Name: Einrichtung einer In-vitro- System zur intrazelluläre Verhalten der Studie Candida glabrata Menschen THP-1-Makrophagen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-10T20:15:00.000+00:00
Duration: 13 min 47 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie ein In-vitro-Modell zur Untersuchung des intrazellulären Verhaltens von Candida glabrata in menschlichen THP-1-Makrophagen etablieren. Diese Methode ermöglicht die Analyse von Virulenzmechanismen und Immunantworten.

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Diese Arbeit wurde von Innovative Junge Biotechnologist Auszeichnung BT/BI/12/040/2005 und BT/PR13289/BRB/10/745/2009 Zuschuss von Department für Biotechnologie, Regierung von Indien und Kernfonds, des Zentrums für DNA-Fingerprinting and Diagnostics unterstützt werden, Hyderabad. MNR und GB sind die Empfänger von Junior und Senior Research Fellowships des Rates für Wissenschaftliche und Industrielle Forschung auf die Verfolgung einer Doktorgrad der Manipal University. SB ist der Empfänger von Junior und Senior Research Fellowship des Department für Biotechnologie auf die Verfolgung einer Doktorgrad der Manipal University.

Es wird empfohlen, C auszuführen glabrata Infektionsversuche im Labor mit Biosicherheitsstufe 2 (BSL-2). <ol><li> Herstellung von THP-1 Makrophagen-Monoschicht. </li><li> Vorbereitung von C. glabrata Zellsuspension. </li><li> Infektion von THP-1 Makrophagen, die mit C. glabrata-Zellen. </li><li> Messung der Phagozytose und intrazelluläre Replikationsrate über koloniebildende Einheit-Assay. </li><li> Überwachung von intrazellulären Replikation mittels konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie. </li></ol> 1. Herstellung von THP-1 Makrophagen-Monolayer <ol><li> THP-1 ist eine menschliche Monozyten-Zelllinie aus dem peripheren Blut eines 1-jährigen männlichen Kind leidet unter akuter Monozytenleukämie 14 abgeleitet. THP-1-Zelllinie wurde eine Suspension, wird routinemäßig bei 37 ° C in befeuchteter 5% CO 2 in RPMI-1640-Kulturmedium mit 10% FBS (fötales Rinderserum) ergänzt gehalten. Die Behandlung mit Phorbol 12-myristate 13-Acetat (PMA, ein Phorbolester) führt die terminale Differenzierung von THP-1 Monozyten zu Makrophagen. Wichtig ist, dass PMA-Behandlung keinen Einfluss auf die Lebensfähigkeit der Zellen und differenzierten Zellen nicht teilen. </li><li> Samen ungefähr 1,5 x 10 6 THP-1 Monozyten in 100 mm Kulturschalen in RPMI-1640-Vollmedium (RPMI-1640-Medium, ergänzt mit 10% Serum, 2 mM Glutamin und Antibiotika 1x; 10 ml / Schale) und lassen Zellen wachsen bei 37 ° C in 5% CO 2 für 2 Tage. </li><li> Sobald THP-1-Zellen haben eine Dichte von 8 x 10 5 Zellen / ml erreicht, übertragen Sie die Kulturschale zu der Zellkultur Laminarströmungshaube und schwenken Sie es ständiger Zellen resuspendieren. </li><li> Pipettieren Sie die Zellsuspension aus, legen Sie in eine 15 ml sterilen Röhrchen und Zentrifuge bei 1000 rpm (130 xg) für 4 min. Überstand verwerfen und aussetzen THP-1-Zellpellet in 5 ml frisches, vorgewärmt, RPMI-1640-Komplettmedium. </li><li> Auflisten von Zellen mit einer Zählkammer und verdünnt das cell Suspension auf eine endgültige Dichte von 10 6 Zellen / ml mit vorgewärmten RPMI 1640 Komplettmedium </li><li> 1 ul von 160 mM PMA Lager (Phorbol-12-Myristate 13-Acetat-Lösung in Dimethylsulfoxid hergestellt) in 10 ml THP-1-Zellsuspension (Endkonzentration 16 nM) und gut mischen. Verzichten 1 ml Zellsuspension in jede Vertiefung einer 24-Well-Gewebekulturplatte und inkubieren Platte in den Inkubator bei 37 ° C mit 5% CO 2 für 12 h gehalten. </li><li> Entfernen Sie alte Medium, 1 ml vorgewärmten RPMI-1640-Komplettmedium und lassen Zellen für 12 Stunden bei 37 ° C in 5% CO 2 zu erholen. </li><li> Beachten Zellen unter einem umgekehrten Mikroskop zu gewährleisten, dass ovale THP-1 Monozyten-Zellen in Suspension wurden in abgeflacht spindelförmige und haftende Makrophagen differenziert. Diese differenzierten Zellen sind nun bereit, C führen glabrata Infektionsstudien. </li></ol> 2. Vorbereitung von C. glabrata &amp; #160; Zellsuspension C. glabrata Wildtyp-Stamm Bg2 werden zur THP-1-Makrophagen infizieren werden. C glabrata Zellen in flüssigem YPD (Hefeextrakt (1%), Pepton (2%)-Dextrose (2%)) Medium routinemßig kultiviert. Solide YPD-Medium wird durch Zugabe von 2% Agar vor dem Autoklavieren Medium vorbereitet. <ol><li> Um eine Kultur von C. vorbereiten glabrata, wählen Sie eine einzelne Kolonie aus dem Agar-Platte mit einer sterilen Einweg-Schleife und impfen in 10 ml YPD-Flüssigmedium und Inkubation für 14-16 h mit Schütteln (200 rpm) bei 30 ° C </li><li> Zentrifuge dieser Kultur (1 ml) bei 4000 Upm (1800 × g) für 5 min in einer Tischmikrozentrifuge, waschen Sie die Zellen dreimal mit sterilem PBS (Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung, pH 7,4) und Aussetzung Zellpellet in 1 ml PBS. </li><li> Messung der OD 600 C. glabrata Zellsuspension verdünnt und mit einem geeigneten Volumen an steriler PBS auf eine Dichte von 2 x 10 6 Zellen / ml zu erhalten (OD 600= 0.1). Alternativ kann die gewünschte Zelldichte durch Zählen Hefezellen mit einer Zählkammer erreicht werden. </li></ol> 3. Infektion von THP-1 Makrophagen mit C. glabrata Zellen <ol><li> In 50 ul C. glabrata Zellsuspension auf THP-1-Makrophagen (10 6 Zellen pro Vertiefung einer 24-Well-Kulturplatte), um ein MOI (Multiplizität der Infektion) von 0,1 zu erhalten, und Inkubieren Platte bei 37 ° C mit 5% CO 2. </li><li> Um lebensfähig Hefe zählt zu bestimmen, verdünnte 50 ul C. glabrata Zellsuspension 100-fach in sterilem PBS und Platte 100 ul auf YPD-Festmedium. Platten bei 30 ° C und zählen die Anzahl der manuell Hefe-Kolonien nach 1-2 Tagen erscheinen. Diese Zahlen werden von nun an, wie hr 0 C bezeichnet werden glabrata KBE (koloniebildende Einheiten). </li><li> Nach 2 h Co-Kultivierung von THP-1-Zellen mit C. glabrata Zellen, Ablagekulturmedium durch Umkehren 24-Loch-Gewebekulturplatte ina Reservoir und vorsichtig waschen dreimal mit sterilem PBS auf vorgewärmten nonphagocytosed extrazellulären C entfernen glabrata-Zellen. Schonwaschschritten mit PBS sind absolut notwendig, um eine vollständige Entfernung aller extrazellulären Hefe, ohne dass Schäden an der THP-1-Makrophagen-Monolage zu erreichen. </li></ol> 4. Messung der Phagozytose und intrazelluläre Replikationsrate über Kolonie bildende Einheit Assay <ol><li> Lyse C. glabrata THP-1-infizierten Makrophagen in 1 ml sterilem H 2 O 2 min, kratzen sanft auf die Makrophagen-Ablagerungen aus dem Bohrloch zu entfernen und sammeln Zelllysat in ein Mikrozentrifugenröhrchen. Mikroskopische Prüfung von kompletten Makrophagen-Lyse ist entscheidend für die Wiederherstellung aller verinnerlicht Hefe. </li><li> Bereiten Sie eine 100-fache Verdünnung des Lysats in sterilem PBS, Platte 100 ul auf YPD-Festmedium Platten und Inkubation bei 30 ° C </li><li> Nach 1-2 Tagen rechnen manuell die Anzahl der C glabrata Kolonien, aperschien auf YPD-Medium, multiplizieren mit Verdünnungsfaktor (2 Std. KBE) und berechnen Phagozytose Geschwindigkeit, die der Prozent der C bezieht sich glabrata Zellen, THP-1 durch Makrophagen nach 2 h Koinkubation aufgenommen unter Verwendung der folgenden Formel. % Phagozytose = [(KBE bei 2 h) / (CFU bei 0 h)] x 100 </li><li> Um die Rate der intrazellulären Replikation von C messen glabrata Zellen in THP-1-Makrophagen, sammeln intrazellulären Hefe zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Infektion, dh. 4, 6, 8, 10, 12 und 24 h, durch Wiederholen der Schritte von 3,3 bis 4,3. </li><li> Berechnen fach Überleben / Replikation von C. glabrata Zellen THP-1 in Makrophagen durch Division der Gesamtzahl CFUs zu einem bestimmten Zeitpunkt mit den in 2 h (phagozytiert Hefe). </li></ol> 5. Überwachung von intrazellulären Replikation mittels konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie <ol><li> Nach den in Abschnitt 1 beschriebenen Schritte, Saatgut PMA-behandelten 5 x 10 5 THP-1-Zellen in jeder Vertiefung von zwei vier-und Kammer-Objektträgern und bei 37 ° C mit 5% CO 2 für 12 Stunden. </li><li> Ersetzen Sie alte Medium mit vorgewärmten RPMI-1640-Komplettmedium und lassen Zellen aus PMA-Behandlung für 12 Stunden zu erholen. </li><li> Bereiten GFP (green fluorescent protein)-markierten C glabrata Zellsuspension, wie in Abschnitt 2 beschrieben, und infizieren zu THP-1-Makrophagen zu einer MOI von 1. Wenn C. glabrata GFP-exprimierenden Stämme sind nicht verfügbar, Hefe-Zellen mit FITC (Fluoresceinisothiocyanat) markiert ist, kann verwendet werden, um zu überwachen frühen Ereignisse nach der Infektion nämlich. Phagozytose Rate und phagolysosomale Reifung bei 2 Stunden. </li><li> Folien für 2 Stunden bei 37 ° C mit 5% CO 2, invertieren sie sorgfältig zu waschen Medium verwerfen und 3x mit sterilem, vorgewärmtes PBS. </li><li> Add 500 ul vorgewärmten RPMI-1640-Komplett mediUM zu jeder Kammer von einer Folie und inkubieren sie bei 37 ° C mit 5% CO 2 für 22 Stunden. </li><li> Um dies zu beheben 2 h C glabrata-THP-1-infizierten Makrophagen, 500 ul 3,7% Formaldehyd (in PBS) zu jeder Kammer des anderen Schlitten und Inkubation bei Raumtemperatur für 20 Minuten im Dunkeln. </li><li> Wash schieben dreimal mit PBS, 500 ul Triton-X (0,7%), und bei Raumtemperatur für 5 min im Dunkeln. </li><li> Wash Rutsche 3x mit PBS, entfernen Kammer von Kulturträger und Luft trocknen Sie es für 3-5 min im Dunkeln. </li><li> Vorsichtig aufsetzen eines Deckglases mit Vectashield Montage-Medium mit DAPI (4 &#39;,6-Diamino-2-phenylindol) auf Folie Blasenbildung zu vermeiden. Entfernen Sie vorsichtig die überschüssige Flüssigkeit mit Kimwipe und dichten Deck Ränder mit Nagellack. Schiebespeicher im Dunkeln bei 4 ° C bis zur Verwendung. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 5,4 und von 5,6 bis 5,9 zu verarbeiten THP-1-Zellen 24 Stunden nach der Infektion. </li><li> Bildzellen unter Verwendung eines Laser-Scanning-confoMikroskope (60X Ölimmersionsobjektiv, Anregung bei 405 nm und 488 nm für DAPI und GFP-Färbung, beziehungsweise). </li></ol>

