Name: Zebrafisch Gehirn Ventrikel Injection (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-04-06T00:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 28 s
Description: Lernen Sie die Ventrikelinjektionstechnik bei Zebrafisch-Embryonen zur Visualisierung embryonaler Hirnventrikel. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung neuroepithelialer Morphogenese und Flüssigkeitsdynamik in lebenden Embryonen.

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Die Autoren bedanken sich bei Laura Anne Lowery, der diese Technik im Labor entwickelt danken. HS wird durch NIHMH70926 unterstützt. Jennifer Gutzman wurde von der CSBI / Merck Postdoc-Stipendium unterstützt.

Protokoll Teil 1: Vorbereitung für die Mikroinjektion <ol><li> Bereiten Sie für die Injektion durch Ziehen Kapillare Nadeln mit Sutter Instruments Nadel Abzieher. </li><li> Füllen Sie die Nadel mit einem Fluoreszenzfarbstoff (z. B. Texas-Red Dextran). </li><li> Montieren Sie die Nadel in einem Mikromanipulator und Mikroinjektion Apparat. </li><li> Schneiden Sie die Nadel auf die entsprechende Größe in einem Winkel zu einer abgeschrägten Spitze zu schaffen. </li><li> Messen Sie die Tropfengröße und überprüfen, ob es zwischen 1-2nl pro Injektion ist in Öl. </li></ol> Teil 2: Vorbereitung der Embryonen <ol><li> Spritzen Sie die Embryonen 30 Minuten früher als die Bühne des Interesses. Zum Beispiel, um die Ventrikel 24 Stunden nach der Befruchtung (HPF)-Studie, spritzen die Embryonen auf 23,5 hpf. Stufe die Embryonen nach Kimmel et al. (4). </li><li> Unter dem Stereomikroskop, entfernen Sie vorsichtig das Chorion von Embryonen mit einer Pinzette. </li><li> Mit einer Plastikschale mit 1% Agarose beschichtet, Löcher in die Agarose mit einem Kunststoff 1-200 ul Pipettenspitze. Entfernen Sie vorsichtig das Agarose-Plugs aus den Löchern mit einer Pinzette. </li><li> Übertragen Sie die Embryonen in Embryo Medien in die Agarose Schüssel mit Löchern. </li><li> Add Tricaine (hergestellt nach Westerfield (5)) an die Medien zu betäuben die Embryonen und verhindern, dass Bewegung während des Experiments. </li><li> Sanft statt der Embryo Schwanz in das Loch, und richten Sie ihn so, dass die Einspritzvorrichtung auf der hinteren Seite des Embryos ist. </li></ol> Teil 3: Injektion des Gehirns Ventrikel <ol><li> Um das Gehirn zu injizieren Ventrikel, ordnen Sie die Mikromanipulation Setup, so dass die Nadelspitze in der gleichen Sichtfeld wie der Embryo bei hoher Leistung ist. </li><li> Vorsichtig setzte die Nadel durch die dünne roofplate der Hinterhirn unmittelbar hinter der R0/R1 hingepoint, ohne auf das Hirngewebe unten. </li><li> Inject gerade genug Farbstoff vollständig zu füllen den Herzkammern. Es kann mehrere Injektionen an den Ventrikel Raum zu füllen, je nach Stadium des Embryos. </li></ol> Teil 4: Imaging <ol><li> Mit einem sauberen 1% Agarose-beschichteten Schale, poke neue Löcher in die Schale, entfernen Sie den Stecker, und fügen Sie Tricaine, die Embryonen zu betäuben und zu verhindern, Bewegung. </li><li> Setzen Sie den Schwanz des Ventrikels injiziert Embryo in das Loch und die Position für einen dorsalen Bild. </li><li> Nehmen Sie ein Bild mit Durchlicht. </li><li> Es ist sehr wichtig, nicht bewegen Embryo oder Mikroskop. </li><li> Ändern Sie die Einstellungen am Mikroskop und nehmen Sie ein Bild mit fluoreszierendem Licht. </li><li> Positionieren Sie den Embryo seitlichen Bilder sowohl mit Durchlicht und Fluoreszenzlicht zu nehmen. </li><li> Speichern Sie die Bilder als TIFF-Dateien für die Bildverarbeitung in Photoshop. </li></ol> Teil 5: Image Processing <ol><li> Zur Bearbeitung der Bilder in Photoshop, öffnen Sie den Durchlicht und Fluoreszenzlicht Bilder des gleichen Embryos in die gleiche Position eingenommen. Seien Sie sicher, dass alle Einstellungen sind die gleichen für