Name: Einrichtung einer In-vitro- System zur intrazelluläre Verhalten der Studie Candida glabrata Menschen THP-1-Makrophagen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-10T20:15:00.000+00:00
Duration: 13 min 47 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie ein In-vitro-Modell zur Untersuchung des intrazellulären Verhaltens von Candida glabrata in menschlichen THP-1-Makrophagen etablieren. Diese Methode ermöglicht die Analyse von Virulenzmechanismen und Immunantworten.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Diese Arbeit wurde von Innovative Junge Biotechnologist Auszeichnung BT/BI/12/040/2005 und BT/PR13289/BRB/10/745/2009 Zuschuss von Department für Biotechnologie, Regierung von Indien und Kernfonds, des Zentrums für DNA-Fingerprinting and Diagnostics unterstützt werden, Hyderabad. MNR und GB sind die Empfänger von Junior und Senior Research Fellowships des Rates für Wissenschaftliche und Industrielle Forschung auf die Verfolgung einer Doktorgrad der Manipal University. SB ist der Empfänger von Junior und Senior Research Fellowship des Department für Biotechnologie auf die Verfolgung einer Doktorgrad der Manipal University.

Es wird empfohlen, C auszuführen glabrata Infektionsversuche im Labor mit Biosicherheitsstufe 2 (BSL-2). <ol><li> Herstellung von THP-1 Makrophagen-Monoschicht. </li><li> Vorbereitung von C. glabrata Zellsuspension. </li><li> Infektion von THP-1 Makrophagen, die mit C. glabrata-Zellen. </li><li> Messung der Phagozytose und intrazelluläre Replikationsrate über koloniebildende Einheit-Assay. </li><li> Überwachung von intrazellulären Replikation mittels konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie. </li></ol> 1. Herstellung von THP-1 Makrophagen-Monolayer <ol><li> THP-1 ist eine menschliche Monozyten-Zelllinie aus dem peripheren Blut eines 1-jährigen männlichen Kind leidet unter akuter Monozytenleukämie 14 abgeleitet. THP-1-Zelllinie wurde eine Suspension, wird routinemäßig bei 37 ° C in befeuchteter 5% CO 2 in RPMI-1640-Kulturmedium mit 10% FBS (fötales Rinderserum) ergänzt gehalten. Die Behandlung mit Phorbol 12-myristate 13-Acetat (PMA, ein Phorbolester) führt die terminale Differenzierung von THP-1 Monozyten zu Makrophagen. Wichtig ist, dass PMA-Behandlung keinen Einfluss auf die Lebensfähigkeit der Zellen und differenzierten Zellen nicht teilen. </li><li> Samen ungefähr 1,5 x 10 6 THP-1 Monozyten in 100 mm Kulturschalen in RPMI-1640-Vollmedium (RPMI-1640-Medium, ergänzt mit 10% Serum, 2 mM Glutamin und Antibiotika 1x; 10 ml / Schale) und lassen Zellen wachsen bei 37 ° C in 5% CO 2 für 2 Tage. </li><li> Sobald THP-1-Zellen haben eine Dichte von 8 x 10 5 Zellen / ml erreicht, übertragen Sie die Kulturschale zu der Zellkultur Laminarströmungshaube und schwenken Sie es ständiger Zellen resuspendieren. </li><li> Pipettieren Sie die Zellsuspension aus, legen Sie in eine 15 ml sterilen Röhrchen und Zentrifuge bei 1000 rpm (130 xg) für 4 min. Überstand verwerfen und aussetzen THP-1-Zellpellet in 5 ml frisches, vorgewärmt, RPMI-1640-Komplettmedium. </li><li> Auflisten von Zellen mit einer Zählkammer und verdünnt das cell Suspension auf eine endgültige Dichte von 10 6 Zellen / ml mit vorgewärmten RPMI 1640 Komplettmedium </li><li> 1 ul von 160 mM PMA Lager (Phorbol-12-Myristate 13-Acetat-Lösung in Dimethylsulfoxid hergestellt) in 10 ml THP-1-Zellsuspension (Endkonzentration 16 nM) und gut mischen. Verzichten 1 ml Zellsuspension in jede Vertiefung einer 24-Well-Gewebekulturplatte und inkubieren Platte in den Inkubator bei 37 ° C mit 5% CO 2 für 12 h gehalten. </li><li> Entfernen Sie alte Medium, 1 ml vorgewärmten RPMI-1640-Komplettmedium und lassen Zellen für 12 Stunden bei 37 ° C in 5% CO 2 zu erholen. </li><li> Beachten Zellen unter einem umgekehrten Mikroskop zu gewährleisten, dass ovale THP-1 Monozyten-Zellen in Suspension wurden in abgeflacht spindelförmige und haftende Makrophagen differenziert. Diese differenzierten Zellen sind nun bereit, C führen glabrata Infektionsstudien. </li></ol> 2. Vorbereitung von C. glabrata &amp; #160; Zellsuspension C. glabrata Wildtyp-Stamm Bg2 werden zur THP-1-Makrophagen infizieren werden. C glabrata Zellen in flüssigem YPD (Hefeextrakt (1%), Pepton (2%)-Dextrose (2%)) Medium routinemßig kultiviert. Solide YPD-Medium wird durch Zugabe von 2% Agar vor dem Autoklavieren Medium vorbereitet. <ol><li> Um eine Kultur von C. vorbereiten glabrata, wählen Sie eine einzelne Kolonie aus dem Agar-Platte mit einer sterilen Einweg-Schleife und impfen in 10 ml YPD-Flüssigmedium und Inkubation für 14-16 h mit Schütteln (200 rpm) bei 30 ° C </li><li> Zentrifuge dieser Kultur (1 ml) bei 4000 Upm (1800 × g) für 5 min in einer Tischmikrozentrifuge, waschen Sie die Zellen dreimal mit sterilem PBS (Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung, pH 7,4) und Aussetzung Zellpellet in 1 ml PBS. </li><li> Messung der OD 600 C. glabrata Zellsuspension verdünnt und mit einem geeigneten Volumen an steriler PBS auf eine Dichte von 2 x 10 6 Zellen / ml zu erhalten (OD 600= 0.1). Alternativ kann die gewünschte Zelldichte durch Zählen Hefezellen mit einer Zählkammer erreicht werden. </li></ol> 3. Infektion von THP-1 Makrophagen mit C. glabrata Zellen <ol><li> In 50 ul C. glabrata Zellsuspension auf THP-1-Makrophagen (10 6 Zellen pro Vertiefung einer 24-Well-Kulturplatte), um ein MOI (Multiplizität der Infektion) von 0,1 zu erhalten, und Inkubieren Platte bei 37 ° C mit 5% CO 2. </li><li> Um lebensfähig Hefe zählt zu bestimmen, verdünnte 50 ul C. glabrata Zellsuspension 100-fach in sterilem PBS und Platte 100 ul auf YPD-Festmedium. Platten bei 30 ° C und zählen die Anzahl der manuell Hefe-Kolonien nach 1-2 Tagen erscheinen. Diese Zahlen werden von nun an, wie hr 0 C bezeichnet werden glabrata KBE (koloniebildende Einheiten). </li><li> Nach 2 h Co-Kultivierung von THP-1-Zellen mit C. glabrata Zellen, Ablagekulturmedium durch Umkehren 24-Loch-Gewebekulturplatte ina Reservoir und vorsichtig waschen dreimal mit sterilem PBS auf vorgewärmten nonphagocytosed extrazellulären C entfernen glabrata-Zellen. Schonwaschschritten mit PBS sind absolut notwendig, um eine vollständige Entfernung aller extrazellulären Hefe, ohne dass Schäden an der THP-1-Makrophagen-Monolage zu erreichen. </li></ol> 4. Messung der Phagozytose und intrazelluläre Replikationsrate über Kolonie bildende Einheit Assay <ol><li> Lyse C. glabrata THP-1-infizierten Makrophagen in 1 ml sterilem H 2 O 2 min, kratzen sanft auf die Makrophagen-Ablagerungen aus dem Bohrloch zu entfernen und sammeln Zelllysat in ein Mikrozentrifugenröhrchen. Mikroskopische Prüfung von kompletten Makrophagen-Lyse ist entscheidend für die Wiederherstellung aller verinnerlicht Hefe. </li><li> Bereiten Sie eine 100-fache Verdünnung des Lysats in sterilem PBS, Platte 100 ul auf YPD-Festmedium Platten und Inkubation bei 30 ° C </li><li> Nach 1-2 Tagen rechnen manuell die Anzahl der C glabrata Kolonien, aperschien auf YPD-Medium, multiplizieren mit Verdünnungsfaktor (2 Std. KBE) und berechnen Phagozytose Geschwindigkeit, die der Prozent der C bezieht sich glabrata Zellen, THP-1 durch Makrophagen nach 2 h Koinkubation aufgenommen unter Verwendung der folgenden Formel. % Phagozytose = [(KBE bei 2 h) / (CFU bei 0 h)] x 100 </li><li> Um die Rate der intrazellulären Replikation von C messen glabrata Zellen in THP-1-Makrophagen, sammeln intrazellulären Hefe zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Infektion, dh. 4, 6, 8, 10, 12 und 24 h, durch Wiederholen der Schritte von 3,3 bis 4,3. </li><li> Berechnen fach Überleben / Replikation von C. glabrata Zellen THP-1 in Makrophagen durch Division der Gesamtzahl CFUs zu einem bestimmten Zeitpunkt mit den in 2 h (phagozytiert Hefe). </li></ol> 5. Überwachung von intrazellulären Replikation mittels konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie <ol><li> Nach den in Abschnitt 1 beschriebenen Schritte, Saatgut PMA-behandelten 5 x 10 5 THP-1-Zellen in jeder Vertiefung von zwei vier-und Kammer-Objektträgern und bei 37 ° C mit 5% CO 2 für 12 Stunden. </li><li> Ersetzen Sie alte Medium mit vorgewärmten RPMI-1640-Komplettmedium und lassen Zellen aus PMA-Behandlung für 12 Stunden zu erholen. </li><li> Bereiten GFP (green fluorescent protein)-markierten C glabrata Zellsuspension, wie in Abschnitt 2 beschrieben, und infizieren zu THP-1-Makrophagen zu einer MOI von 1. Wenn C. glabrata GFP-exprimierenden Stämme sind nicht verfügbar, Hefe-Zellen mit FITC (Fluoresceinisothiocyanat) markiert ist, kann verwendet werden, um zu überwachen frühen Ereignisse nach der Infektion nämlich. Phagozytose Rate und phagolysosomale Reifung bei 2 Stunden. </li><li> Folien für 2 Stunden bei 37 ° C mit 5% CO 2, invertieren sie sorgfältig zu waschen Medium verwerfen und 3x mit sterilem, vorgewärmtes PBS. </li><li> Add 500 ul vorgewärmten RPMI-1640-Komplett mediUM zu jeder Kammer von einer Folie und inkubieren sie bei 37 ° C mit 5% CO 2 für 22 Stunden. </li><li> Um dies zu beheben 2 h C glabrata-THP-1-infizierten Makrophagen, 500 ul 3,7% Formaldehyd (in PBS) zu jeder Kammer des anderen Schlitten und Inkubation bei Raumtemperatur für 20 Minuten im Dunkeln. </li><li> Wash schieben dreimal mit PBS, 500 ul Triton-X (0,7%), und bei Raumtemperatur für 5 min im Dunkeln. </li><li> Wash Rutsche 3x mit PBS, entfernen Kammer von Kulturträger und Luft trocknen Sie es für 3-5 min im Dunkeln. </li><li> Vorsichtig aufsetzen eines Deckglases mit Vectashield Montage-Medium mit DAPI (4 &#39;,6-Diamino-2-phenylindol) auf Folie Blasenbildung zu vermeiden. Entfernen Sie vorsichtig die überschüssige Flüssigkeit mit Kimwipe und dichten Deck Ränder mit Nagellack. Schiebespeicher im Dunkeln bei 4 ° C bis zur Verwendung. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 5,4 und von 5,6 bis 5,9 zu verarbeiten THP-1-Zellen 24 Stunden nach der Infektion. </li><li> Bildzellen unter Verwendung eines Laser-Scanning-confoMikroskope (60X Ölimmersionsobjektiv, Anregung bei 405 nm und 488 nm für DAPI und GFP-Färbung, beziehungsweise). </li></ol>