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<li>Tsuchiya, S., Kobayashi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+maturation+in+cultured+human+monocytic+leukemia+cells+by+a+phorbol+diester%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Induction of maturation in cultured human monocytic leukemia cells by a phorbol diester.</a> Cancer Res. 42 (4), 1530-1536 (1982).</li>
<li>Castaño, I., Kaur, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tn7-based+genome-wide+random+insertional+mutagenesis+of+Candida+glabrata%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Tn7-based genome-wide random insertional mutagenesis of Candida glabrata.</a> Genome Res. 13 (5), 905-915 (2003).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Angeborene Immunsystem spielt eine wichtige Rolle bei der Kontrolle von opportunistischen Pilzinfektionen. Makrophagen tragen zur Verteidigung durch die Einnahme und Zerstörung der Pilzerreger Antimykotika. Somit wird Aufklärung von Faktoren, die für das Überleben und / oder Bekämpfung der antimikrobiellen Funktionen erforderlich sind Makrophagen unser Verständnis von Pilz Virulenz Strategien voraus. In diesem Zusammenhang haben wir ein in-vitro-Zellkultur-Modellsystem unter Verwendung von Makrophagen aus einem...

Candida-Spezies sind die führende Ursache von lebensbedrohlichen invasiven Pilzinfektionen bei immunsupprimierten Patienten ein. Candida glabrata, einer aufstrebenden nosokomiale Erreger, ist die zweite oder dritte am häufigsten isolierten Candida-Spezies aus Intensivstation Patienten, abhängig von der geographischen Lage 3.1. Phylogenetisch, C. glabrata, einem haploiden Hefezellen, enger mit den nicht pathogenen Modell Hefe Saccharomyces cerevisiae als pathogene Candida spp. einschließlich C. 4 albicans. In Übereinstimmung damit, C. glabrata fehlen einige Schlüsselpilz Virulenz inklusive Gegen, sekretierten proteolytischen Aktivität und morphologische Plastizität 4-5. Obwohl C. glabrata bildet keine Hyphen, es zu überleben und zu replizieren in murinen und humanen Makrophagen 6-8 was darauf hindeutet, dass es einzigartig Pathogenese-Mechanismen entwickelt wurden, können. Nur begrenzte Informationen über die Strategien zur Verfügung, die C. glabrata beschäftigt, um zu überleben nährstoffarmen intrazellulären Makrophagen Umwelt und oxidative und nicht-oxidative entgegenzuwirken Wirtsreaktionen von Immunzellen 5 montiert. Ein entsprechendes Modell Makrophagen-System ist eine Voraussetzung, um die Wechselwirkung von C abgrenzen glabrata mit Wirts Phagozyten über funktionelle Genom-und Proteom-Ansätzen. Periphere mononukleare Blutzellen (PBMCs) und Knochenmark-abgeleiteten Makrophagen (BMDMs) des humanen und murinen Ursprungs sind, sind früher verwendet worden, um die Wechselwirkung von C zu studieren glabrata mit Wirtsimmunzellen 7,9. , Schwierigkeiten bei der Beschaffung von PBMCs und BMDMs, ihre begrenzte Lebensdauer und intrinsische Unterschiede zwischen den verschiedenen Säugetier Spender beschränken jedoch die Verwendung dieser Zellen als vielseitige Modellsysteme. Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Etablierung eines in vitro-System, das intracellul studierenar Verhalten von C. glabrata Zellen in Makrophagen aus menschlichen Monozyten-Zelllinie THP-1 abgeleitet. Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls war es, eine einfache, kostengünstige, schnelle und reproduzierbare Zellkultur-Modellsystem, die leicht manipuliert werden kann, um verschiedene Aspekte der Wirt-Pilz-Pathogen-Interaktion untersuchen zu erlassen. THP-1-Zellen wurden bereits verwendet, um die Immunantwort gegen eine Vielzahl von Krankheitserregern wie Bakterien, Viren und Pilze 10-12 entziffern. Monozytären THP-1-Zellen sind leicht zu pflegen und kann unterschieden werden, bei Phorbolester-Behandlung, um Makrophagen, Monozyten-Makrophagen der menschlichen Mimik und Express entsprechenden Makrophagen-Marker 13. Die wichtigsten Vorteile der THP-1-Makrophagen-Modellsystem sind die einfache Bedienbarkeit und das Fehlen von hoch entwickelten Geräten Anforderung. Die hier vorgestellte Protokoll ist leicht anpassbar, um die Interaktion von anderen menschlichen Pilzerreger mit hos studierenT-Immunzellen. Das derzeitige Verfahren kann auch eingesetzt werden, um Virulenzfaktoren für die Krankheitserreger von Interesse mit hohem Durchsatz nach Mutanten zu identifizieren. Diese Proof-of-concept wurde durch die erfolgreiche Anwendung von THP-1-Kulturmodellsystem, um einen Satz von 56 Genen, die für das Überleben von C. glabrata in humanen Makrophagen 8 erforderlich sind beispielhaft zu identifizieren.

