Verfahren für Kreuze in Setaria viridis, Ein New Model System für die Gräser

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, zu demonstrieren, wie Kreuzungen für cter verus, ein neues Modellsystem für die Gräser, durchgeführt werden können. Dies wird erreicht, indem zuerst die Spitze ausgewählt, getrimmt und beschriftet wird. Der zweite Schritt besteht darin, die getrimmte Rispe zu entmannen, indem Sie sie in ein 48 Grad heißes Wasserbad tauchen.

Als nächstes wird die beschnittene Spitze als Weibchen für die Bestäubung durch eine Spitze verwendet, die Pollen abgibt. Der letzte Schritt ist die Ernte der Samen zwei Wochen nach der Fremdbestäubung. Letztendlich wird die Gus-Färbung der mutmaßlichen Hybridsamen verwendet, um die Wirksamkeit der Technik zu zeigen.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber den bestehenden Methoden wie der körperlichen Entmannung besteht darin, dass sie weniger invasiv und relativ einfach im Labor zu etablieren ist. Diese Methode wird dazu beitragen, die Einführung von cter verus als genetisches Modell zu beschleunigen, indem sie die Durchführung von Kreuzungen erleichtert. Entfernen Sie zunächst eine Zelle zum Bewässern und füllen Sie dann eine Schale mit vier mal neun Zellen mit metro Mix 360.

Besprühen Sie dann die Zellen leicht und säen Sie Samen auf die Oberfläche des Bodens, einen Samen pro Zelle. Bedecken Sie dann die Samen mit einer Schicht Erde, besprühen Sie die Oberfläche des Bodens mit einer Dicke von 0,5 Zentimetern, besprühen Sie sie, um sie zu befeuchten, und gießen Sie dann flach von unten. Gießen Sie die Zellen nach der Samenaussaat ein- bis zweimal täglich von unten und achten Sie darauf, nicht zu viel zu gießen.

Stellen Sie die Bedingungen der Wachstumskammer tagsüber auf 31 Grad Celsius und nachts auf 22 Grad Celsius ein, mit einer Preda-Behandlung von 15 Grad Celsius von 8:30 bis 9:00 Uhr. Halten Sie auch einen 12-Stunden-Hell-Dunkel-Zeitplan ein und stellen Sie die relative Luftfeuchtigkeit unter diesen Bedingungen auf 50 % ein. Satter verus a 10.1 blüht 21 bis 22 Tage nach der Aussaat. Idealerweise wird die Entmannung am Nachmittag oder Abend durchgeführt.

Wählen Sie das primäre Pentagramm an jeder Pflanze, die ein bis fünf Blüten in Blüte hat. Schneiden Sie dann die Spitze des Pentagramms ab und entfernen Sie mit einer feinen Pinzette alle Blüten im unteren Bereich des proximalen Mittel- und Basisabschnitts. Wenn nur ein Zehntel bis ein Fünftel der Blüten blüht.

Um den unteren Teil des distalen, mittleren und oberen Teils der proximalen Mitte für den weiteren Schnitt zu erhalten, schneiden Sie die Spitze ab und schneiden Sie die Blüten von der Basis der Rispe ab. Wenn eine Rispe ein Viertel bis die Hälfte der Blüten in Blüte hat, behalten Sie den proximalen Mittelteil für den weiteren Schnitt bei und schneiden Sie den distalen Mittelteil ab. Sobald das Pentagramm geschnitten ist, schneide die Borsten mit einer chirurgischen Schere leicht ab.

Achten Sie darauf, dass die Borsten in der Region, die bestäubt wird, erhalten bleiben, um die Röschen vor möglichen Hitzeschäden zu schützen. Für jedes Ährchen das oberste reife Röschen aufbewahren. Die oberste Blüte hat zum Zeitpunkt der Bestäubung eine höhere Wahrscheinlichkeit einer Anthese.

Entfernen Sie dann alle blühenden Blüten und alle unreifen Blüten, so dass etwa 20 bis 30 Blüten pro Zinne gleichmäßig verteilt sind. Markieren Sie dann eine Seite jeder Blüte mit einem roten Permanentmarker. Und notieren Sie die Anzahl der Röschen auf der Flagge der Spitze mit den folgenden Informationen, dem Datum der Entmannung, der Dauer und der Temperatur, bei der die Entmannung durchgeführt wird.

Sobald die Rispe beschnitten ist, entfernen Sie alle Bestockungen jeder Pflanze, um sicherzustellen, dass mehr Ressourcen für die Entwicklung der Hauptspitze bereitgestellt werden. Stellen Sie eine Stunde vor der Entmannung ein Wasserbad auf 48 Grad Celsius für die Wärmebehandlung ein. Nach dem Vorheizen die getrimmten Pentagramme vorsichtig biegen und drei bis vier auf einmal drei bis sechs Minuten lang in warmes Wasser tauchen.

Sei vorsichtig, um den Stiel des Pentakels nicht zu brechen. Das Fahnenblatt, das das Pentagramm unterspannt, sollte nicht mit warmem Wasser in Berührung kommen. Dies dient dazu, Hitzeschäden am Blattgewebe zu verhindern.

