Name: Quantitative In-vitro- Assay auf Neutrophile Haftung auf Aktiviert primären humanen mikrovaskulären Endothelzellen unter statischen Bedingungen messen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-23T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 22 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie die Neutrophilenhaftung an aktivierten primären humanen mikrovaskulären Endothelzellen unter statischen Bedingungen quantitativ messen. Diese Methode nutzt Fluoreszenzspektrometrie zur Analyse entzündlicher Reaktionen.

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Diese Arbeit wurde von der UCSF Abteilung Anästhesie und perioperative Pflege unterstützt.

1. Plating und Wartung von mikrovaskulären Endothelzellen <ol><li> Auftauen und das Wachstum Ihres mikrovaskulären Endothelzellen nach den Herstellern mitgelieferten Anleitung. In diesem Protokoll wurden die Zellen in EGM-2 MV Medien (Lonza) gewachsen, und es wird empfohlen, dass alle Versuche innerhalb von zwei Wochen nach dem Auftauen eine Variation aufgrund Durchgang Nummer minimieren durchgeführt werden. Unsere Experimente mit HMVEC-Lung zwischen Passagen 4 bis 9 durchgeführt. </li><li> Tag 1: Wenn die Zellen 80-90% Konfluenz erreichen, trypsinize und resuspendieren bei 120.000 Zellen pro ml. Teller 36.000 Zellen (0,3 ml) pro Well in 48-Well-, Polystyrol Gewebekulturplatte (n). Fügen Vertiefungen HMVEC die nicht mit Neutrophilen inkubiert werden, um eine Ablesung zu erhalten Hintergrundfluoreszenz. Es sei denn, bei der 48-Well-Platten speziell für Fluoreszenz-Assays, alternierenden Reihen oder Spalten entworfen wird minimieren Licht Kontamination von benachbarten Brunnen. HINWEIS: Wells kann vorher mit Poly-Lysine, Kollagen oder Fibronektin. </li><li> Tag 2: In frischem Medium. </li><li> 3. Tag: Nach Phasenkontrast-Mikroskopie, bestätigen die Zellen gesund sind (dh &quot;Kopfsteinpflaster&quot; Aussehen und wenig Zelltrümmer), und sie sind zu 100% konfluent (Abbildung 1). Wenn die Zellen nicht zu 100% konfluent, verändern die Medien jeden Tag, bis sie bereit sind. </li><li> Sobald die HMVEC Monoschichten bereit für die Behandlung sind, waschen Sie die Zellen einmal mit ausgewogener Hank-Salzlösung (HBSS) und fügen Sie 0,3 ml frisches EGM-2 MV Medien oder Medien, die entzündliche Agonisten in die entsprechenden Vertiefungen. In diesem Protokoll die HMVEC-Lung wurden mit TNF behandelt [100 ng / ml] (PeproTech, New Jersey) für 3 Stunden, da dies eine gut beschriebene Aktivator des ECs 21. HINWEIS: Es wird empfohlen, dass Sie Zeit Ihres Experiments, so dass Ihre aktivierten HMVEC Zellen (Schritt 4.1) und Calcein markierten Neutrophilen (Schritt 3.5) Uhr bereit sind, in der gleichen Zeit zu verwenden. Es führt uns ca. 2,5 Stunden zu isolieren und zu beschriften neutrophils. </li></ol> 2. Neutrophile Isolation mit Polymorphprep <ol><li> Isolieren Neutrophilen, wie zuvor beschrieben 22, oder mit einem ready-made Dichtegradientenlösung zu polymorphkernigen Granulozyten aus Vollblut zu isolieren. Der Einsatz Polymorphprep nach dem Protokoll von Nuzzi ea 2007 Ergebnisse in Ausbeuten von ca. 2-3 x 10 6 Neutrophile pro ml Vollblut 23. Hinweis: Um eine übermäßige Erythrozyten-Lyse, ein Dextran Sedimentation zu vermeiden, um rote Blutkörperchen zu entfernen, kann vor Dichtegradientenzentrifugation 24 durchgeführt werden. </li><li> Bringen Sie die Polymorphprep Dichtegradientenlösung auf RT. </li><li> Sammeln 30 ml Vollblut eines gesunden menschlichen Freiwilligen in Gegenwart eines Antikoagulans wie Heparin, Citrat oder EDTA. Das Blut sollte innerhalb von 2 Stunden verwendet werden, und hielt zwischen 18-22 ° C. </li><li> Schicht 5 ml Vollblut in 5 ml der Dichtegradient-Lösung in einem 15 ml konischen Röhrchen (Abbildung 2A). Vermeiden Änderung Volumina von Blut und die Dichtegradientenlösung da dies die anschließende Zentrifugation Bedingungen ändern kann. </li><li> Zentrifugation bei 450 × g für 30 min bei 18-22 ° C. Vergewissern Sie sich, langsam zu beschleunigen und auf der Zentrifuge (dh schalten Sie die Zentrifuge Bremse), und das Gleichgewicht der Rohre gut um Vibrationen zu vermeiden zu helfen, reduzieren die Aktivierung der Neutrophilen und verhindern, dass die Vermischung der Schichten. Längere Zentrifugationszeiten oder höher Zentrifugalkraft wird in der unteren Schicht Leukozyten, die neutrophilen Granulozyten enthält führen, um weiter nach unten wandern in Richtung zu den pelletierten roten Blutkörperchen. </li><li> Absaugen des Plasmas und oberen Leukozyten enthaltende Bande PBMCs die Kontamination der Schicht, die Neutrophilen (2B) zu verhindern. </li><li> Verwenden Sie einen 1-2 ml serologische Pipette, um die untere Schicht, die