Quantitative In-vitro- Assay auf Neutrophile Haftung auf Aktiviert primären humanen mikrovaskulären Endothelzellen unter statischen Bedingungen messen

Neutrophile Einhaltung der aktivierten Endothel an den Standorten der Infektion ist ein integraler Bestandteil des Gastgebers Entzündungsreaktion. Beschrieben in diesem Bericht ist ein neutrophilen Bindungs-Assay, die für das erlaubt

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, das Ausmaß der mikrovaskulären Endothelzell-Entzündungsaktivierung zu bestimmen, indem die relative Anzahl der Neutrophilen, die in vitro unter statischen Bedingungen an den Endothelzellen haften, quantifiziert wird. Dies wird erreicht, indem im zweiten Schritt zunächst gesunde konfluente Monoschichten mikrovaskulärer Endothelzellen mit dem gewünschten experimentellen Stimulus behandelt werden. Neutrophile von gesunden menschlichen Freiwilligen werden isoliert und dann mit Calcium am markiert.

Als nächstes werden die markierten Neutrophilen zu den Endothelzellen hinzugefügt und 20 Minuten lang adhäsieren gelassen, wobei während dieser Zeit eine Vorwaschmessung mit Hilfe der Fluoreszenzspektrogeometrie durchgeführt wird. Im letzten Schritt werden die nicht adhärenten Neutrophilen weggespült, woraufhin eine Nachwaschmessung durchgeführt wird. Letztendlich kann der Prozentsatz und die relative Adhärenz der Calcium-markierten Neutrophilen an den Endothelzell-Monolayern unter jeder Behandlungsbedingung bestimmt werden.

Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen auf dem Gebiet der menschlichen Entzündungsbiologie zu beantworten, da sie das relative Ausmaß der mikrovaskulären endothelialen Entzündungsaktivierung unter verschiedenen Bedingungen bestimmen kann. Darüber hinaus hat dieser Assay das Potenzial, als Werkzeug zur Untersuchung von endothelbasierten Krankheitsprozessen beim Menschen verwendet zu werden, die eine Bindung von Leukozyten an das mikrovaskuläre Endothel am Tag des Assays beinhalten. Verwenden Sie die Phasenkontrastmikroskopie, um zu bestätigen, dass die Zellen ein gesundes Kopfsteinpflaster-Aussehen mit wenig Zelltrümmern aufweisen und zu 100 % zusammenfließen.

Sobald die HM VEC-Monoschichten für die Behandlung bereit sind, waschen Sie die Zellen einmal mit HBSS und geben Sie dann 0,3 Milliliter frisches mikrovaskuläres Endothelzellwachstumsmedium mit oder ohne Entzündungsagonisten in die entsprechenden Vertiefungen. Hier wird die HM VEC-Lunge drei Stunden lang mit TNF alpha behandelt, um Neutrophile zu isolieren. Zuerst wird die Dichtegradientenlösung mit Hilfe der Polymorph-Vorbereitung auf Raumtemperatur gebracht. Nach der Entnahme von 30 Millilitern Vollblut von einem gesunden menschlichen Freiwilligen in Gegenwart einer Antikoagulansschicht werden fünf Milliliter des Blutes über fünf Milliliter des Polymorphs in einem konischen 15-Milliliter-Röhrchen vorbereitet.

Trennen Sie das Vollblut 30 Minuten lang bei 450 Mal G und 18 bis 22 Grad Celsius mit dem Abbruch, wobei Sie darauf achten, dass die Schläuche gut ausbalanciert sind. Aspirieren Sie dann das gelbe Plasma und die PBMC-haltigen Schichten, um eine Kontamination der undurchsichtigen rosa neutrophilen Schicht zu verhindern. Um die Neutrophilen zu entfernen, aspirieren Sie die Neutrophilenschicht mit einer serologischen Pipette von ein bis zwei Millilitern, während Sie die Pipette und das Röhrchen langsam drehen.