<ol><li>Pfaller, M. A., Diekema, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiology+of+Invasive+Candidiasis%3A+a+Persistent+Public+Health+Problem%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Microbiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Epidemiology of Invasive Candidiasis: a Persistent Public Health Problem.</a> Clin. Microbiol. Rev. 20 (1), 133-163 (2007).</li>
<li>Pfaller, M. A., Diekema, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Results+from+the+ARTEMIS+DISK+global+antifungal+surveillance+study%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Results from the ARTEMIS DISK global antifungal surveillance study.</a> J. Clin. Microbiol. 48 (4), 1366-1377 (1997).</li>
<li>Chakrabarti, A., Chatterjee, S. S., Shivaprakash, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview+of+opportunistic+fungal+infections+in+India%5BTitle%5D)+AND+%22Jpn.+J.+Med.+Mycol%22%5BJournal%5D)">Overview of opportunistic fungal infections in India.</a> Jpn. J. Med. Mycol. 49 (3), 165-172 (2008).</li>
<li>Kaur, R., Domergue, R., Zupancic, M. L., Cormack, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+yeast+by+any+other+name%3A+Candida+glabrata+and+its+interaction+with+the+host%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A yeast by any other name: Candida glabrata and its interaction with the host.</a> Curr. Opin. Microbiol. 8 (4), 378-384 (2005).</li>
<li>Silva, S., Negri, M., Henriques, M., Oliveira, R., Williams, D. W., Azeredo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Candida+glabrata%2C+Candida+parapsilosis+and+Candida+tropicalis%3A+biology%2C+epidemiology%2C+pathogenicity+and+antifungal+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Candida glabrata, Candida parapsilosis and Candida tropicalis: biology, epidemiology, pathogenicity and antifungal resistance.</a> FEMS Microbiol. Rev. 36 (2), 288-305 (2012).</li>
<li>Kaur, R., Ma, B., Cormack, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+family+of+glycosylphosphatidylinositol-linked+aspartyl+proteases+is+required+for+virulence+of+Candida+glabrata%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A family of glycosylphosphatidylinositol-linked aspartyl proteases is required for virulence of Candida glabrata.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (18), 7628-7633 (2007).</li>
<li>Seider, K., Brunke, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+facultative+intracellular+pathogen+Candida+glabrata+subverts+macrophage+cytokine+production+and+phagolysosome+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The facultative intracellular pathogen Candida glabrata subverts macrophage cytokine production and phagolysosome maturation.</a> J. Immunol. 187 (6), 3072-3086 (2011).</li>
<li>Rai, M. N., Balusu, S., Gorityala, N., Dandu, L., Kaur, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+genomic+analysis+of+Candida+glabrata-macrophage+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Functional genomic analysis of Candida glabrata-macrophage interaction.</a> PLoS Pathog. 8 (8), e1002863(2012).</li>
<li>Roetzer, A., Gratz, N., Kovarik, P., Schüller, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+supports+Candida+glabrata+survival+during+phagocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Autophagy supports Candida glabrata survival during phagocytosis.</a> Cell Microbiol. 12 (2), 199-216 (2010).</li>
<li>Theus, S. A., Cave, M. D., Eisenach, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activated+THP-1+Cells%3A+an+attractive+model+for+the+assessment+of+intracellular+growth+rates+of+Mycobacterium+tuberculosis+isolates%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Activated THP-1 Cells: an attractive model for the assessment of intracellular growth rates of Mycobacterium tuberculosis isolates.</a> Infect. Immun. 72 (2), 1169-1173 (2004).</li>
<li>Murayama, T., Ohara, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Cytomegalovirus+induces+Interleukin-8+production+by+a+human+monocytic+cell+line%2C+THP-1%2C+through+acting+concurrently+on+AP-1-+and+NF-kB-binding+sites+of+the+Interleukin-8+gene%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Human Cytomegalovirus induces Interleukin-8 production by a human monocytic cell line, THP-1, through acting concurrently on AP-1- and NF-kB-binding sites of the Interleukin-8 gene.</a> J. Virol. 71 (7), 5692-5695 (1997).</li>
<li>Gross, O., Poeck, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Syk+kinase+signalling+couples+to+the+Nlrp3+inflammasome+for+anti-fungal+host+defence%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Syk kinase signalling couples to the Nlrp3 inflammasome for anti-fungal host defence.</a> Nature. 459, 433-436 (2009).</li>
<li>Auwerx, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+leukemia+cell+line%2C+THP-1%3A+a+multifacetted+model+for+the+study+of+monocyte-macrophage+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Experientia%22%5BJournal%5D)">The human leukemia cell line, THP-1: a multifacetted model for the study of monocyte-macrophage differentiation.</a> Experientia. 47 (1), 22-31 (1991).</li>
<li>Tsuchiya, S., Kobayashi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+maturation+in+cultured+human+monocytic+leukemia+cells+by+a+phorbol+diester%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Induction of maturation in cultured human monocytic leukemia cells by a phorbol diester.</a> Cancer Res. 42 (4), 1530-1536 (1982).</li>
<li>Castaño, I., Kaur, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tn7-based+genome-wide+random+insertional+mutagenesis+of+Candida+glabrata%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Tn7-based genome-wide random insertional mutagenesis of Candida glabrata.</a> Genome Res. 13 (5), 905-915 (2003).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Angeborene Immunsystem spielt eine wichtige Rolle bei der Kontrolle von opportunistischen Pilzinfektionen. Makrophagen tragen zur Verteidigung durch die Einnahme und Zerstörung der Pilzerreger Antimykotika. Somit wird Aufklärung von Faktoren, die für das Überleben und / oder Bekämpfung der antimikrobiellen Funktionen erforderlich sind Makrophagen unser Verständnis von Pilz Virulenz Strategien voraus. In diesem Zusammenhang haben wir ein in-vitro-Zellkultur-Modellsystem unter Verwendung von Makrophagen aus einem...