Neutrophile Leukozyten zu entfernen. Kombinieren der Neutrophilen-Schichten in 30 ml PBS (ohne Ca 2 + und Mg 2 +) in einem 50 mlkonischen Rohr. </li><li> Bringen Sie die Lautstärke von bis zu 50 ml mit PBS (ohne Ca 2 + und Mg 2 +) und Zentrifuge bei 450 g für 10 min bei 18-22 ° C. </li></ol> Hinweis: Die Schritte 2.9 und 2.10 sind optional, aber sehr zu empfehlen. <ol start="9"><li> Saugen Sie den Überstand. Resuspendieren der Neutrophilen in 8 ml sterilem Wasser für 30 Sekunden, um rote Blutkörperchen zu lysieren, sofort fügen Sie die Zellsuspension in 2 ml 5x PBS (ohne Ca 2 + und Mg 2 +) und vorsichtig von Hand mischen. NICHT inkubieren Zellen in Wasser für mehr als 30 Sekunden da erhebliche Neutrophilen Tod auftreten können. </li><li> Zentrifugation bei 250 × g für 5 min bei 18-22 ° C. </li><li> Die Zellen werden einmal mit 10 ml PBS (ohne Ca 2 + und Mg 2 +) und erneut zentrifugiert bei 250 × g für 5 min bei 18-22 ° C. </li><li> Resuspendieren der Neutrophilen in 10 ml RPMI-1640 (ohne Phenolrot) und zählen die lebenden Zellen unter Verwendung des TrypanblauFärbeausschlussverfahren Verfahren. Vermeiden längere Zelldichten größer als 5 x 10 6 pro ml, da dies zu einer Aktivierung der Neutrophilen führen kann. </li></ol> 3. Neutrophile Labeling mit Calcein AM <ol><li> 6 x 10 5 Neutrophilen pro Vertiefung einer 48-Well-Platte verwendet. </li><li> Nach dem Zählen, übertragen Sie die resuspendierten Zellen in eine 50 ml konischen Röhrchen und verdünnen die Neutrophilen auf 2-4 x 10 6 Zellen pro ml mit Phenolrot-freiem RPMI-1640. </li><li> In Calcein AM Stammlösung bis 3 um (dh 2,98 ul Calcein AM stock (1 mg / ml) pro ml Medium) und gut mischen durch leichtes schnippen die Röhre. Mehr als 5 um Calcein AM wird in Leck aus den Neutrophilen führen. Hinweis: Non-fluoreszierendem Calcein AM wird innerhalb der Zellen durch endogene Esterasen gespalten, um das stark fluoreszierende Molekül Calcein (dh tote Zellen nicht fluoreszieren) zu produzieren. </li><li> Decken Sie die Röhrchen mit Alufolie und Inkubation for 30 min bei 37 ° C im Dunkeln. Hinweis: Längere Inkubationszeiten in mehr Calcein führen freigesetzt aus den Neutrophilen im Laufe der Adhäsionsassay. </li><li> Zentrifugation bei 450 × g für 5 min bei 18-22 ° C und wäscht die Neutrophilen 2x mit 10 ml RPMI-1640 (ohne Phenolrot, vorgewärmt auf 37 ° C). Nach Resuspendieren der Zellen für die zweite waschen, zuerst über die Neutrophilen obwohl eine 40 uM Sterilfilter Klumpen zu entfernen und dann zentrifugiert erneut bei 450 xg für 5 min bei 18-22 ° C. </li><li> Resuspendieren der Neutrophilen in RPMI 1640 (ohne Phenolrot, vorgewärmt auf 37 ° C) mit 2 x 10 6 pro ml Neutrophilen. </li></ol> 4. Neutrophile Binding Assay <ol><li> Waschen Sie die HMVEC Monoschichten 3x mit 0,5 ml steril filtriert (0,22 um) RPMI 1640 (ohne Phenolrot) mit 3% BSA pro Well. </li><li> Saugen Sie die Medien, und fügen Sie 6 x 10 5 Calcein-markierten Neutrophilen (0,3 ml Zellsuspension) Oder 0,3 ml RPMI 1640 (ohne Phenolrot) ohne Neutrophilen, in die entsprechenden Vertiefungen der 48-Well-Platte. Hinweis: Dies ist das Äquivalent von 8 x 10 5 Neutrophilen pro cm 2. </li><li> Inkubation für 20 min bei 37 ° C, 5% CO 2-Inkubator. </li><li> Insgesamt Neutrophile Fluoreszenz (Vorwäsche): Messen Sie die Fluoreszenzintensität jeder Vertiefung mit einer Anregungswellenlänge von 485 nm und einer Emissionswellenlänge von 520 nm (Fluoresceinfilter set) in einem FLUOstar, oder gleichwertig, Spektralphotometer. Diesen Schritt unmittelbar vor der Inkubation Endpunkt Anmerkung: In diesem Protokoll Calcein Anregung und Detektion des emittierten Lichts wurden von der Oberseite der nicht abgedeckten Vertiefungen durchgeführt, aber beide können auch aus dem Boden der Vertiefungen vorgenommen werden.. </li><li> Waschen der Vertiefungen mit HMVEC Monoschichten und Neutrophilen 5x mit 0,5 ml pro Vertiefung von PBS (w / Ca 2 + und Mg 2 +). Entfernen Sie die Medien und Waschungendurch Umdrehen der Platte, und klopfte sanft auf Küchenpapier entfernen Sie die restliche Flüssigkeit. </li><li> In wieder 0,3 ml RPMI 1640 (ohne Phenolrot) pro Vertiefung. </li><li> Adherent Neutrophile Fluoreszenz (POST wash): Messen Sie die Fluoreszenzintensität jedes gut wie in Schritt 4.4. </li><li> Bestimmen Sie die Einhaltung Prozent und relative Einhaltung pro Well: </li></ol> Hinweis: In diesem Stadium, Bilder der Calcein-markierten Neutrophilen kann unter Verwendung eines Fluoreszenz-Mikroskop mit Standard-fähig Fluorescein Filtern ausgestattet, erhalten werden. Die Bilder in Abbildung 4 wurden an einem Olympus IX51 inversen Mikroskop mit einer Kamera Retiga 2000R (Q Imaging) mit Q-Capture-Software Pro7 (Q Imaging) ausgestattet erhalten.