Sobald die Entmannung für die gewünschte Dauer durchgeführt wurde, nehmen Sie die Rispen aus dem Wasserbad und schütteln Sie das Wasser vorsichtig von der Rispe ab. Decken Sie dann die entmannte Rispe vollständig mit einem maßgeschneiderten mikroperforierten Brotbeutel ab und befestigen Sie ihn mit einem Drehbinder. Mikroperforierte Brotbeutel können je nach Größe der Rispe angepasst werden.

Zum Schluss stellst Du die Pflanzen bis zum nächsten Tag wieder in die Wachstumskammer. Bringen Sie am zweiten und dritten Tag um 9:00 Uhr entmannte weibliche und nicht entmannte männliche Eltern aus der Wachstumskammer ins Labor, um Kreuzungen durchzuführen, zu beobachten und eine weitere Rote hinzuzufügen. zu den Blumen, die geblüht haben oder blühen.

Notieren Sie mit einem roten Permanentmarker die Gesamtzahl der blühenden Blüten pro Rispe. Notieren Sie dann das Datum der Bestäubung und den Namen des männlichen Elternteils auf dem Etikett, um zu verfolgen, welche Kreuzungen durchgeführt wurden. Beobachten Sie die Spitzenzeit der Antithese bei männlichen Eltern unter unseren Laborbedingungen, die Blüten auf den Pentagrammen des männlichen Elternteils beginnen sich gegen 10:10 Uhr synchron zu öffnen. Nach dem Öffnen erfolgt die vollständige Anstrengung der Antheren und die Freisetzung von Pollen nach 20 Minuten.

Beginnen Sie sofort mit der Bestäubung, wenn es gelblich ist. Weiße Staubbeutel sind auf den Blüten des männlichen Elternteils sichtbar. Die Bestäubung erfolgt am zweiten und dritten Tag, indem Rispe gegen Rispenbestäubung oder annähernd zur Stigmabestäubung verwendet wird.

Reiben Sie mit einer abgelösten Rispe, während das Männchen die Rispe vorsichtig mit der entmannten Rispe zusammenreibt, um die Bestäubung zu erleichtern, und entsorgen Sie die männliche Rispe, um eine Kontamination zu vermeiden. Wiederholen Sie den Bestäubungsvorgang, bis jede entmannte Spitze von zwei bis drei Pentagrammen bestäubt wurde. Die effektivste Methode ist die Stigmabestäubung mit einer Pinzette. Pflücken Sie eine Blume, die mit gelblich-weißen Staubbeuteln blüht, oder pflücken Sie Staubbeutel und berühren Sie die Narbe der Blüte auf dem weiblichen Elternteil.

Verwenden Sie eine Blüte des männlichen Elternteils, um eine Blüte auf der entmannten Rispe zwischen den Bestäubungen verschiedener männlicher Eltern zu bestäuben. Tauchen Sie die Pinzette in 95%iges Ethanol und wischen Sie sie anschließend mit Kim-Tüchern ab, um eine Kontamination durch Verschleppung von Pollen zwischen verschiedenen Kreuzungen zu vermeiden. Sobald die Bestäubung durchgeführt wurde, decken Sie die Rispe des weiblichen Elternteils mit einem maßgeschneiderten mikroperforierten Brotbeutel ab und befestigen Sie ihn mit einem Drehbinder an der Basis.

Nach der Bestäubung bis zur Samenernte ernten Sie die Samen 14 bis 16 Tage nach dem Tag der Bestäubung und legen Sie das Etikett in denselben Umschlag wie die Samen. Samen mit roter Markierung auf beiden Seiten stellen die Samen dar, die aus der kontrollierten genetischen Kreuzung hervorgegangen sind. Entsorgen Sie alle Samen ohne rote Markierung, da sie die Samen darstellen, die aus neu entwickelten Blüten hervorgegangen sind.

Nach der Entmannung stellen Samen mit roten Markierungen wahrscheinlich nur auf einer Seite die Samen dar, die aus der Selbstbestäubung hervorgegangen sind. Zum Schluss trocknen Sie die Samen zwei Tage lang bei 30 Grad Celsius. Lagern Sie getrocknete Samen im Labor oder idealerweise in einer Samenkammer.

Wenn Sie für die weitere Analyse bereit sind, entfernen Sie die Physen, falls erforderlich. Die in diesem Video beschriebenen Methoden sind das Ergebnis zahlreicher Versuche mit unterschiedlichen Temperaturen und Behandlungszeiten, um den Entmannungsprozess zu optimieren. Der Erfolg dieses Prozesses wurde an der Anzahl der gewonnenen Hybridsamen gemessen.

Sechs Samen von einer der Testkreuzungen, bei denen der männliche Elternteil einen Reporter trug. Die Gene, die für Beta-Glucuronidase kodieren, sind hier dargestellt. Das Reporter-Gen bewirkt, dass sich der Samen beim Färben blau verfärbt, so dass die Anzahl der Hybridsamen leicht zu zählen ist. Einmal gemeistert, können bis zu 15 Pentakel pro Tag gekreuzt werden, wenn das Verfahren richtig durchgeführt wird.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Kreuzungen in Aria verus ausführt.