Candida-Spezies sind die führende Ursache von lebensbedrohlichen invasiven Pilzinfektionen bei immunsupprimierten Patienten ein. Candida glabrata, einer aufstrebenden nosokomiale Erreger, ist die zweite oder dritte am häufigsten isolierten Candida-Spezies aus Intensivstation Patienten, abhängig von der geographischen Lage 3.1. Phylogenetisch, C. glabrata, einem haploiden Hefezellen, enger mit den nicht pathogenen Modell Hefe Saccharomyces cerevisiae als pathogene Candida spp. einschließlich C. 4 albicans. In Übereinstimmung damit, C. glabrata fehlen einige Schlüsselpilz Virulenz inklusive Gegen, sekretierten proteolytischen Aktivität und morphologische Plastizität 4-5. Obwohl C. glabrata bildet keine Hyphen, es zu überleben und zu replizieren in murinen und humanen Makrophagen 6-8 was darauf hindeutet, dass es einzigartig Pathogenese-Mechanismen entwickelt wurden, können. Nur begrenzte Informationen über die Strategien zur Verfügung, die C. glabrata beschäftigt, um zu überleben nährstoffarmen intrazellulären Makrophagen Umwelt und oxidative und nicht-oxidative entgegenzuwirken Wirtsreaktionen von Immunzellen 5 montiert. Ein entsprechendes Modell Makrophagen-System ist eine Voraussetzung, um die Wechselwirkung von C abgrenzen glabrata mit Wirts Phagozyten über funktionelle Genom-und Proteom-Ansätzen. Periphere mononukleare Blutzellen (PBMCs) und Knochenmark-abgeleiteten Makrophagen (BMDMs) des humanen und murinen Ursprungs sind, sind früher verwendet worden, um die Wechselwirkung von C zu studieren glabrata mit Wirtsimmunzellen 7,9. , Schwierigkeiten bei der Beschaffung von PBMCs und BMDMs, ihre begrenzte Lebensdauer und intrinsische Unterschiede zwischen den verschiedenen Säugetier Spender beschränken jedoch die Verwendung dieser Zellen als vielseitige Modellsysteme. Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Etablierung eines in vitro-System, das intracellul studierenar Verhalten von C. glabrata Zellen in Makrophagen aus menschlichen Monozyten-Zelllinie THP-1 abgeleitet. Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls war es, eine einfache, kostengünstige, schnelle und reproduzierbare Zellkultur-Modellsystem, die leicht manipuliert werden kann, um verschiedene Aspekte der Wirt-Pilz-Pathogen-Interaktion untersuchen zu erlassen. THP-1-Zellen wurden bereits verwendet, um die Immunantwort gegen eine Vielzahl von Krankheitserregern wie Bakterien, Viren und Pilze 10-12 entziffern. Monozytären THP-1-Zellen sind leicht zu pflegen und kann unterschieden werden, bei Phorbolester-Behandlung, um Makrophagen, Monozyten-Makrophagen der menschlichen Mimik und Express entsprechenden Makrophagen-Marker 13. Die wichtigsten Vorteile der THP-1-Makrophagen-Modellsystem sind die einfache Bedienbarkeit und das Fehlen von hoch entwickelten Geräten Anforderung. Die hier vorgestellte Protokoll ist leicht anpassbar, um die Interaktion von anderen menschlichen Pilzerreger mit hos studierenT-Immunzellen. Das derzeitige Verfahren kann auch eingesetzt werden, um Virulenzfaktoren für die Krankheitserreger von Interesse mit hohem Durchsatz nach Mutanten zu identifizieren. Diese Proof-of-concept wurde durch die erfolgreiche Anwendung von THP-1-Kulturmodellsystem, um einen Satz von 56 Genen, die für das Überleben von C. glabrata in humanen Makrophagen 8 erforderlich sind beispielhaft zu identifizieren.

