Einrichtung einer In-vitro- System zur intrazelluläre Verhalten der Studie Candida glabrata Menschen THP-1-Makrophagen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, ein in vitro Kulturmodellsystem zu etablieren, um das intrazelluläre Verhalten eines humanen opportunistischen Pilzerregers zu untersuchen. Canida Laborratta in Makrophagen, die aus der humanen monozytären Zelllinie TP one gewonnen wurden. Um dies zu erreichen, werden die Monozyten zunächst mit vier Estern behandelt, um sie zu Makrophagen zu differenzieren.

Als nächstes werden THP 1-Makrophagen zwei Stunden nach der Infektion mit Canida-GTA-Zellen infiziert. Nicht phagozytierte canida-GTA-Zellen werden mit PBS-Waschmaschinen entfernt und intrazelluläre E-Zellen werden für weitere Studien durch Osmos von infizierten Makrophagen gewonnen. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um sowohl die viralen zu Canida-GTA-Zellen in Makrophagen als auch die Faiz-Reifungs-Ross- und Zytokinantwort in THP auf Makro-FIDS nach einer Candida-GTA-Infektion zu bewerten.

Darüber hinaus kann dieses Protokoll hochskaliert werden, um die Candida-Collaborator-Mutantenbibliothek auf veränderte Überlebensprofile in TSP one-Makrophagen in einer Semi-Hochdurchsatz-Weise zu screenen. Der Hauptvorteil dieses Protokolls besteht darin, dass es relativ kostengünstig, hochreproduzierbar und leicht an verschiedene Immunzellen sowie Pilzpathogene anpassbar ist. Um das Verfahren zwei Tage vor der Infektion zu beginnen, bringen Sie THP- und monozytäre Zellen am ersten Tag auf 80 % CO, nehmen Sie das Kulturrisiko heraus und bringen Sie langsam und sanft alle feinstofflichen Zellen in Suspension.

Übertragen Sie die DHP-Monozyten-Zellsuspension in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen. Zentrifugieren Sie die Zelle Suspension bei Raumtemperatur für vier Minuten Bei 1000 U/min Deccan das Medium in einen Abfallbehälter mit fünf ml Pre-API-Medium in das Röhrchen und reus. Suspendieren Sie das THV-Ein-Zellen-Pellet, indem Sie das Medium vorsichtig drei- und viermal pipettieren.

Nehmen Sie 10 Mikroliter der Zellsuspension, um die Zelldichte mit einem Hämozytometer zu bestimmen, und stellen Sie die Zelldichte auf 1 Million Zellen pro ml ein. Geben Sie einen Mikroliter einer 60 Mikromolaren PMA-Stammlösung in die Zellsuspension, so dass die Endkonzentration 16 anomolar beträgt, und mischen Sie es gut. Geben Sie einen ml Zellsuspension, was 1 Million Zellen entspricht, in jede Vertiefung einer 24-Well-Gewebekulturplatte und überführen Sie sie in einen Inkubator, der auf 37 Grad Celsius und 5 % CO2 eingestellt ist.

Entsorgen Sie nach 12 Stunden Inkubation das alte Medium. Geben Sie jeweils einen ml Pre-RPI-Medium in die Vertiefung und inkubieren Sie die Platte weitere 12 Stunden lang. Diese Zellen werden für die kanadische Infektion verwendet, die später gezeigt wird.

Unter Anwendung geeigneter mikrobiologischer Verfahren wird eine einzelne EA-Kolonie in ein Flass geimpft, das ML YPD-Medium enthält. Inkubieren Sie das Gebläse 14 bis 16 Stunden lang in einem Inkubator bei 30 Grad Celsius nach der Inkubationszentrifuge. Eine ML-Kultur bei 4.000 U/min für fünf Minuten.

Entsorgen Sie das Sup Natin und waschen Sie die Schalen dreimal mit sterilem PBS. Nachdem Sie den Waschpuffer verworfen haben, suspendieren Sie die Zellpalette durch vorsichtiges Pipettieren in einem ml sterilem PBS. Messen Sie anschließend die Absorption der Zellsuspension in einem Spektralphotometer bei 600 Nanometern und stellen Sie die Zelldichte mit PBS auf 2 Millionen Zellen pro ml ein.

Nehmen Sie 50 Mikroliter der Zellsuspension und verdünnen Sie hundertfach in der PBS-Streuplatte hundert Mikroliter Kultur auf YPD AGA-Medium. Inkubieren Sie die Platte bei 30 Grad Celsius und zählen Sie die Anzahl der Kolonien, die nach ein oder zwei Tagen auf der YPD-Platte erschienen sind, multiplizieren Sie diese Zahl mit dem entsprechenden Verdünnungsfaktor, um die Null-Stunden-Koloniebildungseinheiten zu berechnen. Diese vielen koloniebildenden Einheiten von Canada Reta werden verwendet, um DHE auf Makrophagen zu infizieren.