<table><tbody><tr><td>THP-1</td><td>American Type Culture Collection</td><td>TIB 202</td><td>Humane Zelllinie für akute monozytäre Leukämie</td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Hyclone</td><td>SH30096.01</td><td>Zur Erhaltung von THP-1-Zellen</td></tr><tr><td>Phorbol 12-Myristat 13-acetat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P 8139</td><td>Vorsicht: Gefährlich</td></tr><tr><td></td><td>BD-Difco</td><td>242710</td><td>Für die Züchtung von Candida glabrata</td></tr><tr><td>Zellen Formaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8775</td><td>Zur Fixierung von C. glabrata-infizierten THP-1-Makrophagen</td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)</td><td></td><td></td><td>Puffer (137 mM NaCl, 10 mM Phosphat, 2,7 mM KCl, pH 7,4) für Waschungen</td></tr><tr><td>Kochsalz-Natriumcitrat (SSC)</td><td></td><td></td><td>Puffer (3 M NaCl, 0,3 M Natriumcitrat für 20-fache Konzentration) für Waschmittel</td></tr><tr><td>Prähybridisierungspuffer</td><td></td><td></td><td>Puffer (50 % Formamid, 5x Denhardt' s-Lösung, 5x SSC, 1% SDS) für die Hybridisierung</td></tr><tr><td>VECTASHIELD Eindeckmedium</td><td>Vector Labs</td><td>H-1200</td><td>Zum Einbetten von Objektträgern für die konfokale Mikroskopie</td></tr><tr><td>32P-markiert &alpha;-dCTP</td><td>JONAKI-BARC</td><td>LCP-102</td><td>Für die Radiomarkierung von Signaturmarkierungen</td></tr><tr><td>100 mm Gewebekulturschalen</td><td>Corning</td><td>430167</td><td>Zur Kultivierung von THP-1-Zellen</td></tr><tr><td>24-Well-Gewebekulturplatte</td><td>Corning</td><td>3527</td><td>Zur Durchführung von C. glabrata-Infektionsstudien an THP-1-Makrophagen</td></tr><tr><td>4-Kammer-Gewebekultur-behandelter Glasobjektträger</td><td>BD Falcon REF354104</td><td></td><td>Zur Abbildung von C. glabrata-infizierten THP-1-Makrophagen</td></tr><tr><td>Hämozytometer</td><td>Rohem, Indien</td><td></td><td>Für die Zählung von Zellen</td></tr><tr><td>Tisch-Mikrozentrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>Microfuge 18</td><td>Zum Schleudern von Zellen in Mikroröhrchen</td></tr><tr><td>Tischzentrifuge</td><td>Remi</td><td>R-8C</td><td>Zum Schleudern von Zellen in 15-ml-Röhrchen</td></tr><tr><td>Spektralphotometer</td><td>Amersham Biosciences</td><td>Ultraspec 10</td><td>Zur Überwachung der Absorption von Hefezellen</td></tr><tr><td>Platteninkubator</td><td>Labtech</td><td>Refrigerated</td><td>Zum Züchten von C. glabrata Zellen</td></tr><tr><td>Shaker-Inkubator</td><td>New Brunswick</td><td>Innova 43</td><td>Zur Züchtung von C. glabrata-Zellen</td></tr><tr><td>Wasserummantelte CO2&nbsp; Inkubator</td><td>Thermo Electron Corporation</td><td>Forma series 2</td><td>Zur Kultivierung von THP-1-Zellen</td></tr><tr><td>Konfokales Mikroskop</td><td>Carl Ziess</td><td>Ziess LSM 510 meta</td><td>Zur Beobachtung von C. glabrata-infizierten THP-1-Makrophagen</td></tr><tr><td>Zusammengesetztes Mikroskop</td><td>Olympus</td><td>CKX 41</td><td>Zur Beobachtung von C. glabrata und THP-1-Makrophagen PCR-Maschine</td></tr><tr><td></td><td>BioRad</td><td>DNA Engine</td><td>Zur Amplifikation einzigartiger Tags aus dem Ein- und Ausgang des genomischen</td></tr><tr><td>DNA-Hybridisierungsofens</td><td>Labnet</td><td>Problot 12S</td><td>Für die Hybridisierung&nbsp;</td></tr><tr><td>PhosphorImager</td><td>Fujifilm</td><td>FLA-9000</td><td>Zum Scannen von hybridisierten Membranen</td></tr><tr><td>Thermomixer</td><td>Eppendorf</td><td>Thermomixer Comfort</td><td>Zur Denaturierung von radioaktiv markierten Signatur-Tags</td></tr><tr><td>Gel-Dokumentationseinheit</td><td>Alphainnontech</td><td>Alphaimager</td><td>Zur Visualisierung von Ethidiumbromid-gefärbter DNA in Agarose-Gelen</td></tr></tbody></table>

einrichtung einer<em&gt; in-vitro-</em&gt; system zur intrazelluläre verhalten der studie<em&gt; candida glabrata</em&gt; menschen thp-1-makrophagen