<table><tbody><tr><td>THP-1</td><td>American Type Culture Collection</td><td>TIB 202</td><td>Humane Zelllinie für akute monozytäre Leukämie</td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Hyclone</td><td>SH30096.01</td><td>Zur Erhaltung von THP-1-Zellen</td></tr><tr><td>Phorbol 12-Myristat 13-acetat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P 8139</td><td>Vorsicht: Gefährlich</td></tr><tr><td></td><td>BD-Difco</td><td>242710</td><td>Für die Züchtung von Candida glabrata</td></tr><tr><td>Zellen Formaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8775</td><td>Zur Fixierung von C. glabrata-infizierten THP-1-Makrophagen</td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)</td><td></td><td></td><td>Puffer (137 mM NaCl, 10 mM Phosphat, 2,7 mM KCl, pH 7,4) für Waschungen</td></tr><tr><td>Kochsalz-Natriumcitrat (SSC)</td><td></td><td></td><td>Puffer (3 M NaCl, 0,3 M Natriumcitrat für 20-fache Konzentration) für Waschmittel</td></tr><tr><td>Prähybridisierungspuffer</td><td></td><td></td><td>Puffer (50 % Formamid, 5x Denhardt' s-Lösung, 5x SSC, 1% SDS) für die Hybridisierung</td></tr><tr><td>VECTASHIELD Eindeckmedium</td><td>Vector Labs</td><td>H-1200</td><td>Zum Einbetten von Objektträgern für die konfokale Mikroskopie</td></tr><tr><td>32P-markiert &alpha;-dCTP</td><td>JONAKI-BARC</td><td>LCP-102</td><td>Für die Radiomarkierung von Signaturmarkierungen</td></tr><tr><td>100 mm Gewebekulturschalen</td><td>Corning</td><td>430167</td><td>Zur Kultivierung von THP-1-Zellen</td></tr><tr><td>24-Well-Gewebekulturplatte</td><td>Corning</td><td>3527</td><td>Zur Durchführung von C. glabrata-Infektionsstudien an THP-1-Makrophagen</td></tr><tr><td>4-Kammer-Gewebekultur-behandelter Glasobjektträger</td><td>BD Falcon REF354104</td><td></td><td>Zur Abbildung von C. glabrata-infizierten THP-1-Makrophagen</td></tr><tr><td>Hämozytometer</td><td>Rohem, Indien</td><td></td><td>Für die Zählung von Zellen</td></tr><tr><td>Tisch-Mikrozentrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>Microfuge 18</td><td>Zum Schleudern von Zellen in Mikroröhrchen</td></tr><tr><td>Tischzentrifuge</td><td>Remi</td><td>R-8C</td><td>Zum Schleudern von Zellen in 15-ml-Röhrchen</td></tr><tr><td>Spektralphotometer</td><td>Amersham Biosciences</td><td>Ultraspec 10</td><td>Zur Überwachung der Absorption von Hefezellen</td></tr><tr><td>Platteninkubator</td><td>Labtech</td><td>Refrigerated</td><td>Zum Züchten von C. glabrata Zellen</td></tr><tr><td>Shaker-Inkubator</td><td>New Brunswick</td><td>Innova 43</td><td>Zur Züchtung von C. glabrata-Zellen</td></tr><tr><td>Wasserummantelte CO2&nbsp; Inkubator</td><td>Thermo Electron Corporation</td><td>Forma series 2</td><td>Zur Kultivierung von THP-1-Zellen</td></tr><tr><td>Konfokales Mikroskop</td><td>Carl Ziess</td><td>Ziess LSM 510 meta</td><td>Zur Beobachtung von C. glabrata-infizierten THP-1-Makrophagen</td></tr><tr><td>Zusammengesetztes Mikroskop</td><td>Olympus</td><td>CKX 41</td><td>Zur Beobachtung von C. glabrata und THP-1-Makrophagen PCR-Maschine</td></tr><tr><td></td><td>BioRad</td><td>DNA Engine</td><td>Zur Amplifikation einzigartiger Tags aus dem Ein- und Ausgang des genomischen</td></tr><tr><td>DNA-Hybridisierungsofens</td><td>Labnet</td><td>Problot 12S</td><td>Für die Hybridisierung&nbsp;</td></tr><tr><td>PhosphorImager</td><td>Fujifilm</td><td>FLA-9000</td><td>Zum Scannen von hybridisierten Membranen</td></tr><tr><td>Thermomixer</td><td>Eppendorf</td><td>Thermomixer Comfort</td><td>Zur Denaturierung von radioaktiv markierten Signatur-Tags</td></tr><tr><td>Gel-Dokumentationseinheit</td><td>Alphainnontech</td><td>Alphaimager</td><td>Zur Visualisierung von Ethidiumbromid-gefärbter DNA in Agarose-Gelen</td></tr></tbody></table>