Im nächsten Schritt fügen Sie 50 Makroliter Kanada-Claterzellsuspension zur Makrophagen-Monoschicht in einer 24-Wal-Kulturplatte hinzu. Verschmutzen Sie die Platte, um die Zellen gleichmäßig zu verteilen, und inkubieren Sie sie nach zweistündiger Inkubation bei 37 Grad Celsius. Verwerfen Sie das Medium, indem Sie die Kulturplatte in einen Behälter zu jeder Vertiefung der Kulturplatte bei ml serial PBS umdrehen, vorsichtig an der Seite der Vertiefung entlang und entsorgen Sie den Puffer.

Wiederholen Sie diesen Schritt noch zweimal. Geben Sie als nächstes, mit Ausnahme der ersten Vertiefung, ein ML-RPI-Medium zu allen anderen Vertiefungen, das zur Überwachung der intrazellulären Replikation von Candida-Zellen 4, 6, 12 und 24 Stunden nach der Infektion verwendet werden kann, um intrazelluläre E-Zellen nach zwei Stunden Makrophageninfektion wiederherzustellen, ein ML Getreidewasser zum Phos hinzu. Nun, nach zwei Minuten kratzen Sie die Vertiefung vorsichtig mit der einen ML-Piper-Spitze ab, um die Makrophagenreste aus der Vertiefung zu entfernen.

Spülen Sie die Vertiefung aus und sammeln Sie sie in einem Makrozentri-Fischröhrchen. Bereiten Sie eine hundertfache Verdünnung des microFIT-Zelllysats in PBS vor und plattieren Sie hundert Mikroliter auf YPD AGA-Medium. Inkubieren Sie die Platte ein bis zwei Tage lang bei 30 Grad Celsius und zählen Sie die Anzahl der koloniebildenden Einheiten.

Multiplizieren Sie diese Zahl mit dem entsprechenden Verdünnungsfaktor, um die Anzahl der Canida-ator-Zellen aufzuzählen, die nach einer zweistündigen Infektion durch T zwei und Makrophagen phagozytiert werden. Ebenso kann die Anzahl der intrazellulären Canida-atorzellen zu unterschiedlichen Zeitpunkten bestimmt werden. Die postinfektionelle und intrazelluläre Replikation kann als eine Zunahme der nach 24 Stunden im Vergleich zu den hier nach zwei Stunden internalisierten KBE dargestellt werden.

Weitere Ergebnisse eines typischen Experiments, bei dem die Gesamtzahl der Canida-Alligatorzellen, die mit TV-1-Makrophagen infiziert sind, sechs mal 10 beträgt, zwei pro vier. Die Anzahl der nach zwei Stunden geborgenen Zellen beträgt 3,7, sechsmal 10,4. Dies zeigt, dass E-Zellen während der 24-stündigen Co-Inkubationszeit mit einer Rate von 62,66% phagozytiert werden.

Können andere Zellen als eine 5,2-fache Replikation, da die Anzahl der intrazellulären E-Zellen von 3,76 mal 10,4 auf 1,96 mal 10,5 zunahm. In diesem Experiment kann die intrazelluläre Replikation von Canida-TER-Zellen auch mit GFP-exprimierenden E-Zellen beurteilt werden, während dafür ein konfokales Mikroskop verwendet wird. Bereiten Sie THV und Makrophagen in einem Objektträger mit vier Kammern vor und infizieren Sie sie unter Verwendung des zuvor beschriebenen Protokolls für die 24-Well-Kulturplatte.

Zwei Stunden nach der Infektion. Entsorgen Sie das Medium, indem Sie den Objektträger in einen Abfallbehälter mit 500 Mikrolitern PBS in jede Kammer des Objektträgers umdrehen. Gut ausspülen und PBS entsorgen.

Wiederholen Sie diesen Schritt noch zwei Mal bei 500 Mikrolitern von 3,7% formaler Höhe, um die Zellen zu fixieren. Inkubieren Sie die Folie 20 Minuten lang bei Raumtemperatur und entsorgen Sie die formale Höhe. Waschen Sie jeden Well-Preis mit 500 Mikroliter PBS, um Makrophagen bei 500 Mikroliter Triton X nach fünf Minuten Inkubation zu permeieren, entfernen Sie Triton X und waschen Sie den Well-Strike mit PBS.

Zerlegen Sie den Kammerschieber vorsichtig mit einem Kammerausbau und einem Air-Rider-Schieber. Geben Sie einen Tropfen vector Shield Eindeckmedium mit DPI auf jeden Sektor des Objektträgers, montieren Sie ein Deckglas und versiegeln Sie die Ränder mit Nagellack, sichtbare Zellen unter einem konfokalen Mikroskop. Hier sind die repräsentativen konfokalen Bilder von TP-1-Makrophagen zu sehen, die mit GFE-exprimierenden Wildtyp-Canida-Laborzellen infiziert sind. Eine etwa sechsfache Erhöhung der Anzahl intrazellulärer E-Zellen von zwei auf 24 Stunden ist ein Hinweis auf eine Canida-Laborreplikation in TP-1-Makrophagen. Der Signatur-Tag-Mutagenese-Ansatz wird häufig verwendet, um Ulence-Faktoren in mikrobiellen Krankheitserregern zu identifizieren, wobei eine große Anzahl von Mutanten gleichzeitig über ein einzigartiges Oligonukleotid auf Wachstumsdefekte untersucht wird Sequenz-Tag.