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

Eine Zellkultur-Modellsystem, wenn ein enger Mimik von Host-Umweltbedingungen können als preiswerte, reproduzierbare und leicht manipulierbare Alternative zu Tiermodellsysteme für die Untersuchung von einem bestimmten Schritt der mikrobielle Erreger der Infektion dienen. Eine menschliche Monozyten-Zelllinie THP-1, welche bei Phorbolester-Behandlung wird in Makrophagen unterscheiden, wurde bereits früher verwendet, um die Virulenz Strategien vieler intrazelluläre Erreger wie Mycobacterium tuberculosis studieren. Hier ein Protokoll, ein in vitro Zellkulturmodell zu erlassen diskutieren wir System mit THP-1 Makrophagen, um die Wechselwirkung eines opportunistischen Pathogens menschlichen Hefe Candida glabrata mit Host phagozytischen Zellen abzugrenzen. Dieses Modellsystem ist einfach, schnell, offen für Hochdurchsatz-Mutante Bildschirme, und erfordert keine hoch entwickelten Geräten. Eine typische THP-1-Makrophagen-Infektionsversuch dauert ca. 24 Stunden mit einer zusätzlichen Stunde 24-48 wiederhergestellt intrazellulären ermöglichenHefe auf reichen Medium für koloniebildende Einheit-basierte Analyse Rentabilität wachsen. Wie andere in-vitro-Modellsysteme, ist eine mögliche Einschränkung dieses Ansatzes Schwierigkeiten bei Extrapolation der zu einer sehr komplexen Immunzellschaltkreis in den menschlichen Wirt vorhandenen erzielten Ergebnisse. Trotz dieser, ist jedoch die aktuelle Protokoll sehr nützlich, um die Strategien, die eine Pilzerreger verwenden kann, zu umgehen / entgegenzuwirken antimikrobielle Reaktion und zu überleben, anzupassen, und vermehren sich in den nährstoffarmen Umfeld von Wirtsimmunzellen aufzuklären.

Infektion Analysen von PMA-behandelten THP-1 Makrophagen, die mit C. glabrata Wildtyp (wt)-Zellen ergab, dass Gew. Zellen durch Makrophagen mit einer Rate von 55-65% nach 2 h Koinkubation phagozytiert. Weitere, C. glabrata Zellen konnten Tötung von THP-1-Makrophagen wider und unterzog sich einer moderaten 5 - bis 7-fachen Anstieg der KBE nach 24 h Kokultur mit THP-1-Makrophagen 8. Intrazelluläre Replikation von Wildtyp-Zellen, transformiert mit GFP-exprimierenden Plasmid, i...

Der aktuelle Artikel beschreibt ein Protokoll, um eine In-vitro-Zellkultur-Modellsystem, um die Interaktion einer fakultativ intrazellulären Humanfunguspathogen Candida glabrata mit menschlichen Makrophagen, die ein nützliches Werkzeug, um unser Wissen von Pilz Virulenzmechanismen voranzubringen studieren zu etablieren.

Einrichtung einer<em&gt; In-vitro-</em&gt; System zur intrazelluläre Verhalten der Studie<em&gt; Candida glabrata</em&gt; Menschen THP-1-Makrophagen