Ziehen Sie die Neutrophilen aus mehreren Röhrchen in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen, das 30 Milliliter kalzium- und magnesiumfreies PBS enthält. Bringen Sie das Volumen auf 50 Milliliter mit mehr calcium- und magnesiumfreiem PBS. Nachdem Sie die Zellen heruntergeschleudert haben, aspirieren Sie die Schlinge und reanimation anschließend.

Suspendieren Sie die Neutrophilen in acht Millilitern sterilem Wasser, um nach 30 Sekunden rote Blutkörperchen zu läusieren. Geben Sie die acht Milliliter Zellsuspension schnell zu zwei Millilitern mit fünf x calcium- und magnesiumfreiem PBS und mischen Sie es dann sanft. Nachdem Sie die Zellen wieder heruntergeschleudert haben, waschen Sie die Zellen einmal in calcium- und magnesiumfreiem PBS, resuspendieren Sie das Pellet in 10 Millilitern RPMI 1640 ohne Phenolrot und zählen Sie die lebenden Zellen durch Trianblau-Ausschluss.

Nach der Zählung werden die resuspendierten Zellen in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen überführt und die Neutrophilen mit zwei bis 4 Millionen Zellen pro Milliliter mit phenolrotfreiem RPMI 1640 verdünnt. Geben Sie dann frisch zubereitetes Calcium in Arbeitslösung in einer Konzentration von drei Mikromolaren in die Zellen. Mischen Sie die Zellsuspension, indem Sie das Röhrchen mehrmals vorsichtig umdrehen und dann das mit Folie bedeckte Röhrchen bei 37 Grad Celsius inkubieren.

Nach 30 Minuten zentrifugieren Sie die markierten Neutrophilen und waschen Sie das Pellet dann zweimal in 10 Millilitern bei 37 Grad Celsius. Phenolrotfreies RPMI 1640, das die Zellsuspension durch einen 40-Mikron-Sterilfilter leitet, um vor der zweiten Zentrifugation alle Klumpen zu entfernen. Resuspendieren Sie die Neutrophilen in 10 Millilitern bei 37 Grad Celsius.

Phenolrotfrei RP MI 1640. Und nachdem Sie die Zellen noch einmal gezählt haben, verdünnen Sie sie auf 2 Millionen Zellen pro Milliliter. Waschen Sie nun die HM vec Monolayer dreimal mit 0,5 Millilitern 0,22 Mikron Filter, sterilisiertem phenolrotfreiem RPMI 1640 mit 3%BSA pro Vertiefung nach dem dritten Waschgang, saugen Sie das Medium an und fügen Sie 600.000 kalziummarkierte Neutrophile in 0,3 Millilitern Zellsuspension oder 0,3 Milliliter phenolrotfreies RPMI 1640 ohne Neutrophile in die entsprechenden Vertiefungen der 48-Well-Platte hinzu. Inkubieren Sie die Co-Kulturen für 20 Minuten bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid und dann kurz vor Ende der Inkubationszeit messen Sie die Fluoreszenzintensität jeder Vertiefung in einem Spektralphotometer bei einer Anregungswellenlänge von 485 Nanometern und einer Emissionswellenlänge von 520 Nanometern.

Drehen Sie dann die Platte um, um das Medium zu entfernen, und polstern Sie sie vorsichtig auf Papiertücher, um die restliche Flüssigkeit zu entfernen. Waschen Sie die Vertiefungen, die die hm ve-Monolagen und Neutrophilen enthalten, fünfmal mit 0,5 Millimetern PBS pro Vertiefung mit Calcium und Magnesium. Entfernen Sie das PBS jedes Mal auf die gleiche Weise.

