Zebrafisch Gehirn Ventrikel Injection

Dieses Verfahren beginnt mit der Stadieneinteilung von Zebrafischembryonen. Wenn die Embryonen das gewünschte Entwicklungsstadium erreicht haben, entfernen Sie sie aus der Corion. Anschließend werden mit einer Pipettenspitze Löcher in eine aros-beschichtete Schale gestochen, um die Embryonen darin zu positionieren, und die Embryonen werden vorsichtig mit dem Schwanz nach unten in die Löcher eingebracht.

Nachdem die Embryonen montiert wurden, wird ein fluoreszierender Farbstoff vorsichtig durch das Hinterhirn in den Ventrikelspalt des Embryos injiziert. Nach der Ventrikelinjektion werden die Embryonen abgebildet und die Daten mithilfe von Photoshop verarbeitet. Hallo, ich bin Jennifer Gutman aus dem Labor von Dr. Hazel Sieve am Whitehead Institute for Biomedical Research am MIT in Cambridge, Massachusetts.

Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Injektion in die Gehirnventrikel von Zebrafischen. In unserem Labor verwenden wir dieses Verfahren, um die Bildung der Gehirnventrikel und die morphogenetische Entwicklung des neuroepithelialen Gewebes in lebenden Zebrafischen zu untersuchen. Aufgrund der Transparenz der Zebrafischembryonen kann die Charakterisierung der Form der Gehirnventrikel schwierig sein.

Diese Technik ist eine nützliche und einfache Methode, um den flüssigkeitsgefüllten Raum von dem umgebenden Gewebe zu unterscheiden und um mutierte Embryonen zu charakterisieren, die möglicherweise Defekte in der Bildung der Gehirnventrikel aufweisen. Beginnen wir also. Um die Injektion in den Gehirnventrikel von Zebrafischen vorzubereiten, stellen wir zunächst die Injektionsnadeln her.

Ein Nadelpolarisator von Sutter wird verwendet, um die Kapillarnadeln zu ziehen. Die Kapillarnadel wird anschließend mit einem fluoreszierenden Farbstoff, beispielsweise Texas-Red-Dextran, gefüllt. Danach wird die gefüllte Nadel in einem Mikromanipulator der Mikroinjektionsapparatur befestigt.

Schneiden Sie die Nadel in einem Winkel auf die geeignete Größe zu. Um eine abgeschrägte Spitze herzustellen, messen Sie die Tropfengröße der Nadel und überprüfen Sie, dass sie zwischen ein und zwei Nanolitern pro Injektion in Öl liegt. Um diese Verfahrensstufe zu beginnen, sollten die Embryonen gemäß Kimmel 30 Minuten früher als der interessierende Entwicklungsstadium injiziert werden.

Beispielsweise, um die Ventrikel 24 Stunden nach der Befruchtung zu untersuchen, injizieren Sie die Embryonen 23,5 Stunden nach der Befruchtung. Der Embryo im interessierenden Entwicklungsstadium wird unter dem Stereomikroskop platziert, und die Chorionhülle wird vorsichtig mit einer Pinzette vom Embryo entfernt. Anschließend wird eine Aros-Schale für die Embryonen hergestellt, indem eine Plastikschale mit 1 % Aros beschichtet wird; bohren Sie mit einer Plastikpipettenspitze für 1–200 µL Löcher in die Aros-Schicht.

Entfernen Sie die Aros-Stopfen vorsichtig mit einer Pinzette aus den Löchern. Überführen Sie das Embryo und das Embryomedium in die Aros-Schale mit Löchern. Geben Sie Trica zum Medium hinzu, um das Embryo zu betäuben und Bewegungen zu verhindern.

Während des Experiments legen Sie den Embryo vorsichtig mit dem Schwanz nach unten in die Öffnung und richten ihn so aus, dass die Injektionsvorrichtung an der dorsalen Seite des Embryos liegt. Da der Embryo nun korrekt in der Petrischale positioniert und ausgerichtet ist, können wir mit der Injektion in die Gehirnventrikel beginnen. Richten Sie zunächst die Mikromanipulationsanlage so ein, dass die Nadelspitze im gleichen Sichtfeld wie der Embryo bei hoher Vergrößerung liegt.