jedes Bild. </li><li> Ziehen Sie Ihre fluoreszierenden Bild auf den Durchlicht Bild-und Line sie auf genau. </li><li> Mit den fluoreszierenden Bild ausgewählt, wählen Sie &quot;Bild&quot;, &quot;Einstellungen&quot; und dann &quot;Farbe ersetzen&quot; und ändern Sie den schwarzen Hintergrund auf Weiß. </li><li> In der &quot;Farbe ersetzen&quot;-Fenster stellen Sie die &quot;Unschärfe&quot;-Faktor nach rechts, bis das fluoreszierende Bilder sieht einheitlich in der Farbe. </li><li> In der &quot;Layers&quot; Fenster, wählen Sie &quot;Multiply&quot;, um den Overlay-Bilder zu sehen. Ihre Herzkammer Raum-Bild sollte die Durchlicht Bild exakt übereinstimmen. </li><li> Speichern Sie diese Datei, und wiederholen Sie für alle anderen Bilder. </li></ol> Repräsentative Ergebnisse / Outcome Proper Ventrikel Injektion Bilder sind in Abbildung 1 Platten AD gezeigt, während ein Beispiel für falsche Injektion Bilder in EH gezeigt. Proper-Injektionen haben scharfe Kanten und nicht-diffuse Farbstoff. Falsche Injektion, die, wenn die Nadel zu weit in den Ventrikel eingeführt und trifft das Hirngewebe unten auftritt, kann der Farbstoff sichtbar außerhalb des Ventrikels Platz und in den Dotter führen. <img src="/files/ftp_upload/1218/1218figure1.png" alt="Abbildung 1" width="600" height="742" /> Abbildung 1. Ventrikel Injektionen von 25 hpf Wildtyp Embryonen. (AD) Korrigieren Injektionsverfahren und (EH) falsche Injektionsverfahren sind als Beispiele gezeigt. (A, E) Dorsale Hellfeld Bilder mit entsprechenden fluoreszierenden Bildern (B, F) und die Überlagerung der Fluoreszenz-und Hellfeld Bilder (C, G) sowohl für richtige und falsche Injektion Methoden gezeigt. Die Pfeile zeigen die Regionen, in denen Farbstoff über das Gehirn Ventrikels Platz aufgrund einer falschen Ventrikel-Injektion (siehe &quot;Fehlersuche&quot;) gegangen ist. Anterior ist links in allen Bildern. Fehlerbehebung: <table border="1"><tbody><tr style="font-weight:bold; font-size:16px;"><td> Problem </td&gt; <td> Ursache </td><td> Abhilfe </td></tr><tr><td> Sie sind Quetschen der Embryo mit der Nadel. </td><td> Ihre Nadel ist zu stumpf oder die Spitze ist zu groß. </td><td> Beginnen Sie mit einer neuen Nadel und brechen nicht so weit zurück. Bevel Ihre Nadel zu machen, scharf wie eine Injektionsnadel. </td></tr><tr><td> Der Farbstoff wird in den Embryo und das Eigelb (siehe Abb. 1E-H). </td><td> Ihre Nadel ging durch das Gewebe und nicht in den Ventrikel Raum zu bleiben. </td><td> Ihre Nadel kann nicht scharf genug, so dass Sie nicht in der Lage, die Geschwindigkeit der Punktion zu kontrollieren. </td></tr><tr><td> Der Farbstoff ist zu schwach oder nicht im Vorderhirn. </td><td> Sie setzen nicht hoch genug Druck für die Einspritzung oder Ihre Nadel war nicht weit genug anterior des Vorderhirns zu erreichen, wenn man den Farbstoff injiziert. </td><td> Steigern Sie Ihre Einspritzdruck oder platzieren Sie Ihre Nadel etwas mehr ventral während der Injektion. Sie können die Nadel durch das Mittelhirn-Hinterhirn-Grenze gesetzt, wenn mehr Details im Vorderhirn erforderlich ist. Sie können auch einfach noch ein bisschen warten für den Farbstoff weiter zu verbreiten, bevor Bildgebung. </td></tr><tr><td> Ihre Fluoreszenz-Bilder sind zu dunkel an den Rändern nach der Farbe Ersatz in Photoshop. </td><td> Sie haben vergessen, die &quot;Unschärfe&quot;-Einstellung in der Farbe zu ersetzen Fensters zu ändern. </td><td> Bewegen Sie die &quot;Unschärfe&quot; den ganzen Weg nach rechts in die Farbe zu ersetzen Fenster. </td></tr><tr><td> Die Nadel wird keine Löcher in die Hinterhirn roofplate. </td><td> Ihre Nadel wird nicht geschnitten richtig. </td><td> Machen Sie eine neue Nadel. Wenn Sie dabei eine Menge von Injektionen müssen Sie unter Umständen mehrere Nadeln, wie sie bekommen können langweilig. </td></tr></tbody></table>

