Hochdurchsatz-, robuste und hochzeitflexible Methode zur Oberflächensterilisation von Arabidopsis-Samen

Dieses Protokoll verbessert die Samenoberflächensterilisation, ein grundlegender Schritt in der funktionellen Genomik der Modellart Arabidopsisthaliana. Die Hauptvorteile dieser Technik sind Leichtigkeit und hoher Durchsatz, was die Verarbeitung von Hunderten von Proben pro Tag ermöglicht. Mit einigen einfachen Modifikationen kann diese Methode auf viele andere Modell- und Nicht-Modellpflanzenarten angewendet werden.

Für Erstanwender achten Sie bitte auf die Temperatur des Mediums und die Zentrifugationsgeschwindigkeit, da beide für das Überleben des Saatguts entscheidend sind. Bereiten Sie zunächst 70% Ethanol vor, indem Sie 95% technisches Ethanol zu destilliertem Wasser hinzufügen und gründlich mischen. Als nächstes bereiten Sie 5% Bleichlösung vor, indem Sie fünf Milliliter Haushaltsbleiche zu 95 Millilitern sterilem destilliertem Wasser hinzufügen.

Fügen Sie dann ein paar Tropfen nichtionisches Reinigungsmittel in die Bleichlösung hinzu und mischen Sie gründlich. Als nächstes bereiten Sie Murashige und Skoog Medium in halber Stärke zu, indem Sie 2,2 Gramm MS-Mediumpulver einschließlich Vitaminen und 10 Gramm Saccharose in 800 Milliliter destilliertem Wasser hinzufügen. Stellen Sie den pH-Wert des Mediums mit einem molaren Kaliumhydroxid auf 5,7 ein und bringen Sie das Volumen dann mit destilliertem Wasser auf einen Liter.

Aliquotieren Sie 500 Milliliter des Mediums in eine Ein-Liter-Flasche und fügen Sie vier Gramm Agar hinzu, um ein festes Medium herzustellen. Nach dem Autoklavieren das Medium in einem Wasserbad auf 50 bis 53 Grad Celsius abkühlen lassen. Dann gießen Sie es in Petrischalen unter der Laminar-Flow-Haube.

Um ein selektives Medium zuzubereiten, fügen Sie dem Medium Kanamycin hinzu und gießen Sie es wie zuvor gezeigt in Petrischalen. Um den Sauger einzurichten, schließen Sie den Einlass der Vakuumpumpe an ein Ende eines Polyethylenrohrs einer geeigneten Größe an. Verbinden Sie dann das andere Ende des Rohres mit dem Auslass des Zwei-Wege-Deckels der Dekantierflasche.

Wickeln Sie die Verbindung des Schlauches dicht mit einer Dichtungsfolie ein, um eine luftdichte Verbindung zu gewährleisten. Als nächstes verbinden Sie ein zweites Polyethylenrohr mit dem Einlass des Schraubverschlusses an der Dekantierflasche. Verbinden Sie dann die andere Seite des Rohres mit dem Auslass eines Aquarienventils, das mit einem dünnen Polyethylenrohr ausgestattet ist.

Wickeln Sie die Verbindung bei Bedarf mit der Dichtungsfolie ein, um Luftleckagen zu vermeiden. Nachdem Sie zwei Chargen von 48 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen mit progressiven Zahlen markiert haben, fügen Sie 100 bis 200 Arabidopsis-Samen zu jedem der 96 sterilen Mikrozentrifugenröhrchen hinzu, etwa ein bis zwei Millimeter über dem Boden des konischen Endes des Röhrchens. Als nächstes geben Sie mit einer sterilen serologischen Pipette von 10 Milliliter etwa einen Milliliter 70% Ethanol in jedes Röhrchen und schließen Sie die Deckel vorsichtig.

Schütteln Sie die Röhren mit einer Schwingungsfrequenz von acht Hertz drei Minuten lang in einem Shaker. Nehmen Sie dann die Adapter aus dem Shaker und geben Sie sie in den Korb einer Tischmikrozentrifuge, um die Samen mit der Pulsfunktion herunterzufahren. Öffnen Sie nach dem Umfüllen der Rohre in ein Gestell alle Rohre unter der Laminar-Flow-Haube.

Berühren Sie nicht den Teil der Deckel, der in die Röhrchen passt, um eine Kontamination zu vermeiden. Setzen Sie dann unter der Laminar-Flow-Haube eine sterile 200-Mikroliter-Gelbe Spitze auf den Aquarienventileinlass des hausgemachten Aspirators und schalten Sie die Pumpe ein. Führen Sie die Spitze knapp über dem Niveau der Samen ein, um zu vermeiden, dass die Samen beim Saugen der Flüssigkeit berührt werden.