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</ol>

Autoren haben nichts zu offenbaren.

Die wichtigsten Schritte für eine erfolgreiche Neutrophilen / Mikrogefäßendothelzellen Zelladhäsionsassay sind: 1) der niedrigen Passage-Nummer (&lt;9), gesunde Endothelzellen Verwenden; 2) Pflege der isolierten Neutrophilen bei einer geringen Dichte (dh &lt;5 x 10 6 Zellen / ml) und mit ihnen innerhalb von zwei Stunden der Isolation, und 3) Fastidious Waschen der Calcein AM-markierten Neutrophilen und die Nutzung der Calcein AM-markierten Neutrophilen rechtzeitig EG Verschmutzung und Verlust von Cal...

Da das vaskuläre Endothel ist in direktem Kontakt mit dem zirkulierenden Blut wird in ausgezeichneter Lage, eine schnelle Entzündungsreaktion während der Infektion oder Verletzung zu initiieren. Endothelzellen (ECs) express pattern recognition receptors, die eine Vielzahl von konservierten bakteriellen Komponenten und Gefahr Moleküle erkennen und Rezeptoren für Host Entzündungsmediatoren wie TNFa. Die Aktivierung dieser Rezeptoren führt ECs, Zytokine (z. B. IL-6, IL-8, CXCL1 und CCL2) sezernieren, und Adhäsionsmoleküle (zB E / P-Selectin, VCAM-1 und ICAM-1) in ihrer Zelloberfläche 1 hochreguliert , 2. Diese Moleküle alle erleichtern die Lokalisierung von Leukozyten an Stellen der Infektion und Verletzungen, um das Heer der Infektionserreger zu löschen und die Reparatur von Gewebe 3,4 initiieren. Neutrophilen Die Reaktion auf eine Infektion beinhaltet eine gut koordinierte Zusammenspiel zwischen dem vaskulären Endothel und dem antwortenden Neutrophilen. Nach Aktivierung EG, IL-8 abgesondert und bildet einen intravaskulären Gradienten auf das Endothel, die Neutrophilen erlaubt, nach Hause, um den Ort der Infektion oder Verletzung 5,6. E / P-Selektine vermitteln Neutrophilen-Abscheidung und-rollen durch relativ schwache Assoziationen mit glycomolecules auf der neutrophilen Zelloberfläche. Diese Wechselwirkungen, zusammen mit IL-8-Bindung an seinen verwandten Rezeptoren, erleichtern die robust, Integrin-vermittelte Bindung und eventuellen Verhaftung von Neutrophilen am Endothel Zelloberfläche 7-10. Nach Verhaftung kann Neutrophile wandern aus dem Gefäßsystem zu den Austragungsorten der Infektion direkt eliminieren Krankheitserreger erzeugen Neutrophilen extrazellulären Fallen, um die Verbreitung von Krankheitserregern zu verhindern, die Wundheilung fördern und lassen weitere Faktoren, die andere Leukozyten wie Monozyten, Makrophagen und dendritischen rekrutieren Zellen 11-17. Beschrieben in diesem Bericht ist ein in vitro-Methode, um die Einhaltung der neutrophilen MicroV quantifizierenascular ECs nach Aktivierung durch den Host Entzündungsmediatoren TNF. Dieser Test wurde entwickelt, um die Aktivierung von Endothelzellen und nicht für Neutrophile zu bewerten. Primäre humane Neutrophile sind zunächst getrennt mit Dichtegradiententrennung, und werden dann mit Calcein acetoxymethyl (AM) markiert. Esterasen innerhalb der lebenden Zellen hydrolysieren Calcein AM zu stark fluoreszierenden Calcein Molekül mit einer Anregung von 492-495 nm und die Emission von 513-516 nm 18. Die Fluoreszenz-markierten Neutrophilen werden dann mit EC Monoschichten inkubiert und nicht-adhärente Neutrophile werden anschließend entfernt. Die Fluoreszenz der verbleibenden gebundenen Neutrophilen wird dann unter Verwendung eines Fluoreszenz-Spektralphotometer, berechnet und als Prozentsatz der gesamten Neutrophilen Fluoreszenz Eingang pro Vertiefung. Dieses Verfahren hat den zusätzlichen Vorteil, dass die gebundenen Calcein-markierten Neutrophilen in Spektrofotometrie direkt verwendet werden kann, visualisiert mittels Fluoreszenzmikroskopie, um eine qualitative aus EG ac lesen gebenMotivation. Da dieser Test unter statischen Bedingungen durchgeführt wird, werden nur die ersten Ereignisse, die sehr in der neutrophilen Adhäsionskaskade auftreten beurteilt werden. Dies wird in diesem Bericht mit E-Selektin blockierende Antikörper gegen diese Neutrophilen Einhaltung TNF-behandelten menschlichen Lunge mikrovaskulären EC (HMVEC-Lung) Monoschichten wird drastisch reduziert, wenn die Interaktion mit E-Selektin gestört zeigen bestätigt. Neben TNF, haben wir erfolgreich diesen Test verwendet werden, um das Ausmaß der menschlichen Nabelschnur-EC (HUVEC) Aktivierung durch den Toll-like-Rezeptor-1/2-Agonisten peptidoglycan Lipoprotein-assoziierte (PAL), Murein-Lipoprotein (MLP) und Pam3Cys und bestimmen HMVEC-Lung Aktivierung durch Pam3Cys 19,20. Darüber hinaus haben wir erfolgreich verwendet diesen Test mit Kinase-Inhibitoren und nach RNAi-vermittelter Knockdown von Oberfläche und zytoplasmatische Proteine ​​in HMVEC-Lung, was darauf hindeutet, dass diese Methode kompatibel mit einer Vielzahl von biochemischen und ist screening Assays 20. Zusammenfassend stellt dieser Test ein leicht, reproduzierbar, funktioneller Weise zu verwenden, um das Ausmaß der EG-Aktivierung durch Entzündungsmediatoren in vitro zu übersetzen.