Hier beschreiben wir unser Protokoll für das STM-Screening der Canada Library und der Mutantenbibliothek, das aus den folgenden drei Schritten besteht. Die ersten 96 Plasmide. Jeder mit einem einzigartigen Oligonukleotid-Sequenzstapel ist auf einer Nylonmembran immobilisiert.

Im zweiten Schritt wird ein Pool von 96 CANIDA-ator-Mutanten auf veränderte Überlebensprofile in THV-1-Makrophagen untersucht, gefolgt von der Wiedergewinnung von YPD-, gewachsenen und Makrophagen-internalisierten Mutanten-e-Zellen, die als Input- bzw. Output-Proben bezeichnet werden. Schließlich werden DNA-Signatur-Tags PCI-amplifiziert und per Radio aus genomischen DNA-Eingabe- und Ausgabe-DNA-Proben markiert. Das PCR-Produkt wird mit einzigartigen Tags hybridisiert und radioaktive Signale auf der Membran werden quantifiziert und analysiert.

Um das 96 12-Punkt-Board-Gerät zusammenzubauen, legen Sie eine nasse Nylonmembran auf ein feuchtes Wechselwindbaumpapier und ziehen Sie die Schrauben des Geräts fest. Waschen Sie die Membran mit sterilem Wasser, gefolgt von einer Wäsche mit 0,4 mu Natriumhydroxid. Übertragen Sie 200 Nanogramm PLA BDNA-Lösung aus dem Block 96 12 in die entsprechenden Vertiefungen des Punktblut-Apptus Nach einer 0,4-molaren Natriumhydroxid-Wäsche.

Entfernen Sie die Membran aus dem Punktblutapparat nach einer Ferenz in zwei XXSC, bei der die übertragene Plasma-BDNA in einem UV-Vernetzer mit der Membran gekreuzt wurde. Inkubieren Sie die Membran in Antennen-Prähybridisierung, Puffer und Eingangs- und UNE-Flaschen für zwei Stunden bei 42 Grad Celsius. Bereiten Sie Radio-Level-Sonden mittels PCR mit genomischer DNA vor, die aus Eingangs- und Ausgangszellpaletten extrahiert wurde, sowie Primer gegen den invertierten flankierenden Bereich einzigartiger Tags.

Denaturieren Sie die Radiomarkierungssonden fünf Minuten lang bei 99 Grad Celsius und schnappen Sie das Gel auf Eis. Die De-Sonden werden in Ein- und Ausgabeflaschen umgefüllt und 14 bis 16 Stunden bei 42 Grad Celsius inkubiert. Nach der Hybridisierung.

Waschen Sie die Ein- und Ausgangsmembranen wie im Protokoll beschrieben. Nehmen Sie die Membranen aus den Flaschen, trocknen Sie sie an der Luft und setzen Sie sie einem Phosphobild-Bildschirm aus. Scannen Sie nach zwei bis drei Stunden das Phosphorsieb und nehmen Sie Bilder auf.

In diesem Beispiel sind zwei hybridisierte Membranfilter zu sehen, die das Screening eines Pools von 96 canida Gatory-Mutanten auf ein verändertes Überleben darstellen. In thv one ergab die Quantifizierung und Bestimmung des Verhältnisses der Signalintensität jedes Spots auf dem Ausgang zur Eingangsmembran, dass die Tag-Nummern 13, 26, 75 und 85 im Ausgang unterrepräsentiert sind. Diese Stapel sind rot eingefasst und spiegeln das Wachstum von vier verschiedenen Mutanten wider.

Im Gegensatz dazu sind Mutantenstapel mit den eindeutigen Sequenzen 11 und 81, die grün hervorgehoben sind, in der Ausgabestichprobe überrepräsentiert. Mit anderen Worten, aus diesem Screening sollte ein Pool von 96 Mutanten das Überleben erhöhen, während vier Mutanten das Wachstum in Makrophagen aufweisen. Die veränderten Überlebensphänotypen, die in einem solchen Pool-Screening identifiziert wurden, sollten in Einzelinfektionsassays verifiziert werden.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie ein orales In-vitro-System einsetzen, um das Intrawachstumsprofil des Pilzerregers Ihres Interesses zu untersuchen. Darüber hinaus sollten Sie jetzt in der Lage sein, mit dem System groß angelegte Mutantenpool-Screenings durchzuführen.