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, ein In-vitro-Kulturmodell zu etablieren, um das intrazelluläre Verhalten eines humanen opportunistischen Pilzpathogens, Candida labratta, in Makrophagen zu untersuchen, die aus der humanen monozytären Zelllinie TP1 stammen. Zu diesem Zweck werden zunächst THP1-Monozyten mit vier Ester behandelt, um sie in Makrophagen zu differenzieren.Anschließend werden THP-1-Makrophagen mit Candida-GTA-Zellen infiziert, zwei Stunden nach der Infektion. Nicht phagozytierte Candida-GTA-Zellen werden durch PBS-Spülungen entfernt, und intrazelluläre Zellen werden durch Osmolyse der infizierten Makrophagen für weitere Untersuchungen gewonnen. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um sowohl die Aufnahme von Candida-GTA-Zellen in Makrophagen als auch die Phagozytosenreifung sowie die Zytokinantwort in THP-1-Makrophagen nach Candida-GTA-Infektion zu bewerten.Außerdem kann dieses Protokoll hochskaliert werden, um die Candida-Collaborator-Mutantenbibliothek auf veränderte Überlebensprofile in TSP-einschließenden Makrophagen in halb-hochdurchsatztechnischer Weise zu screenen. Der Hauptvorteil dieses Protokolls liegt darin, dass es relativ kostengünstig, hochgradig reproduzierbar und leicht an verschiedene Immunzellen sowie an pilzliche Pathogene anpassbar ist. Um mit dem Verfahren zu beginnen, zwei Tage vor der Infektion THP- und monozytäre Zellen am ersten Tag auf 80 % CO bringen, die Kultur abnehmen und langsam, vorsichtig sämtliche suspendierbaren Zellen in Suspension überführen.Überführen Sie die DHP-ein-Monozyten-Zellsuspension in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension vier Minuten lang bei Raumtemperatur mit 1000 U/min. Entsorgen Sie das Medium in einen Abfallbehälter und geben Sie fünf ml frisches API-Medium in das Röhrchen. Suspendieren Sie das THV-ein-Zellpellet, indem Sie das Medium vorsichtig drei- bis viermal auf- und abpipettieren.Entnehmen Sie 10 Mikroliter der Zellsuspension, um die Zelldichte mit einem Hämozytometer zu bestimmen, und stellen Sie die Zelldichte auf eine Million Zellen pro ml ein. Geben Sie ein Mikroliter einer 60 Mikromolar-PMA-Stammlösung zur Zellsuspension hinzu, sodass die Endkonzentration 16 Nanomolar beträgt, und mischen Sie gründlich. Geben Sie je ein ml Zellsuspension, entsprechend einer Million Zellen, in jedes Loch einer 24-Loch-Gewebekulturplatte und überführen Sie diese in einen Inkubator, der auf 37 Grad Celsius und 5 % CO2 eingestellt ist.Nach 12 Stunden Inkubation das alte Medium verwerfen. Einen ml vorgewärmtes RPI-Medium in jede Vertiefung geben und die Platte weitere 12 Stunden inkubieren. Diese Zellen werden für die Canada-atory-Infektion verwendet, die später gezeigt wird.Unter Verwendung korrekter mikrobiologischer Techniken eine einzelne EA-Kolonie in einen Kolben mit ML YPD-Medium impfen. Den Kolben 14 bis 16 Stunden in einem Inkubator bei 30 °C inkubieren, anschließend eine ML-Kultur bei 4.000 U/min fünf Minuten lang zentrifugieren.Entfernen Sie den Überstand und waschen Sie die Schalen dreimal mit steriler PBS. Nach dem Entsorgen des Waschpuffers suspendieren Sie die Zellen in einem ml steriler PBS durch vorsichtiges Pipettieren. Messen Sie anschließend die Extinktion der Zellsuspension in einem Spektralphotometer bei 600 Nanometer und stellen Sie die Zelldichte mit PBS auf zwei Millionen Zellen pro ml ein.Entnehmen Sie 50 Mikroliter der Zellsuspension und verdünnen Sie diese hundertfach in PBS. Tragen Sie hundert Mikroliter der Kultur auf YPD-AGA-Medium aus. Inkubieren Sie die Platte bei 30 Grad Celsius und zählen Sie die Anzahl der Kolonien, die nach ein oder zwei Tagen auf der YPD-Platte erschienen sind. Multiplizieren Sie diese Zahl mit dem entsprechenden Verdünnungsfaktor, um die Koloniebildenden Einheiten zur Nullstunde zu berechnen. Diese Anzahl an koloniebildenden Einheiten von Canada Reta wird verwendet, um DHE auf Makrophagen zu infizieren.Im nächsten Schritt 50 µL Kanada-Klargelassuspension zu der Makrophagen-Monolayer in einer 24-Well-Kulturplatte hinzufügen. Die Platte schwenken, um die Zellen gleichmäßig zu verteilen, und für zwei Stunden bei 37 °C inkubieren. Das Medium durch Umkehren der Kulturplatte in einen Behälter entsorgen und dann vorsichtig je 1 ml PBS seriell an der Wandseite jedes Wells der Kulturplatte entlang pipettieren, die Wells gründlich waschen und den Puffer entsorgen.Wiederholen Sie diesen Schritt noch zweimal. Als Nächstes, mit Ausnahme des ersten Wells, geben Sie ein ML RPI-Medium in alle anderen Wells, das verwendet werden kann, um die intrazelluläre Replikation von Candida-Ator-Zellen nach 4, 6, 12 und 24 Stunden post Infektion zu überwachen. Um intrazelluläre E-Zellen nach zwei Stunden Makrophagen-Infektion zu gewinnen, geben Sie ein ML Cerealwasser in das Phos-Well. Nach zwei Minuten kratzen Sie das Well vorsichtig mit der ein-Milliliter-Pipettenspitze aus, um die Makrophagen-Trümmer aus dem Well zu entfernen.Spülen Sie die Vertiefung aus und sammeln Sie das Ly in einem Makrozentrifugenröhrchen. Bereiten Sie eine hundertfache Verdünnung des microFIT-Zelllysats in PBS vor und geben Sie hundert Mikroliter auf YPD-AGA-Medium. Inkubieren Sie die Platte bei 30 Grad Celsius für ein bis zwei Tage und zählen Sie die Anzahl der koloniebildenden Einheiten.Multiplizieren Sie diese Zahl mit dem entsprechenden Verdünnungsfaktor, um die Anzahl der Canida-Ator-Zellen zu ermitteln, die nach einer zweistündigen Infektion von T2-Zellen und Makrophagen phagozytiert wurden. Ebenso kann die Anzahl der intrazellulären Canida-Ator-Zellen zu verschiedenen Zeitpunkten bestimmt werden. Die postinfektiöse intrazelluläre Vermehrung kann als Anstieg nach 24 Stunden im Vergleich zu den hier dargestellten nach zwei Stunden internalisierten KBE dargestellt werden.Andere Ergebnisse eines typischen Experiments, bei dem die Gesamtanzahl der Canida-Gator-Zellen, die mit TV-einem Makrophagen infiziert wurden, sechs mal zehn hoch zwei pro vier beträgt. Die Anzahl der