<table><tbody><tr><td>HMVEC-Lung</td><td>Lonza</td><td>CC-2527</td><td></td></tr><tr><td>EGM-2 MV</td><td>Lonza</td><td>CC-3202</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Life Technologies</td><td>14175-095</td><td>Kann mit jedem Hersteller ersetzt werden</td></tr><tr><td>48-Well-Gewebekulturplatten</td><td>BD Falcon</td><td>353078</td><td></td></tr><tr><td>PBS (ohne Phenolrot)</td><td>UCSF Cell Culture Facility</td><td>CCFAL001</td><td>Kann mit jedem Anbieter ersetzt werden</td></tr><tr><td>D-PBS (ohne Ca2+ und Mg2+ und Phenolrot)</td><td>UCSF Cell Culture Facility</td><td>CCFAL003</td><td>Kann mit jedem Hersteller</td></tr><tr><td>ersetzt werden RPMI-1640 (ohne Phenolrot)</td><td>Life Technologies</td><td>11835-030</td><td></td></tr><tr><td>Polymorphprep</td><td>Axis-Shield</td><td>1114683</td><td></td></tr><tr><td>Calcein AM</td><td>Life Technologies</td><td>C3099</td> <td>(0,995 mM) Lager soln</td></tr><tr><td>Trypan Blue Lösung</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>40 &mu; M Filter</td><td>VWR</td><td>21008-949</td><td>Kann durch jeden Hersteller ersetzt</td></tr><tr><td>werden FLUOstar OPTIMA Spektralphotometer</td><td>BMG LABTECH</td><td>-</td><td></td></tr></tbody></table>

quantitative<em&gt; in-vitro-</em&gt; assay auf neutrophile haftung auf aktiviert primären humanen mikrovaskulären endothelzellen unter statischen bedingungen messen