Führen Sie die Nadel vorsichtig durch das dünne Dachplättchen des Hinterhirns unmittelbar hinter dem Scharnierpunkt R null R eins, ohne das darunterliegende Hirngewebe zu verletzen, und injizieren Sie gerade so viel Farbstoff, dass die Ventrikel vollständig gefüllt werden. Je nach Entwicklungsstadium des Embryos können mehrere Injektionen erforderlich sein, um den Ventrikelfortsatz vollständig zu füllen. Sobald der Embryo injiziert wurde und zur Bildgebung bereitsteht, wird eine neue aros-Schale für den Embryo vorbereitet.

Unter Verwendung einer sauberen mit 1 % Agarose beschichteten Petrischale Löcher in die Schale stechen und die Stopfen entfernen. Das Embryo in die Schale überführen und Tricain zugeben, um das Embryo zu betäuben und Bewegungen zu verhindern. Den Schwanz des in den Ventrikel injizierten Embryos in das Loch bringen, um eine dorsale Aufnahme zu ermöglichen.

Das Embryo ist nun bereit zur Bildaufnahme. Erstellen Sie ein Bild mit durchtretendem Licht. Es ist äußerst wichtig, das Embryo oder das Mikroskop nicht zu bewegen.

Ändern Sie anschließend die Einstellungen am Mikroskop und nehmen Sie eine Aufnahme mit Fluoreszenzlicht auf. Positionieren Sie das Embryo neu, um Seitenansichten sowohl mit Durchlicht als auch mit Fluoreszenzlicht aufzunehmen. Speichern Sie alle Bilder als Dateien zur Bildverarbeitung in Photoshop.

Um die Bilder in Photoshop zu bearbeiten, öffnen Sie die Transmissionslicht- und Fluoreszenzbilder desselben Embryos, die an derselben Position aufgenommen wurden. Stellen Sie sicher, dass alle Einstellungen identisch sind. Ziehen Sie für jedes Bild das Fluoreszenzbild auf das Transmissionslichtbild und richten Sie beide exakt aus, wobei das Fluoreszenzbild ausgewählt sein muss. Wählen Sie Bildanpassungen und anschließend Farbe ersetzen aus, und ändern Sie den schwarzen Hintergrund in weiß.

Passen Sie im Fenster „Farbe ersetzen“ den Unscharfheitsfaktor nach rechts an, bis das fluoreszierende Bild farblich einheitlich erscheint. Wählen Sie im Fenster „Ebenen“ die Option „Multiplizieren“. Um die überlagerten Bilder anzusehen, sollte Ihr Bild des Ventrikulärraums exakt mit dem Durchlichtbild übereinstimmen.

Speichern Sie diese Datei und wiederholen Sie den Vorgang für alle weiteren Bilder. Wenn die Ventrikelinjektion korrekt durchgeführt wurde, sollten die Bilder scharfe Ränder aufweisen und die Farbstoffverteilung nicht diffus sein, wie hier in diesen Aufnahmen von 25 Stunden nach der Befruchtung zu sehen ist. Die Aufnahmen von Wildtyp-Embryonen zeigen in Panel A das Hellfeldbild, in Panel B das Fluoreszenzbild und in Panel C das Überlagerungsbild.

Die Seitenansicht des Überlagerungsbildes ist in Panel D dargestellt. Wenn andererseits während der Ventrikelinjektion die Nadel zu tief eingeführt wird, dringt sie in das Gehirngewebe unterhalb des Ventrikels ein und führt zu einer fehlerhaften Injektion. Dies hat zur Folge, dass Farbstoff außerhalb des Ventrikels und im Dottersack sichtbar ist, wie hier gezeigt. Panel E zeigt das Helligkeitsfeldbild.

Panel F zeigt das fluoreszierende Bild und Panel G das überlagerte Bild. Eine Seitenansicht des überlagerten Bildes ist in Panel H dargestellt. Die Pfeile markieren Bereiche, in die der Farbstoff über den Ventrikelflußraum des Gehirns hinausgedrungen ist. In diesem Video haben wir demonstriert, wie man fluoreszierenden Farbstoff in die sich entwickelnden Ventrikel des Zebrafischgehirns injiziert.

Diese Methode dient der Visualisierung des Ventrikellumen des Gehirns im Kontrast zum umgebenden Neuroepithel und ist äußerst nützlich zur Bestimmung der Form des Ventrikellumen sowie der Form des umgebenden Hirngewebes. Mithilfe dieser Technik können wir den Prozess der Ventrikelbildung und die Gehirnmorphogenese über die Zeit im lebenden Embryo besser verstehen. Sie ist ein hervorragendes Werkzeug zur Untersuchung von Defekten in der Ventrikelbildung und zur ersten Charakterisierung von Mutanten mit Störungen der Gehirnmorphogenese.

Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.