einrichtung einer<em&gt; in-vitro-</em&gt; system zur intrazelluläre verhalten der studie<em&gt; candida glabrata</em&gt; menschen thp-1-makrophagen

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

Eine Zellkultur-Modellsystem, wenn ein enger Mimik von Host-Umweltbedingungen können als preiswerte, reproduzierbare und leicht manipulierbare Alternative zu Tiermodellsysteme für die Untersuchung von einem bestimmten Schritt der mikrobielle Erreger der Infektion dienen. Eine menschliche Monozyten-Zelllinie THP-1, welche bei Phorbolester-Behandlung wird in Makrophagen unterscheiden, wurde bereits früher verwendet, um die Virulenz Strategien vieler intrazelluläre Erreger wie Mycobacterium tuberculosis studieren. Hier ein Protokoll, ein in vitro Zellkulturmodell zu erlassen diskutieren wir System mit THP-1 Makrophagen, um die Wechselwirkung eines opportunistischen Pathogens menschlichen Hefe Candida glabrata mit Host phagozytischen Zellen abzugrenzen. Dieses Modellsystem ist einfach, schnell, offen für Hochdurchsatz-Mutante Bildschirme, und erfordert keine hoch entwickelten Geräten. Eine typische THP-1-Makrophagen-Infektionsversuch dauert ca. 24 Stunden mit einer zusätzlichen Stunde 24-48 wiederhergestellt intrazellulären ermöglichenHefe auf reichen Medium für koloniebildende Einheit-basierte Analyse Rentabilität wachsen. Wie andere in-vitro-Modellsysteme, ist eine mögliche Einschränkung dieses Ansatzes Schwierigkeiten bei Extrapolation der zu einer sehr komplexen Immunzellschaltkreis in den menschlichen Wirt vorhandenen erzielten Ergebnisse. Trotz dieser, ist jedoch die aktuelle Protokoll sehr nützlich, um die Strategien, die eine Pilzerreger verwenden kann, zu umgehen / entgegenzuwirken antimikrobielle Reaktion und zu überleben, anzupassen, und vermehren sich in den nährstoffarmen Umfeld von Wirtsimmunzellen aufzuklären.