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Die vaskuläre Endothel spielt eine wesentliche Rolle bei der entzündlichen Reaktion. In der akuten Phase der Entzündung werden Endothelzellen (ECs) von Host-Vermittler oder direkt durch konservierte mikrobielle Komponenten oder Host-derived Gefahr Moleküle aktiviert. Activated ECs express Zytokine, Chemokine und Adhäsionsmoleküle, mobilisieren, aktivieren und behalten Leukozyten an den Ort der Infektion oder Verletzung. Neutrophile sind die ersten Leukozyten, um anzukommen, und sich an das Endothel durch eine Vielzahl von Adhäsionsmolekülen auf den Oberflächen der beiden Zellen. Die wichtigsten Funktionen von Neutrophilen sind direkt beseitigen mikrobiellen Bedrohungen, die Förderung der Rekrutierung von anderen Leukozyten durch die Freisetzung von zusätzlichen Faktoren, und initiieren Wundheilung. Daher ist die Einstellung und Befestigung des Endothels ein kritischer Schritt in der Einleitung der entzündlichen Reaktion. In diesem Bericht beschreiben wir eine in-vitro-Assay mit neutrophilen AdhäsionCalcein primären humanen Neutrophilen AM-markierten, um das Ausmaß der mikrovaskulären endothelialen Zell-Aktivierung unter statischen Bedingungen zu quantifizieren. Dieses Verfahren hat den zusätzlichen Vorteil, dass die gleichen Proben mittels Fluoreszenz-Spektrophotometrie quantifiziert auch direkt visualisiert werden mittels Fluoreszenzmikroskopie für eine qualitative Bewertung der Neutrophilen-Bindung.

Um eine zuverlässige, reproduzierbare Ergebnisse mit einem Neutrophilen Bindungs-Assay erhalten, ist es wichtig, dass die Gesundheit und das Konfluenz der mikrovaskulären Endothelzellen optimal am Tag des Tests sind, wie bei HMVEC-Lung in Abbildung 1 dargestellt. Darüber hinaus ist es unerlässlich, dass niedrige Durchgang Nummer mikrovaskulären ECs verwendet werden (dh weniger als 9 Stellen), und entsprechend, empfehlen wir die Durchführung aller Experimente innerhalb von zwei Wochen nach dem A...

Neutrophile Einhaltung der aktivierten Endothel an den Standorten der Infektion ist ein integraler Bestandteil des Gastgebers Entzündungsreaktion. Beschrieben in diesem Bericht ist ein neutrophilen Bindungs-Assay, die für das erlaubt<em&gt; In vitro</em&gt; Quantifizierung von primären humanen Neutrophilen-Bindung an Endothelzellen durch Entzündungsmediatoren unter statischen Bedingungen aktiviert.

Quantitative<em&gt; In-vitro-</em&gt; Assay auf Neutrophile Haftung auf Aktiviert primären humanen mikrovaskulären Endothelzellen unter statischen Bedingungen messen

