Zebrafisch Gehirn Ventrikel Injection

Dieses Verfahren beginnt mit der Stadienvorbereitung von Zebrafischembryonen. Wenn die Embryonen das interessierende Stadium erreicht haben, nehmen Sie sie aus dem Corion. Als nächstes werden Löcher in einer mit Aros beschichteten Schale mit einer Pipettenspitze zum Einsetzen der Embryonen geschaffen und die Embryonen werden vorsichtig mit dem Schwanz nach unten in die Löcher gelegt.

Nachdem die Embryonen montiert wurden, wird ein fluoreszierender Stempel vorsichtig durch das Hinterhirn in den Ventrikelraum des Embryos injiziert. Nach der Ventrikelinjektion werden die Embryonen abgebildet und die Daten mit Photoshop verarbeitet. Hallo, ich bin Jennifer Gutman aus dem Labor von Dr. Hazel Sieve am Whitehead Institute for Biomedical Research am MIT in Cambridge, Massachusetts.

Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Injektion von Zebrafisch-Hirnventrikeln. Wir verwenden dieses Verfahren in unserem Labor, um die Bildung von Hirnventrikeln und die neuroepitheliale Morphogenese in lebenden Zebrafischen zu untersuchen. Aufgrund der Beschaffenheit transparenter Zebrafischembryonen kann es schwierig sein, die Form des Hirnventrikels zu charakterisieren.

Diese Technik ist eine nützliche und einfache Methode, um den mit Flüssigkeit gefüllten Raum vom umgebenden Gewebe zu unterscheiden und mutierte Embryonen zu charakterisieren, die möglicherweise Defekte bei der Bildung von Hirnventrikeln aufweisen. Also lasst uns loslegen. Um uns auf die Injektion des Zebrafisch-Hirnventrikels vorzubereiten, beginnen wir mit der Herstellung der Injektionsnadeln.

Die polare Nadel eines Sutter-Instruments wird verwendet, um die Kapillarnadeln zu ziehen. Die Kapillarnadel wird dann mit einem fluoreszierenden Farbstoff, wie z. B. Texas Red Dextrin, gefüllt. Als nächstes wird die gefüllte Nadel in einem Mikromanipulator in einer Mikroinjektionsvorrichtung montiert.

Schneide die Nadel schräg auf die passende Größe zu. Um eine abgeschrägte Spitze zu erzeugen, messen Sie die Tropfengröße der Nadel und überprüfen Sie, ob sie zwischen einem und zwei Nanolitern pro Injektion in Öl liegt. Um diese Verfahrensphase zu beginnen, sollten die Embryonen, laut Kimmel, bei allen Embryonen 30 Minuten früher als das interessierende Stadium injiziert werden.

Um beispielsweise die Ventrikel 24 Stunden nach der Befruchtung zu untersuchen, injizieren Sie die Embryonen 23,5 Stunden nach der Befruchtung. Der Embryo im interessierenden Stadium wird unter das Stereomikroskop gelegt, und die Corion wird vorsichtig mit einer Pinzette aus dem Embryo entfernt. Als nächstes wird eine Arous-Schale für die Embryonen hergestellt, wobei eine Kunststoffschale mit 1%Aros-Einstichlöchern in den Aros-Löchern mit einer Kunststoff-Pipettenspitze von einem bis 200 Mikrolitern beschichtet ist.

Entfernen Sie die aros Plugs vorsichtig mit einer Pinzette aus den Löchern. Übertragen Sie den Embryo und das Embryomedium in die mit Löchern versehene Arous-Schale. Fügen Sie dem Medium Trica hinzu, um den Embryo zu betäuben und Bewegungen zu verhindern.

Während des Experiments legen Sie den Schwanz des Embryos vorsichtig nach unten in das Loch und richten Sie ihn so aus, dass sich der Injektionsapparat auf der hinteren Seite des Embryos befindet. Jetzt, da der Embryo in der aufgegangenen Schale platziert und richtig ausgerichtet ist, sind wir bereit für die Injektion in die Hirnventrikel. Ordnen Sie zunächst das Mikromanipulations-Setup so an, dass sich die Nadelspitze im gleichen Sichtfeld befindet wie der Embryo mit hoher Leistung.

