Durchführung innerhalb von 20 Minuten durchgeführt werden. Während des Verfahrens ist es wichtig sicherzustellen, dass das Embryo in einer Seitenlage positioniert ist, während das Agarosegel erstarrt.

Andernfalls bewegt sich der interessierende Bereich während der Bildaufnahme schnell außerhalb des Sichtfelds. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein klares Verständnis dafür haben, wie man Zebrafischembryonen zur Live-Bildgebung der posterioren Körperverschiebung präpariert.