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, das Ausmaß der inflammatorischen Aktivierung von mikrovaskulären endothelialen Zellen zu bestimmen, indem die relative Anzahl von Neutrophilen quantifiziert wird, die unter statischen Bedingungen in vitro an die endothelialen Zellen binden. Dies wird erreicht, indem gesunde konfluente Zellmono-Schichten aus mikrovaskulären endothelialen Zellen im zweiten Schritt zunächst mit dem gewünschten experimentellen Stimulus behandelt werden. Anschließend werden Neutrophile von gesunden menschlichen Probanden isoliert und mit Calcium am. markiert.Anschließend werden die markierten Neutrophilen zu den Endothelzellen gegeben und 20 Minuten lang zur Adhäsion zugelassen, wobei eine Vorwasmessung mittels Fluoreszenzspektrospektrometrie durchgeführt wird. Im letzten Schritt werden die nicht-gebundenen Neutrophilen abgewaschen, woraufhin eine Nachwasmessung erfolgt. Letztendlich kann der prozentuale und relative Adhäsionsgrad der mit Calcium markierten Neutrophilen an die Endothelzell-Mono-Schichten unter jeder Behandlungsbedingung bestimmt werden.Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen auf dem Gebiet der humanen entzündlichen Biologie zu beantworten, da sie das relative Ausmaß der inflammatorischen Aktivierung mikrovaskulärer endothelialer Zellen unter verschiedenen Bedingungen bestimmen kann. Darüber hinaus bietet dieses Assay das Potenzial, als Werkzeug zur Untersuchung humaner endothelialer Erkrankungsprozesse eingesetzt zu werden, an denen die Bindung von Leukozyten an das mikrovaskuläre Endothel beteiligt ist. Am Tag des Assays verwenden Sie die Phasenkontrastmikroskopie, um zu bestätigen, dass die Zellen ein gesundes, gepflastertes Aussehen aufweisen, kaum Zelltrümmer enthalten und zu 100 % konfluent sind.Wenn die HM-VEC-Mono­schichten für die Behand­lung bereit sind, waschen Sie die Zellen ein­mal mit HBSS und geben Sie anschließend 0,3 Milliliter frisches Wachstumsmedium für mikrovaskuläre Endothelzellen mit oder ohne entzündlichen Agonisten in die jeweiligen Vertiefungen. Hier werden die HM-VEC-Lungenzellen drei Stunden lang mit TNF-alpha behandelt, um Neutrophile zu isolieren. Verwenden Sie zunächst Polymorph-Prep, bringen Sie die Dichtegradientenlösung auf Raumtemperatur. Sammeln Sie danach 30 Milliliter Vollblut von einem gesunden menschlichen Freiwilligen in Gegenwart eines Antikoagulans und schichten Sie fünf Milliliter des Blutes vorsichtig auf fünf Milliliter Polymorph-Prep in einem 15-Milliliter-Kon­ischen Rohr ab.Das Vollblut 30 Minuten bei 450 ×g und 18 bis 22 °C unter Ausschaltung des Bremsvorgangs zentrifugieren, wobei sichergestellt werden muss, dass die Röhrchen gut ausbalanciert sind. Anschließend die gelbe Plasmaschicht und die PBMC-haltigen Schichten abpipettieren, um eine Kontamination durch die opake rosa Neutrophilenschicht zu vermeiden. Um die Neutrophilen zu entfernen, wird die Neutrophilenschicht mit einer ein- bis zwei-Milliliter-Serologiepipette abgesaugt, wobei die Pipette und das Röhrchen langsam rotiert werden.Ziehen Sie die Neutrophilen aus mehreren Röhrchen in ein 50-Milliliter-Konischglas, das 30 Milliliter kalzium- und magnesiumfreies PBS enthält. Füllen Sie das Volumen mit zusätzlichem kalzium- und magnesiumfreiem PBS auf 50 Milliliter auf. Nach dem Zentrifugieren der Zellen entfernen Sie den Überstand und resuspendieren dann das Pellet.Suspendieren Sie die Neutrophilen in acht Milliliter steriler Wasser, um rote Blutkörperchen nach 30 Sekunden zu lysieren. Geben Sie schnell die acht Milliliter Zellsuspension zu zwei Milliliter fünfmal konzentrierter, calcium- und magnesiumfreier PBS, gefolgt von vorsichtigem Mischen. Nach dem Zentrifugieren der Zellen waschen Sie diese erneut einmal in calcium- und magnesiumfreier PBS, resuspendieren das Pellet anschließend in 10 Milliliter RPMI 1640 ohne Phenolrot und zählen die lebenden Zellen mittels Trypanblau-Ausschluss.Nach der Zellzählung die resuspendierten Zellen in ein 50-Milliliter-Konischgefäß überführen und die Neutrophilen mit frischem RPMI 1640 ohne Phenolrot auf eine Konzentration von zwei bis vier Millionen Zellen pro Milliliter verdünnen. Anschließend frisch zubereitete Calcium-Am-Arbeitslösung so zugeben, dass eine Endkonzentration von drei Mikromolar erreicht wird. Die Zellsuspension durch vorsichtiges Umstülpen des Gefäßes mehrmals mischen und das Gefäß dann abgedeckt mit Aluminiumfolie bei 37 Grad Celsius inkubieren.Nach 30 Minuten die markierten Neutrophilen zentrifugieren und das Pellet anschließend zwei Mal mit jeweils 10 Milliliter 37 Grad Celsius Phenolrot-freiem RPMI 1640 waschen, wobei die Zellsuspension vor der zweiten Zentrifugation durch einen sterilen 40-Mikron-Filter geleitet wird, um eventuelle Aggregate zu entfernen. Die Neutrophilen in 10 Milliliter 37 Grad Celsius resuspendieren.Phenolrot-freies RP MI 1640. Nach erneuter Zählung der Zellen verdünnen Sie diese anschließend auf 2 Millionen Zellen pro Milliliter. Waschen Sie die HM-vec-Monolagen danach dreimal mit je 0,5 Millilitern 0,22-Mikron-gefiltertem, sterilisiertem, phenolrot-freiem RPMI 1640, das 3 % BSA pro Vertiefung enthält. Nach dem dritten Waschschritt saugen Sie das Medium ab und geben 600.000 mit Calcium markierte Neutrophile in 0,3 Milliliter Zellsuspension beziehungsweise 0,3 Milliliter phenolrot-freies RPMI 1640 ohne Neutrophile in die entsprechenden Vertiefungen der 48-Loch-Platte. Inkubieren Sie die Kokulturen danach 20 Minuten bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid. Unmittelbar vor Ende der Inkubationszeit messen Sie die Fluoreszenzintensität jeder Vertiefung in einem Spektrophotometer bei einer Anregungswellenlänge von 485 Nanometern und einer Emissionswellenlänge von 520 Nanometern.Danach die Platte umdrehen, um das Medium zu entfernen, und vorsichtig auf Papierhandtücher abtupfen, um restliche Flüssigkeit zu entfernen. Die Vertiefungen mit den hm ve-Mono-Schichten und den Neutrophilen fünfmal mit jeweils 0,5 Millimetern pro Vertiefung PBS mit Calcium und Magnesium waschen. Entfernen Sie den PBS dabei jedes Mal auf die gleiche Weise.Ersetzen Sie die Medien in den Vertiefungen durch jeweils 0,3 Milliliter phenolrotfreies RPMI 1640, und messen Sie anschließend die Fluoreszenzintensität jeder Vertiefung, wie zuvor gezeigt. Berechnen Sie abschließend mithilfe dieser Formeln den prozentualen und relativen Bindungsgrad pro Vertiefung. Um zuverlässige und reproduzierbare Ergebnisse mit einem Neutrophilen-Bindungsassay zu erzielen, ist es entscheidend, dass die Gesundheit und Konfluenz der mikrovaskulären endothelialen Zellen am Tag des Assays optimal sind. Beachten Sie das gepflasterte Erscheinungsbild und die vollständige Konfluenz der Monolagen auf einem Fluor star Optima-Spektrophotometer.Beispielsweise ist zu beachten, dass die Fluoreszenz-OD bei 520 Nanometern im linearen Bereich liegt, wenn 10.000 bis 1 Million markierte Neutrophile analysiert werden. Interessanterweise steigt der Prozentsatz der Adhärenz, wenn immer mehr Neutrophile zu HM-VEC-Lungenmonolagen hinzugefügt werden, die mit einem entzündungsfördernden Agonisten behandelt wurden. Es wurde bereits nachgewiesen, dass die p38-MAP-Kinase für die Expression von E-Selectin notwendig ist.In mit TNF-alpha behandelten menschlichen endothelialen Zellen und deren Hemmung verringert sich die Zahl der adhärenten Neutrophilen, um zu zeigen, dass die Anzahl der in die Mulden gegebenen Neutrophilen beliebig ist, solange die verwendete Zellzahl innerhalb des linearen Bereichs des Spektrophotometers liegt. Hier wird ein Neutrophilen-Adhäsionsassay mit TNF-alpha-behandelten HMVEC-Lungenzellen in Abwesenheit oder Gegenwart des p38-MAP-Kinase-Inhibitors BIRB 796 gezeigt. Diese Ergebnisse zeigen, dass die relative Abnahme der Neutrophilenbindung nach p38-MAPK-Hemmung ähnlich ist.Unabhängig von der Anzahl der Neutrophilen pro Mulde wird nach der Behandlung mit TNF-alpha ein Lektin auf der Oberfläche der Endothelzellen exprimiert, das Neutrophile aus der Gefäßbahn über elektrostatische Wechselwirkungen mit Glykomolekülen an der Oberfläche der Neutrophilen bindet. Wie in diesem Diagramm dargestellt, führt die Vorinkubation der mit TNF-alpha aktivierten Endothelzellen mit einem Antikörper gegen E-Selektin zu einer etwa 75 %igen Verringerung ihrer Bindungsfähigkeit für Neutrophile. Dies zeigt, dass dieser Assay hauptsächlich die allerersten Ereignisse der Adhäsionskaskade der Neutrophilen bewertet. In diesen Bildern sind Kalzium-markierte Neutrophile dargestellt, die an unbehandelten und mit TNF-alpha behandelten HMVEC-Lungenmonolagen haften, die zuvor entweder mit kontrolliertem IgG oder mit E-Selektin vorinkubiert wurden.Polyklonale Antikörper sind durch lichtmikroskopische Durchlichtbilder dargestellt, die in dieser Spalte gezeigt werden, während Fluoreszenzbilder desselben Bezugsfeldes unter Verwendung eines Fluorescein-Filter-Satzes hier in diesen Vertiefungen dargestellt sind. Repräsentative Bilder der gesamten Neutrophilen-Fluoreszenz vor dem Waschen mit PBS, wie gerade gezeigt, sind in diesen Vertiefungen abgebildet. Repräsentative Bilder der adhärenten Neutrophilen-Fluoreszenz nach dem Waschen mit PBS, wie gerade gezeigt, sind dargestellt.Hinweis: Die Zunahme der Adhärenz nach TN-FFA-Behandlung, die in Gegenwart eines s-Selectin-Polyklonalen Antikörpers reduziert ist. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, gesunde Endothelzellen mit niedriger Passagezahl zu verwenden und das Vollblut sowie die isolierten Neutrophilen innerhalb von zwei Stunden nach der Entnahme zu nutzen.