Führen Sie die Nadel vorsichtig durch die dünne Dachplatte des Hinterhirns direkt hinter dem R null R einen Scharnierpunkt, ohne das darunter liegende Hirngewebe zu treffen, injizieren Sie gerade so viel Farbstoff, dass die Ventrikel vollständig gefüllt sind. Je nach Stadium des Embryos können mehrere Injektionen erforderlich sein, um den Ventrikelraum zu füllen. Wenn der Embryo injiziert wurde und für die Bildgebung bereit ist, wird eine neue Arous-Schale für den Embryo vorbereitet.

Stechen Sie mit einer sauberen, mit 1%aros beschichteten Schale Löcher in die Schale und entfernen Sie die Stecker. Übertragen Sie den Embryo in die Schale und fügen Sie Trica hinzu, um den Embryo zu betäuben und Bewegungen zu verhindern. Platzieren Sie den Schwanz des injizierten Embryos in dem Loch in Position, um ein dorsales Bild zu erhalten.

Der Embryo ist nun bereit für die Bildgebung. Nehmen Sie ein Bild mit Durchlicht auf. Es ist sehr wichtig, den Embryo oder das Mikroskop nicht zu bewegen.

Ändern Sie als Nächstes die Einstellungen am Mikroskop und nehmen Sie ein Bild mit Fluoreszenzlicht auf. Positionieren Sie den Embryo neu, um laterale Bilder sowohl mit Durchlicht als auch mit Fluoreszenzlicht aufzunehmen. Speichern Sie alle Bilder als Dateien für die Bildbearbeitung in Photoshop.

Um die Bilder in Photoshop zu bearbeiten, öffnen Sie die Durchlicht- und Fluoreszenzlichtbilder desselben Embryos, die in derselben Position aufgenommen wurden. Vergewissern Sie sich, dass alle Einstellungen identisch sind. Ziehen Sie für jedes Bild das fluoreszierende Bild auf das Durchlichtbild und richten Sie es genau mit dem ausgewählten fluoreszierenden Bild aus. Wählen Sie Bildanpassungen aus, ersetzen Sie die Farbe und ändern Sie den schwarzen Hintergrund in Weiß.

Passen Sie im Fenster "Farbe ersetzen" den Unschärfefaktor nach rechts an, bis das fluoreszierende Bild farblich einheitlich aussieht. Wählen Sie im Ebenenfenster die Option Multiplizieren aus. Um die Overlay-Bilder anzuzeigen, sollte Ihr Ventrikelraumbild mit dem Durchlichtbild übereinstimmen. Genau.

Speichern Sie diese Datei und wiederholen Sie den Vorgang für alle anderen Bilder. Wenn die Ventrikelinjektion korrekt durchgeführt wird, sollten die Bilder scharfe Kanten in nicht-diffusem Farbstoff aufweisen, wie hier in diesen Bildern von 25 Stunden gezeigt. Nach der Befruchtung, während Typ-Embryonen Panel A das Hellfeldbild zeigt, Panel B das Fluoreszenzbild und Panel C das Overlay-Bild.

Eine Seitenansicht des Overlay-Bildes ist in Panel D zu sehen.Wird die Nadel hingegen bei der Ventrikelinjektion zu weit eingeführt, dringt sie unterhalb des Ventrikelraums in das Hirngewebe ein und führt zu einer falschen Injektion. Dies führt zu einem Farbstoff, der außerhalb des Ventrikelraums und im Eigelb sichtbar ist, wie hier gezeigt. Panel E zeigt das Hellfeldbild.

Bedienfeld F zeigt das Fluoreszenzbild und Bedienfeld G zeigt das überlagerte Bild. Eine Seitenansicht des überlagerten Bildes ist in Feld H zu sehen.Die Pfeile zeigen Regionen an, in denen der Farbstoff über den Hirnventrikelraum hinaus gegangen ist. In diesem Video haben wir gezeigt, wie man Fluoreszenzfarbstoff in sich entwickelnde Zebrafisch-Hirnventrikel injizieren kann.

Diese Methode wird verwendet, um den Ventrikelraum des Gehirns im Gegensatz zum umgebenden Neuroepithel sichtbar zu machen, und ist äußerst nützlich, um die Form des Ventrikelraums sowie die Form des umgebenden Hirngewebes zu bestimmen. Diese Technik ermöglicht es uns, den Prozess der Bildung von Hirnventrikeln und der Morphogenese des Gehirns im Laufe der Zeit im lebenden Embryo besser zu verstehen. Es ist ein hervorragendes Werkzeug für die Untersuchung von Defekten bei der Bildung von Hirnventrikeln und für die erste Charakterisierung von Morphogenese-Mutanten des Gehirns.

Das war's also. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.