Infektion Analysen von PMA-behandelten THP-1 Makrophagen, die mit C. glabrata Wildtyp (wt)-Zellen ergab, dass Gew. Zellen durch Makrophagen mit einer Rate von 55-65% nach 2 h Koinkubation phagozytiert. Weitere, C. glabrata Zellen konnten Tötung von THP-1-Makrophagen wider und unterzog sich einer moderaten 5 - bis 7-fachen Anstieg der KBE nach 24 h Kokultur mit THP-1-Makrophagen 8. Intrazelluläre Replikation von Wildtyp-Zellen, transformiert mit GFP-exprimierenden Plasmid, i...

Der aktuelle Artikel beschreibt ein Protokoll, um eine In-vitro-Zellkultur-Modellsystem, um die Interaktion einer fakultativ intrazellulären Humanfunguspathogen Candida glabrata mit menschlichen Makrophagen, die ein nützliches Werkzeug, um unser Wissen von Pilz Virulenzmechanismen voranzubringen studieren zu etablieren.

Einrichtung einer<em&gt; In-vitro-</em&gt; System zur intrazelluläre Verhalten der Studie<em&gt; Candida glabrata</em&gt; Menschen THP-1-Makrophagen

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, ein In-vitro-Kulturmodell zu etablieren, um das intrazelluläre Verhalten eines humanen opportunistischen Pilzpathogens, Candida labratta, in Makrophagen zu untersuchen, die aus der humanen monozytären Zelllinie TP1 stammen. Zu diesem Zweck werden zunächst THP1-Monozyten mit vier Ester behandelt, um sie in Makrophagen zu differenzieren.Anschließend werden THP-1-Makrophagen mit Candida-GTA-Zellen infiziert, zwei Stunden nach der Infektion. Nicht phagozytierte Candida-GTA-Zellen werden durch PBS-Spülungen entfernt, und intrazelluläre Zellen werden durch Osmolyse der infizierten Makrophagen für weitere Untersuchungen gewonnen. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um sowohl die Aufnahme von Candida-GTA-Zellen in Makrophagen als auch die Phagozytosenreifung sowie die Zytokinantwort in THP-1-Makrophagen nach Candida-GTA-Infektion zu bewerten.Außerdem kann dieses Protokoll hochskaliert werden, um die Candida-Collaborator-Mutantenbibliothek auf veränderte Überlebensprofile in TSP-einschließenden Makrophagen in halb-hochdurchsatztechnischer Weise zu screenen. Der Hauptvorteil dieses Protokolls liegt darin, dass es relativ kostengünst

establishment-an-vitro-system-to-study-intracellular-behavior-candida

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Source: Montefusco-Pereira, C. V. et al. P. aeruginosa Infected 3D Co-Culture of Bronchial Epithelial Cells and Macrophages at Air-Liquid Interface for Preclinical Evaluation of Anti-Infectives. J. Vis. Exp.(2020)This video demonstrates a co-culture model of bronchial epithelial cells and macrophage-like cells at the air-liquid interface to study host-pathogen interactions. Pathogenic bacterial infection compromises epithelial membrane integrity, triggering macrophage-like cell activation and...

Establishing a Co-Culture Model to Study Host-Pathogen Interactions at the Air-Liquid Interface

Source: Lê-Bury, G., et al. Phagosome Migration and Velocity Measured in Live Primary Human Macrophages Infected with HIV-1. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates live confocal imaging of HIV-1-infected human macrophages to visualize and quantify phagosome migration using GFP fluorescence and bright field tracking, providing insights into how HIV alters intracellular trafficking during Fc receptor–mediated phagocytosis.

Live Imaging of Phagosome Migration in HIV-1-Infected Human Macrophages

In diesem Video führen wir den mikroglialen Phagozytose-Assay für Neuroblastome mit induzierten pluripotenten Stammzellen durch. Der Assay hilft bei der Beurteilung der Beeinträchtigung der Mikrogliafunktion bei neurodegenerativen Erkrankungen.