quantitative-vitro-assay-to-measure-neutrophil-adhesion-to-activated

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Eine Haftung Frequenz-Assay zur Messung der Rezeptor-Ligand-Wechselwirkung Kinetik, wenn beide Moleküle auf der Oberfläche der interagierenden Zellen verankert sind beschrieben. Diese mechanisch-basierter Assay wird beispielhaft mit einer Mikropipette unter Druck menschlichen roten Blutkörperchen als Haftvermittler Sensor und Integrin αLβ2 und ICAM-1 als interagierende Rezeptoren und Liganden.

Adhesion Frequency-Assay für In Situ Kinetics Analyse der Cross-Junktionaler Molecular Interactions an der Zell-Zell-Schnittstelle

Dieser Artikel beschreibt zunächst ein Verfahren zur Isolierung von humanen Endothelzellen aus Nabelschnur-Venen und zeigt dann, wie man diese Zellen verwenden, um Transmigration neutrophiler unter Strömungsbedingungen zu untersuchen. Durch die Verwendung eines geringen Mengen Strömungskammer aus einem Polymer mit den optischen Eigenschaften des Glases hergestellt ist, ist in lebenden Zellen Fluoreszenz-Bildgebung von seltenen Zellpopulationen möglich.

Isolierung von humanen Nabelschnur-Endothelzellen und ihre Verwendung in der Studie von neutrophilen Transmigration unter Strömungsbedingungen

Source: Claes, J., et al, In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions. J. Vis. Exp. (2015).This video demonstrates a method for studying host-pathogen interactions using a micro-parallel plate flow chamber seeded with human primary endothelial cells. Following endothelial cell activation by an ionophore and perfusion with fluorescently labeled bacteria, the cells release von Willebrand factor (VWF), which binds bacterial adhesins under shear...