Frischen Sie die Vertiefungen mit 0,3 Millilitern phenolrotfreiem RPMI 1640 pro Vertiefung auf und messen Sie dann die Fluoreszenzintensität jeder Vertiefung, wie gerade gezeigt. Schließlich ist es wichtig, dass die Gesundheit und die Kofluenz der mikrovaskulären Endothelzellen am Tag des Assays am Tag des Assays optimal sind, um mit diesen Formeln die prozentuale Adhärenz und die relative Adhärenz pro Vertiefung zu bestimmen. Um zuverlässige reproduzierbare Ergebnisse mit einem Neutrophilenbindungsassay zu erhalten, ist es wichtig, dass die Gesundheit und Kofluenz der mikrovaskulären Endothelzellen am Tag des Assays optimal sind. Beachten Sie das Kopfsteinpflaster-Aussehen und die vollständige Kofluenz der Monoschichten auf einem Fluorstern-Optima-Spektralphotometer.

Beachten Sie beispielsweise, dass die Fluoreszenz OD 520 Nanometer im linearen Bereich liegt, wenn 10.000 bis 1 Million markierte Neutrophile analysiert werden. Interessanterweise nimmt die prozentuale Adhärenz zu, wenn mehr Neutrophile zu HM VEC-Lungenmonoschichten hinzugefügt werden, die mit einem Entzündungsagonisten behandelt wurden. Es wurde bereits gezeigt, dass die P38-Map-Kinase für die Expression von e-Selektin notwendig ist.

In TNF alpha-behandelten menschlichen Endothelzellen reduziert seine Hemmung die Anzahl der adhärenten Neutrophilen, um zu zeigen, dass die Anzahl der Neutrophilen, die den Vertiefungen hinzugefügt werden, willkürlich ist, solange die Anzahl der verwendeten Zellen innerhalb des linearen Bereichs des Spektralphotometers liegt. Hier wird ein Neutrophilen-Adhäsionsassay mit TN F alpha behandelten HM VEC Lungenzellen in Abwesenheit oder Anwesenheit des P 38 map Kinase-Inhibitors B IRB 7 96 gezeigt. Diese Ergebnisse zeigen, dass die relative Abnahme der Neutrophilenbindung nach P 38 mapk-Hemmung ähnlich ist.

Unabhängig von der Anzahl der Neutrophilen pro Vertiefung wird Lektin nach der Behandlung mit TNF alpha auf der Endothelzelloberfläche exprimiert und fängt Neutrophile aus dem Gefäßsystem über elektrostatische Wechselwirkungen mit Glykomolekülen ein, die auf der Neutrophilenoberfläche vorhanden sind. Wie in dieser Grafik gezeigt, führt die Vorinkubation der TNF-alpha-aktivierten Endothelzellen mit einem Antikörper gegen E-Selektin zu einer Verringerung ihrer Fähigkeit, Neutrophile zu binden, um etwa 75%. Um zu zeigen, dass dieser Assay in erster Linie die allerersten Ereignisse der Neutrophilen-Adhäsionskaskade in diesen Bildern bewertet, wurden Calcium-markierte Neutrophile, die an unbehandelte und TN ffat-behandelte HM VEC-Lungenmonoschichten gebunden waren, entweder mit Kontroll-IgG oder E-Selektin vorinkubiert.

Polyklonale Antikörper werden in dieser Spalte gezeigt, Bilder der Lichtmikroskopie sind in dieser Spalte zu sehen, während Fluoreszenzbilder des gleichen Referenzfeldes mit einem Fluoreszein-Filterset hier in diesen Vertiefungen zu finden sind. Repräsentative Bilder der gesamten neutrophilen Fluoreszenz vor dem Waschen mit PBS, wie gerade gezeigt, sind in diesen Vertiefungen zu sehen. Gezeigt werden repräsentative Bilder der adhärenten Fluoreszenz von Neutrophilen nach dem Waschen mit PBS, wie gerade gezeigt.

Beachten Sie, dass die Zunahme der Adhärenz nach TN FFA-Behandlung in Gegenwart des polyklonalen S-Selektin-Antikörpers reduziert ist. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, gesunde Endothelzellen mit niedriger Passagezahl zu verwenden und das Vollblut und isolierte Neutrophile innerhalb von zwei Stunden nach der Entnahme zu verwenden.