Als nächstes wird mit einer sterilen serologischen Pipette von 10 Milliliter aliquot ein Milliliter 5%iger Bleichlösung in jedes Röhrchen gegeben. Schließen Sie die Deckel, bevor Sie die Röhrchen wieder in die Shaker-Adapter einsetzen, und schütteln Sie dann die Röhrchen wie zuvor gezeigt. Nachdem Sie die Samen mit der Pulsfunktion einer Tischzentrifuge heruntergedreht haben, montieren Sie eine neue sterile 200-Mikroliter-Gelbspitze auf das Aquarienventil und schalten Sie die Pumpe ein.

Führen Sie die Spitze über das Niveau der Samen ein, um zu vermeiden, dass die Samen beim Saugen der Bleichlösung berührt werden. Als nächstes wird mit einer sterilen serologischen Pipette von 10 Milliliter ein Milliliter sterilisiertes Wasser in jedes Röhrchen eingeteilt. Nachdem Sie eine neue sterile 200-Mikroliter-Gelbspitze auf das Aquarienventil montiert haben, schalten Sie die Pumpe ein.

Führen Sie die Spitze knapp über dem Niveau der Samen ein, um zu vermeiden, dass die Samen beim Saugen des Wassers berührt werden. Schließlich aliquot 500 Mikroliter sterilisiertes Wasser in jedes Röhrchen und schließen Sie alle Deckel in der Laminar-Flow-Haube. Die Samen sind nun bereit für die Aussaat.

Bei Bedarf halten Sie die Röhren bis zu einigen Stunden bei Raumtemperatur oder über Nacht bei vier Grad Celsius. Mit einer Ein-Milliliter-Pipette die Samen mit 300 bis 400 Mikroliter sterilem Wasser in eine Petrischale geben. Nach dem Umfüllen von 10 Tuben gießen Sie 1,5 bis zwei Milliliter geschmolzenes halbfestes Murashige- und Skoog-Medium ohne Antibiotika in jede Platte.

Schwenken Sie die Platte schnell, um die Samen zu verteilen, und kleben Sie die Platten auf gegenüberliegenden Seiten. Wickeln Sie die Platten in Plastik- oder Aluminiumfolie und stellen Sie sie für drei Tage im Dunkeln in einen Kühlschrank, um eine gleichmäßige Keimung zu erhalten. Keimungsanalysen, die an den Tagen zwei, drei, vier und sieben durchgeführt wurden, zeigten keine signifikanten Unterschiede zwischen 10 bis 40 Minuten Sterilisationszeit mit 70% Ethanol.

Wenn die Sterilisationszeit jedoch 40 Minuten überschritt, nahmen die Keimraten ab. Entsprechend sanken auch die Grünen Keimblatt-Emergenzraten. Basierend auf der Studie wurden drei Minuten für 70% Ethanol und drei Minuten für 5% Bleichmittel als Mindestzeit für die Sterilisation der Samen ausgewählt.

Um nachzuweisen, dass die ursprünglich verwendeten Samen mit Mikroorganismen kontaminiert waren, wurden unsterile Samen direkt auf den Platten ausgesät. Im Vergleich zu sterilen Samen zeigten unsterile Samen nach zwei Tagen ein pilzliches Aussehen, das sich nach einer siebentägigen Keimung über die Platten ausbreitete. Ein Kreuzkontaminationstest, der mit einer einzigen sterilen Pipettenspitze zur Verarbeitung verschiedener Samenproben durchgeführt wurde, zeigte, dass in den Columbia-0-Genotyp-Samen, die in Platten mit Kanamycin ausgesät waren, keine grünen Keimblätter beobachtet wurden.

Parallel dazu erschienen in Columbia-0-Samen, die in Platten ohne Kanamycin gesät wurden, alle Keimblätter nach der Keimung grün. Diese Ergebnisse deuten auf keine Übertragung der Kontamination zwischen den Proben hin, obwohl eine einzige Pipettenspitze verwendet wurde, um die sterile Lösung zu entfernen. Dieses Verfahren ist die Grundlage für viele andere funktionelle Genomik-Methoden wie Genüberexpression, Genom-Editing, subzelluläre Lokalisierung, Promotoraktivität und Protein-Protein- und Protein-DNA-Interaktionen.