<ol><li>Gutzman, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+the+zebrafish+midbrain-hindbrain+boundary+constriction+requires+laminin-dependent+basal+constriction%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Dev%22%5BJournal%5D)">Formation of the zebrafish midbrain-hindbrain boundary constriction requires laminin-dependent basal constriction.</a> Mech. Dev. 125, 974-983 (2008).</li>
<li>Lowery, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+Classification+of+Zebrafish+Brain+Morphology+Mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Anat.+Rec.+%28Hoboken%29%22%5BJournal%5D)">Characterization and Classification of Zebrafish Brain Morphology Mutants.</a> Anat. Rec. (Hoboken). 292, 94-106 (2009).</li>
<li>Lowery, L. A., Sive, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initial+formation+of+zebrafish+brain+ventricles+occurs+independently+of+circulation+and+requires+the+nagie+oko+and+snakehead%2Fatp1a1a.1+gene+products%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Initial formation of zebrafish brain ventricles occurs independently of circulation and requires the nagie oko and snakehead/atp1a1a.1 gene products.</a> Development. 132, 2057-2067 (2005).</li>
<li>Kimmel, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev. Dyn. 203, 253-310 (1995).</li>
<li>Westerfield, M. The Zebrafish Book: A guide for the laboratory use of zebrafish. , University of Oregon Press. (1995).</li>
</ol>

In diesem Video zeigen wir, wie man Fluoreszenzfarbstoff (Texas-Red Dextran) in die Entwicklung Zebrafisch Hirnventrikel zu injizieren. Diese Methode wird verwendet, um das Gehirn Ventrikels Raum im Gegensatz zu den umliegenden Neuroepithel visualisieren und ist äußerst nützlich für die Bestimmung der Form der Ventrikel Raum sowie die Form des umgebenden Hirngewebes. Es ermöglicht uns, besser zu verstehen, den Prozess des Gehirns Ventrikel Bildung und Gehirn Morphogenese im Laufe der Zeit in der Live-Embryo. Diese Techn...