Micro-Parallel Plate Flow Chamber Model for Studying Bacterial Adhesion to Human Endothelial Cells

In diesem Video demonstrieren wir einen Assay, der Fluoreszenzmikroskopie verwendet, um die Adhäsion von Krebszellen an neutrophile extrazelluläre Fallen (NETs) nachzuweisen. In den Testvertiefungen gibt es einen bemerkenswerten Anstieg der Anzahl fluoreszenzmarkierter Krebszellen, die an NETs haften, während Wells, die mit DNase behandelt wurden, eine verminderte Adhäsion von Krebszellen an NETs aufweisen.

In-vitro-Adhäsionsassay zum Nachweis der Adhärenz von Krebszellen an extrazellulären Fallen von Neutrophilen

Neutrophile transepitheliale Migration als Reaktion auf eine mukosasale bakterielle Infektion trägt zu Epithelverletzungen und klinischen Erkrankungen bei. Es wurde ein In-vitro-Modell entwickelt, das Erreger, menschliche Neutrophile und polarisierte menschliche Epithelzellschichten kombiniert, die auf Transwell-Filtern angebaut werden, um Untersuchungen zur Entwirrung der molekularen Mechanismen zu erleichtern, die dieses Phänomen orchestrieren.

In vitro Coculture Assay zur Bewertung pathogeninduzierter Neutrophiler Transepithelmigration

Verfahren zum Quantifizieren von Adhäsion von Neutrophilen berichtet. Dieses Verfahren erzeugt eine dynamische Fließumgebung ähnlich der in einem Blutgefäß auftreten. Es erlaubt die Untersuchung der Adhäsion von Neutrophilen an entweder gereinigte Adhäsionsmoleküle (Ligand) oder Endothelzell-Substrat (HUVEC) in einem Rahmen ähnlich der in vivo Umgebung mit Scherbeanspruchung.

Humanen neutrophilen Flusskammer Adhesion Assay

Leukozyten überqueren die endothelialen Monolayer mit Hilfe der parazellulären oder transzelluläre Route. Wir haben einen einfachen Test zu folgen die Verteilung endogener junctional VE-Cadherin und PECAM-1 während Leukozyten transendotheliale Migration unter physiologischen Fluss zwischen den beiden Seelenwege unterscheiden.

Echtzeit-Bildgebung von Zell-Zell-Endothelial Junctions Während Neutrophile Transmigration unter physiologischen Fluss

Wir berichten über eine in vitro Methode, die die Quantifizierung der tatsächlichen Anzahl von Adhäsionszellen innerhalb einer Endothelzell-Monoschicht ermöglicht.

Die Quantifizierung der Endothelial Cell Haftfähigkeit<em&gt; In-vitro-</em

Gefäßendothels steuert dicht Leukozyten Rekrutierung. Unzureichende Leukozyte Extravasation trägt zur entzündlichen Krankheiten des Menschen. Daher ist es notwendig, bessere Therapien für entzündliche Erkrankungen zu entwerfen, auf der Suche nach neuartigen regulatorischen Elemente der endotheliale Aktivierung. Hier beschreiben wir eine umfassende Methodik um neuartige endotheliale Regulatoren zu charakterisieren, die Leukozyten während einer Entzündung des Menschenhandels ändern können.

Screening-Assays zur Charakterisierung neuartiger endothelialer Regulators der entzündlichen Reaktion beteiligt

Leukozyten Interaktion eifrig mit vaskulären Zellen und Blutplättchen nach Schiff Wand Unfall oder während einer Entzündung. Hier beschreiben wir einen unkomplizierten Laminar-Flow-based Assay zur Charakterisierung der molekularen Mechanismen, die die Wechselwirkungen zwischen Leukozyten und ihre zellulären Partner zugrunde liegen.

Laminar-Flow-based Assays, Rekrutierung von Leukozyten auf kultivierten vaskuläre Zellen und adhärenten Thrombozyten zu untersuchen

Dynamische Adhäsion von Immunzellen, die Gefäßwand ist eine Voraussetzung für Darm-Homing. Hier präsentieren wir ein Protokoll für einen funktionellen in Vitro Assay für die Impact-Analyse der Antikörper Anti-Integrin, Chemokine oder andere Faktoren auf die dynamische Zelladhäsion von menschlichen Zellen mit Bearbeit-beschichteten Kapillaren.

Dynamische Adhäsion Assay für die funktionelle Analyse von Anti-Adhäsion Therapien bei chronisch entzündlichen Darmerkrankungen

Erfahren Sie, wie Sie die Neutrophilenhaftung an aktivierten primären humanen mikrovaskulären Endothelzellen unter statischen Bedingungen quantitativ messen. Diese Methode nutzt Fluoreszenzspektrometrie zur Analyse entzündlicher Reaktionen.

Quantitative In-vitro- Assay auf Neutrophile Haftung auf Aktiviert primären humanen mikrovaskulären Endothelzellen unter statischen Bedingungen messen (Video) | JoVE Journal

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