nach zwei Stunden gewonnenen Zellen beträgt 3,7 mal sechs mal zehn hoch vier. Dies verdeutlicht, dass e-Zellen während des 24-stündigen Co-Inkubationszeitraums mit einer Rate von 62,66 % phagozytiert werden.Können Al-Zellen eine andere als eine 5,2-fache Vermehrung aufweisen, während die Anzahl der intrazellulären E-Zellen von 3,76 × 10⁴ auf 1,96 × 10⁵ anstieg? In diesem Experiment kann die intrazelluläre Vermehrung von Canida-TER-Zellen ebenfalls mithilfe von GFP-exprimierenden E-Zellen bewertet werden, wobei ein konfokales Mikroskop dafür verwendet wird. Bereiten Sie THV und Makrophagen in einer Vierkammer-Slide gemäß dem zuvor für die 24-Loch-Kulturplatte beschriebenen Protokoll vor und infizieren Sie diese.Zwei Stunden nach der Infektion. Verwerfen Sie das Medium, indem Sie die Objektträgerplatte in einen Abfallbehälter umdrehen, und geben Sie 500 Mikroliter PBS in jede Kammer der Platte. Spülen Sie gründlich aus und verwerfen Sie das PBS.Wiederholen Sie diesen Schritt zwei weitere Male mit jeweils 500 µL 3,7 % Formaldehyd, um die Zellen zu fixieren. Inkubieren Sie den Objektträger bei Raumtemperatur für 20 Minuten und entsorgen Sie anschließend den Formaldehyd. Waschen Sie jedes Loch mit jeweils 500 µL PBS, um Makrophagen zu permeabilisieren, gefolgt von 500 µL Triton X. Nach einer fünfminütigen Inkubation entfernen Sie Triton X und waschen das Loch erneut mit PBS.Zerlegen Sie die Kammerplatte vorsichtig mithilfe eines Kammerentferners und eines Air-Rider-Slides. Geben Sie einen Tropfen Vector Shield-Montagemedium, das DPI enthält, auf jeden Sektor der Platte, setzen Sie eine Deckglasabdeckung auf und versiegeln Sie die Ränder mit Nagellack. Betrachten Sie die sichtbaren Zellen unter einem konfokalen Mikroskop. Hier gezeigt sind repräsentative konfokale Aufnahmen von TP1-Makrophagen, die mit GFE, das den Wildtyp Canida, exprimierenden Laborzellen infiziert wurden. Eine etwa sechsfache Zunahme der Anzahl intrazellulärer e-Zellen von zwei auf 24 Stunden deutet auf die Replikation von Canida in TP1-Makrophagen hin. Die Signatur-Tag-Mutagenese ist eine weit verbreitete Methode zur Identifizierung von Virulenzfaktoren bei mikrobiellen Pathogenen, bei der eine große Anzahl von Mutanten gleichzeitig mittels eindeutiger Oligonukleotidsequenz-Tags auf Wachstumsdefekte untersucht wird.Hier beschreiben wir unser Protokoll für den STM-Screen der Canada-Bibliothek und der Mutantenbibliothek, das aus den folgenden drei Schritten besteht. Zunächst werden 96 Plasmide, von denen jedes eine einzigartige Oligonukleotidsequenzstapel enthält, auf einer Nylonmembran immobilisiert.Im zweiten Schritt wird ein Pool aus 96 CANIDA-Atoxoplasma-Mutanten auf veränderte Überlebensprofile in THP-1-Makrophagen untersucht, gefolgt von der Gewinnung von in Makrophagen internalisierten Mutanten-Zellen nach Wachstum in YPD, die jeweils als Input- und Output-Proben bezeichnet werden. Abschließend werden die DNA-Signatur-Tags aus den Input- und Output-Genom-DNA-Proben mittels PCR amplifiziert und radioaktiv markiert. Die PCR-Produkte werden an spezifische Tags hybridisiert, und die radioaktiven Signale auf der Membran werden quantifiziert und analysiert.Um die 96-12-Dot-Board-Vorrichtung zusammenzubauen, legen Sie eine feuchte Nylonmembran auf ein feuchtes Wattestäbchen-Papier und ziehen die Schrauben der Einheit fest. Waschen Sie die Membran mit steriler Wasser, gefolgt von einer Wäsche mit 0,4 M Natriumhydroxid. Übertragen Sie 200 Nanogramm PLA-bDNA-Lösung von dem 96-12-Block in die entsprechenden Vertiefungen des Dot-Blot-Apparats nach einer Wäsche mit 0,4 M Natriumhydroxid.Entfernen Sie die Membran nach einer Ferenz zweier XXSC, bei der die übertragene Plasmas BDNA in einem UV-Vernetzungsgerät auf die Membran übertragen wurde, aus der Tropfenblutvorrichtung. Inkubieren Sie die Membranen in antenellarem Prähybridisierungspuffer und UNE-Flaschen zwei Stunden bei 42 Grad Celsius. Bereiten Sie radioaktive Sonden durch PCR unter Verwendung von genomischer DNA vor, die aus Eingangs- und Ausgangszellpaletten extrahiert und mit Primern gegen den invertierten flankierenden Bereich eindeutiger Tags amplifiziert wurde.Denaturieren Sie die Radio-Label-Proben bei 99 °C fünf Minuten lang und kühlen Sie das Gel anschließend abrupt auf Eis ab. Überführen Sie die denaturierten Proben in Eingangs- und Ausgangsgefäße und inkubieren Sie sie 14 bis 16 Stunden bei 42 °C. Nach der Hybridisierung.Spülen Sie die Eingangs- und Ausgangsmembranen, wie im Protokoll beschrieben. Nehmen Sie die Membranen aus den Flaschen, lassen Sie sie an der Luft trocknen und belichten Sie sie auf einen Phospho-Imager-Screen. Nach zwei bis drei Stunden scannen Sie den Phosphor-Screen und nehmen die Bilder auf.In diesem Beispiel werden zwei hybridisierte Membranfilter gezeigt, die die Untersuchung eines Pools von 96 Canida-Gatory-Mutanten auf verändertes Überleben darstellen. Bei der Quantifizierung in Makrophagen und der Bestimmung des Verhältnisses der Signalintensität jedes Flecks auf der Output- zu der Input-Membran zeigte sich, dass die Tag-Nummern 13, 26, 75 und 85 im Output unterrepräsentiert sind. Diese Felder sind rot umkreist und spiegeln das Wachstum von vier verschiedenen Mutanten wider.Im Gegensatz dazu sind Mutanten mit den einzigartigen Sequenzen 11 und 81, die grün hervorgehoben sind, in der Ausgangsprobe überrepräsentiert. Mit anderen Worten: Aus diesem Screening ergibt sich, dass aus einem Pool von 96 Mutanten zwei Mutanten das Überleben erhöhen sollten, während vier Mutanten ein Wachstum in Makrophagen zeigen. Die in einem solchen Poolscreen identifizierten veränderten Überlebensphänotypen sollten in Einzelinfektionsassays verifiziert werden.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man ein in-vitro-Oralsystem zur Untersuchung des intraoralen Wachstumsprofils des pilzlichen Krankheitserregers Ihrer Wahl etabliert. Außerdem sollten Sie nun in der Lage sein, mithilfe dieses Systems eine großangelegte Mutantenpool-Screening durchzuführen.