<table><tbody><tr><td>Pinzette</td><td>Werkzeug</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>Kapillarrohre (Nadeln)</td><td>Werkzeuge</td><td>Frederick Haer and Co.</td><td>30-30-1</td><td></td></tr><tr><td>Agarose-beschichtete Schalen</td><td>Werkzeuge</td><td>Agarose (Seakem GTG; Lonza) Schalen (Corning)</td><td>Agarose (50027) Schalen (430166)</td><td>Die Agaroseschicht sollte je nach Entwicklungsstadium des Embryos, den Sie injizieren, etwa 2–3 mm dick sein.</td></tr><tr><td>Binokulares Mikroskop</td><td>Mikroskop</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskopkamera mit Fluoreszenzfunktion und Bildaufnahmesoftware</td><td>Werkzeuge</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1–200 &amp;mu; Pipettenspitzen</td><td>Werkzeuge</td><td>USA Scientific, Inc.</td><td>1111-0806</td><td>Sie sind die ideale Größe, um Löcher in die Agarose zu stechen, sodass die Embryonen perfekt hineinpassen.</td></tr><tr><td>Photoshop</td><td>Bildanalyse</td><td>Adobe</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Embryoschleife</td><td>Werkzeuge</td><td></td><td></td><td>Stellen Sie diese selbst aus einer Glaspipette sowie Haar- oder Angelschnur her und versiegeln Sie sie mit Bienenwachs.</td></tr><tr><td>Mikroinjektor</td><td>Werkzeuge</td><td>Harvard Apparatus</td><td>PL1-100</td><td></td></tr><tr><td>Nadelziehgerät</td><td>Werkzeuge</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td></td><td>Einstellungen (Hitze 785, Zug 70, Geschwindigkeit 40, Zeit 70).</td></tr><tr><td>Mikromanipulator</td><td>Werkzeuge</td><td>Narishige International</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluoreszenzfarbstoff Texas-Red-Dextran 70.000 MW</td><td>Reagenz</td><td>Molecular Probes, Life Technologies</td><td>D1830</td><td>Gegebenenfalls sind auch andere Molekulargewichte erhältlich.</td></tr><tr><td>Tricain (3-Aminobenzoesäureethylester)</td><td>Reagenz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-5040</td><td></td></tr><tr><td>Embryomedium</td><td>Reagenz</td><td></td><td></td><td>Gemäß Westerfield (5)</td></tr></tbody></table>

zebrafisch gehirn ventrikel injection

Zebrafish Brain Ventricle Injection

Proper Gehirn Ventrikels Bildung während der embryonalen Entwicklung des Gehirns ist für die normale Funktion des Gehirns benötigt. Hirnventrikel sind die hochkonservierten Hohlräume im Gehirn, die mit Liquor gefüllt sind. In Zebrafisch, nachdem Neuralrohr Bildung erfährt der Neuroepithel eine Reihe von Einschnürungen und Falten, während sie mit Flüssigkeit führt Gehirn Ventrikels Bildung füllt. Um den Prozess der Ventrikel Bildung und der neuro-Form verändert, dass zur gleichen Zeit auftreten zu verstehen, brauchen wir einen Weg, um den Ventrikel Raum im Vergleich zu den Hirngewebe zu visualisieren. Allerdings macht die Natur transparent Zebrafischembryonen es schwierig, das Gewebe aus der Herzkammer Raum zu unterscheiden. Deshalb entwickelten wir ein Gehirn Ventrikels Injektionstechnik, wo die Ventrikel Raum mit einem Fluoreszenzfarbstoff gefüllt und bebildert von Hellfeld-und Fluoreszenz-Mikroskopie. Die Hellfeld und Fluoreszenz-Bilder werden dann bearbeitet und überlagert in Photoshop. Diese Technik ermöglicht eine Visualisierung der Ventrikel Raum mit dem Fluoreszenzfarbstoff, im Vergleich zu der Form des Neuroepithel im Hellfeld Bild. Gehirn-Ventrikel Injektion in Zebrafisch kann von 18 Stunden nach der Befruchtung durch frühe Larvenstadien eingesetzt werden. Wir haben diese Technik ausgiebig in unseren Studien des Gehirns Ventrikel Bildung und Morphogenese sowie bei der Charakterisierung von Hirn-Morphogenese-Mutanten (1-3) verwendet.