Mikroglia-Phagozytose-Assay: Ein In-vitro-Assay zur Etablierung eines Mikroglia-Phagozytose-Modells für Neuroblastomzellen unter Verwendung von iPSC-Makrophagen

In diesem Video demonstrieren wir den Efferozytose-Assay, um die Clearance apoptotischer Zellen mittels konfokaler Mikroskopie zu untersuchen. Die Efferozytose ist ein mehrstufiger Prozess, bei dem apoptotische Zellen von Fresszellen verschlungen und in Vesikel, den sogenannten Efferosomen, abgebaut werden. Dieses Protokoll bietet eine Methode zur Visualisierung internalisierter und nicht-internalisierter Teile einzelner apoptotischer Zellen und zur Quantifizierung der Efferozytose.

Fixierter Zell-Efferozytose-Assay: Eine Methode zur Untersuchung der efferozytären Aufnahme apoptotischer Zellen durch Makrophagen mittels Fluoreszenzmikroskopie

Dieses Video zeigt einen Assay zur Quantifizierung des intrazellulären Wachstums von Parasiten in aus dem Knochenmark stammenden Makrophagen (BMMs). Die Makrophagenzellen sind mit den beweglichen und nicht-beweglichen invasiven Stadien der Leishmanien, metazyklischen Promastigoten bzw. Amastigoten infiziert. Die Parasiten dringen in die Makrophagen ein, werden in einer parasitophoren Vakuole internalisiert und vermehren sich im Inneren. Das intrazelluläre Parasitenwachstum wird unter Verwendung...

Ein in vitro Assay zur Quantifizierung des intrazellulären Wachstums von Parasiten in Makrophagen

Live-cell Video Mikroskopie Pilzpathogenentwicklung Phagozytose

Efferocytosis, die phagocytic Entfernung der Apoptotic Zellen ist erforderlich, um die Homöostase und wird erleichtert durch die Rezeptoren und Signalwege, die für die Anerkennung, Engulfment und Internalisierung der Apoptotic Zellen ermöglichen. Hier präsentieren wir ein Fluoreszenz-Mikroskopie-Protokoll für die Quantifizierung des Efferocytosis und die Aktivität der Efferocytic Signalwege.

Quantifizierung der Efferocytosis durch einzellige Fluoreszenz-Mikroskopie

Hier wird ein Protokoll zum Nachweis der Produktion extrazellulärer Makrophagen (MET) in der Lebendzellkultur mittels Mikroskopie und Fluoreszenzfärbung vorgestellt. Dieses Protokoll kann weiter erweitert werden, um spezifische MET-Proteinmarker durch Immunfluoreszenzfärbung zu untersuchen.

In Vitro Stimulation und Visualisierung der extrazellulären Trap-Freisetzung in differenzierten menschlichen Monozyten-abgeleiteten Makrophagen

Der Mechanismus, der mit Phagozytose bei Leishmanien-Infektionen verbunden ist, ist noch wenig verstanden. Hier beschreiben wir Methoden, um die frühen Ereignisse zu bewerten, die während der Leishmania-Interaktion mit den Wirtszellen auftreten.

Untersuchung der Phagozytose der Leishmanie mittels konfokaler Mikroskopie

Die Technik der Phagozytose von Pilzkonidien durch Makrophagen wird häufig für Studien verwendet, die die Modulation der Immunantwort gegen Pilze untersuchen. Der Zweck dieses Manuskripts ist es, eine Methode zur Bewertung der Phagozytose- und Clearance-Fähigkeiten von mononuklearen Makrophagen aus humanem peripherem Blut vorzustellen, die mit Trichoderma stromaticum conidia stimuliert wurden.

Viabilitätstest von Trichoderma stromaticum-Konidien in mononuklear gewonnenen Makrophagen des menschlichen peripheren Blutes

Monozyten und Makrophagen sind sehr plastische und reprogrammierbare Immunzellen, die für Gesundheit und Krankheit entscheidend sind. Sie spüren und reagieren auf ein breites Spektrum von Reizen, indem sie spezifische Differenzierungsprogramme und Phänotypen übernehmen. Wir haben ein In-vitro-Modell standardisiert, um die Polarisation und Reprogrammierung von Makrophagen zu untersuchen, was ein wertvolles Werkzeug für die Forschung darstellt.

Reprogrammierungsmodell von humanen Monozyten-abgeleiteten Makrophagen für In-vitro-Assays

Erfahren Sie, wie Sie ein In-vitro-Modell zur Untersuchung des intrazellulären Verhaltens von Candida glabrata in menschlichen THP-1-Makrophagen etablieren. Diese Methode ermöglicht die Analyse von Virulenzmechanismen und Immunantworten.

Einrichtung einer

Weitere Videos entdecken