establishment-an-vitro-system-to-study-intracellular-behavior-candida

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Source: Montefusco-Pereira, C. V. et al. P. aeruginosa Infected 3D Co-Culture of Bronchial Epithelial Cells and Macrophages at Air-Liquid Interface for Preclinical Evaluation of Anti-Infectives. J. Vis. Exp.(2020)This video demonstrates a co-culture model of bronchial epithelial cells and macrophage-like cells at the air-liquid interface to study host-pathogen interactions. Pathogenic bacterial infection compromises epithelial membrane integrity, triggering macrophage-like cell activation and...

Establishing a Co-Culture Model to Study Host-Pathogen Interactions at the Air-Liquid Interface

Source: Lê-Bury, G., et al. Phagosome Migration and Velocity Measured in Live Primary Human Macrophages Infected with HIV-1. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates live confocal imaging of HIV-1-infected human macrophages to visualize and quantify phagosome migration using GFP fluorescence and bright field tracking, providing insights into how HIV alters intracellular trafficking during Fc receptor–mediated phagocytosis.

Live Imaging of Phagosome Migration in HIV-1-Infected Human Macrophages

In diesem Video führen wir den mikroglialen Phagozytose-Assay für Neuroblastome mit induzierten pluripotenten Stammzellen durch. Der Assay hilft bei der Beurteilung der Beeinträchtigung der Mikrogliafunktion bei neurodegenerativen Erkrankungen.

Mikroglia-Phagozytose-Assay: Ein In-vitro-Assay zur Etablierung eines Mikroglia-Phagozytose-Modells für Neuroblastomzellen unter Verwendung von iPSC-Makrophagen

In diesem Video demonstrieren wir den Efferozytose-Assay, um die Clearance apoptotischer Zellen mittels konfokaler Mikroskopie zu untersuchen. Die Efferozytose ist ein mehrstufiger Prozess, bei dem apoptotische Zellen von Fresszellen verschlungen und in Vesikel, den sogenannten Efferosomen, abgebaut werden. Dieses Protokoll bietet eine Methode zur Visualisierung internalisierter und nicht-internalisierter Teile einzelner apoptotischer Zellen und zur Quantifizierung der Efferozytose.

Fixierter Zell-Efferozytose-Assay: Eine Methode zur Untersuchung der efferozytären Aufnahme apoptotischer Zellen durch Makrophagen mittels Fluoreszenzmikroskopie

Dieses Video zeigt einen Assay zur Quantifizierung des intrazellulären Wachstums von Parasiten in aus dem Knochenmark stammenden Makrophagen (BMMs). Die Makrophagenzellen sind mit den beweglichen und nicht-beweglichen invasiven Stadien der Leishmanien, metazyklischen Promastigoten bzw. Amastigoten infiziert. Die Parasiten dringen in die Makrophagen ein, werden in einer parasitophoren Vakuole internalisiert und vermehren sich im Inneren. Das intrazelluläre Parasitenwachstum wird unter Verwendung...

Ein in vitro Assay zur Quantifizierung des intrazellulären Wachstums von Parasiten in Makrophagen

Live-cell Video Mikroskopie Pilzpathogenentwicklung Phagozytose

Efferocytosis, die phagocytic Entfernung der Apoptotic Zellen ist erforderlich, um die Homöostase und wird erleichtert durch die Rezeptoren und Signalwege, die für die Anerkennung, Engulfment und Internalisierung der Apoptotic Zellen ermöglichen. Hier präsentieren wir ein Fluoreszenz-Mikroskopie-Protokoll für die Quantifizierung des Efferocytosis und die Aktivität der Efferocytic Signalwege.

Quantifizierung der Efferocytosis durch einzellige Fluoreszenz-Mikroskopie

Der Mechanismus, der mit Phagozytose bei Leishmanien-Infektionen verbunden ist, ist noch wenig verstanden. Hier beschreiben wir Methoden, um die frühen Ereignisse zu bewerten, die während der Leishmania-Interaktion mit den Wirtszellen auftreten.

Untersuchung der Phagozytose der Leishmanie mittels konfokaler Mikroskopie

Die Technik der Phagozytose von Pilzkonidien durch Makrophagen wird häufig für Studien verwendet, die die Modulation der Immunantwort gegen Pilze untersuchen. Der Zweck dieses Manuskripts ist es, eine Methode zur Bewertung der Phagozytose- und Clearance-Fähigkeiten von mononuklearen Makrophagen aus humanem peripherem Blut vorzustellen, die mit Trichoderma stromaticum conidia stimuliert wurden.

Viabilitätstest von Trichoderma stromaticum-Konidien in mononuklear gewonnenen Makrophagen des menschlichen peripheren Blutes

Monozyten und Makrophagen sind sehr plastische und reprogrammierbare Immunzellen, die für Gesundheit und Krankheit entscheidend sind. Sie spüren und reagieren auf ein breites Spektrum von Reizen, indem sie spezifische Differenzierungsprogramme und Phänotypen übernehmen. Wir haben ein In-vitro-Modell standardisiert, um die Polarisation und Reprogrammierung von Makrophagen zu untersuchen, was ein wertvolles Werkzeug für die Forschung darstellt.

Reprogrammierungsmodell von humanen Monozyten-abgeleiteten Makrophagen für In-vitro-Assays

Angesichts der begrenzten Xenotransplantat-Modelle, die zur Untersuchung von Interaktionen zwischen humanen CART- und myeloischen Zellen zur Verfügung stehen, haben wir in vitro und in vivo Modelle etabliert, um die Auswirkungen menschlicher Makrophagen auf CART-Zellen zu verstehen. Die Ergebnisse können möglicherweise verallgemeinert werden, um die Rolle von Makrophagen in der Tumormikroumgebung zu bewerten und Makrophagen-gezielte Immuntherapien zu testen.

Untersuchung der Wechselwirkungen zwischen myeloischen Zellen und CAR-T-Zellen in vitro und in vivo

Erfahren Sie, wie Sie ein In-vitro-Modell zur Untersuchung des intrazellulären Verhaltens von Candida glabrata in menschlichen THP-1-Makrophagen etablieren. Diese Methode ermöglicht die Analyse von Virulenzmechanismen und Immunantworten.

Einrichtung einer

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