Nach Neuralrohr Bildung, verengt die Neuroepithel und Falten, während der Schlauch füllt sich mit embryonalen Liquor (eCSF), um die embryonale Hirnventrikel bilden. Wir haben dieses Ventrikels Injektionstechnik zur besseren Visualisierung der Flüssigkeit gefüllten Raum im Gegensatz zu den neuro-Form in einer Live-Embryo.

Zebrafisch Gehirn Ventrikel Injection

Eine ordnungsgemäße Bildung der Hirnventrikel während der embryonalen Hirnentwicklung ist für eine normale Gehirnfunktion erforderlich. Die Hirnventrikel sind die hochkonservierten ...

Dieses Verfahren beginnt mit der Stadieneinteilung von Zebrafischembryonen. Wenn die Embryonen das gewünschte Entwicklungsstadium erreicht haben, entfernen Sie sie aus der Corion. Anschließend werden mit einer Pipettenspitze Löcher in eine aros-beschichtete Schale gestochen, um die Embryonen darin zu positionieren, und die Embryonen werden vorsichtig mit dem Schwanz nach unten in die Löcher eingesetzt.Nachdem die Embryonen montiert wurden, wird ein fluoreszierender Farbstoff vorsichtig durch das Hinterhirn in den Ventrikelraum des Embryos injiziert. Nach der Ventrikelinjektion werden die Embryonen abgebildet und die Daten mithilfe von Photoshop verarbeitet. Hallo, ich bin Jennifer Gutman aus dem Labor von Dr. Hazel Sieve am Whitehead Institute for Biomedical Research am MIT in Cambridge, Massachusetts.Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Injektion in die Gehirnventrikel von Zebrafischen. In unserem Labor verwenden wir dieses Verfahren, um die Bildung der Gehirnventrikel und die morphogenetische Entwicklung des neuroepithelialen Gewebes in lebenden Zebrafischen zu untersuchen. Aufgrund der Transparenz der Zebrafischembryonen kann die Charakterisierung der Form der Gehirnventrike

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

In diesem Video zeigen wir eine Methode, mit der sich entwickelnden Gehirn Wirbeltiere in Live Zebrafischembryonen bei einzelnen Zelle Auflösung durch konfokale Mikroskopie zu analysieren. Dazu gehört auch die Methode, mit der wir spritzen die Single-Cell-Zebrafischembryo und anschließend montieren und Bild das sich entwickelnde Gehirn.

Live-Imaging der Zebrafisch embryonalen Gehirn durch konfokale Mikroskopie

Wir präsentieren eine Methode zur Liquor (CSF) zu sammeln und ein System, das CSF fehlt im embryonalen Zebrafischgehirn ventrikuläre System zu erstellen. Dies ermöglicht eine weitere Untersuchung der CSF Zusammensetzung und seine Forderung während der embryonalen Entwicklung des Gehirns.

Manuelle Drainage der Zebrafisch Embryonale Hirnkammern

Dieses Video beschreibt die in vivo Elektroporation, eine Technik zur DNA-Abgabe in Ependymogliazellen bei erwachsenen Zebrafischen.

im lebenden Organismus Elektroporation: Eine ortsspezifische Methode zur Transfektion von Zebrafischen

Dieses Video beschreibt die Technik der Mikrodissektion des Gehirns eines erwachsenen Zebrafisches. Diese Methode hilft dabei, aus dem gesamten Gehirn gewonnene Neuorosphären zu erhalten, die weiter untersucht werden können.

Zebrafisch-Hirndissektion: Eine Technik der Fisch-Neurobiologie

Das Video zeigt die Mikroinjektion von Lipopolysacchariden (LPS) in das Gehirn von Zebrafischlarven, um Neuroinflammation zu induzieren. Die Larven werden auf eine mit Agarose ausgekleidete Schale gelegt, die Nadel wird in die Hirnventrikel eingeführt und das LPS injiziert. Das injizierte LPS löst eine Immunantwort aus, die zu Neuroinflammation führt.

Induktion von Neuroinflammation bei Zebrafischlarven mit einer Lipopolysaccharid-Injektion

Dieses Video zeigt das Verfahren zur Injektion monomerer Amyloid-Peptide in das Vorderhirn von erwachsenen Zebrafischen, um Amyloid-Toxizität zu erzeugen, die die neuronalen Schäden nachahmt, die bei der Alzheimer-Krankheit beobachtet...

Etablierung eines Alzheimer-Modells im Gehirn von Zebrafischen durch Amyloid-Peptid-Injektion

In diesem Artikel zeigen wir ein Verfahren zur Manipulation der Genexpression in den Zellen des ventrikulären erwachsenen Zebrafisch telencephalon Verwendung von Antisense-Morpholino-Oligonukleotide. Wir präsentieren diese Methode als eine effiziente und schnelle Protokoll, das für funktionelle Studien in der erwachsenen Gehirn von Wirbeltieren eingesetzt werden können.

Mikromanipulation der Genexpression in der Erotik-Zebrafischgehirn Mit cerebroventricular Mikroinjektion von Morpholino Oligonukleotiden

Imaging von zerebrovaskulären Entwicklung in Zebrafisch-Larven beschrieben. Techniken zur 3D-Bildgebung zu erleichtern und zu ändern zerebrovaskuläre Entwicklung mit chemischen Behandlungen sind ebenfalls vorhanden.

Imaging und 3D-Rekonstruktion der zerebrovaskuläre Strukturen in embryonalen Zebrafisch

Diese Methode basiert auf der Injektion von 0,5 − 3 μL der Lösung in den Thorax von erwachsenen Zebrafischen. Das Verfahren liefert Proteine und chemische Verbindungen effizient in die Nähe des Zebrafisch-Herzens, ohne das Organ zu beschädigen. Der Ansatz eignet sich für die Untersuchung von Wirkungen exogener Faktoren auf verschiedene Gewebe des Herzens.

Intrathorakische Injektion für die Erforschung des erwachsenen Zebrafischherz

Das vorliegende Protokoll beschreibt die intrazerebroventrikuläre (ICV) Injektion von adulten Zebrafischen mit neurotoxischem 6-Hydroxydopamin (6-OHDA) am ventralen Zwischenhirn (Dn) und die Beurteilung der Beeinträchtigung und anschließenden Wiederherstellung der Nachbehandlung des Schwimmverhaltens unter Verwendung des offenen Tanktests, der von einer Analyse mit einer Video-Tracking-Software begleitet wird.

Lokomotorische Bewertung des 6-Hydroxydopamin-induzierten adulten Zebrafisch-basierten Parkinson-Modells

Dieses Protokoll demonstriert die Mikroinjektion von Lipopolysaccharid in die ventrikuläre Hirnregion in einem Zebrafisch-Larvenmodell, um die resultierende neuroinflammatorische Reaktion und Neurotoxizität zu untersuchen.

Hirnventrikuläre Mikroinjektionen von Lipopolysaccharid in Zebrafischlarven zur Beurteilung von Neuroinflammation und Neurotoxizität

Lernen Sie die Ventrikelinjektionstechnik bei Zebrafisch-Embryonen zur Visualisierung embryonaler Hirnventrikel. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung neuroepithelialer Morphogenese und Flüssigkeitsdynamik in lebenden Embryonen.

Zebrafisch Gehirn Ventrikel Injection

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