Isolierung von humanen Nabelschnur-Endothelzellen und ihre Verwendung in der Studie von neutrophilen Transmigration unter Strömungsbedingungen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, hochwertige humane endotheliale Zellen zu isolieren und sie zur Untersuchung der Mechanismen zu verwenden, die die Neutrophilen-Transmigration unter Durchflussbedingungen regulieren. Dies wird erreicht, indem zunächst humane Nabelvenenendothelzellen isoliert und aufgebracht werden. Der zweite Schritt besteht darin, die Zellen in IBD-Kammern zu überführen.

Anschließend werden frisch isolierte humane Neutrophile über aktivierte endotheliale Zellen perfundiert, was zur Wälzung, festen Adhäsion und Transmigration der Neutrophilen führt. Der letzte Schritt besteht in der Quantifizierung der Transmigration mittels Videomikroskopie. Letztendlich können fluoreszierende und Hellfeldmikroskopie verwendet werden, um die Transmigration von Neutrophilen über aktivierte endotheliale Zellen zu bewerten.

Die Isolierung von Endothelzellen ist leicht zu beschreiben, aber schwer zu erlernen, teilweise weil Schlüsselschritte die Visualisierung der Nabelschnur erfordern. Aus diesem Grund ist eine visuelle Demonstration dieser Methode entscheidend. Diese Methode wird uns helfen, zentrale Fragen im Entzündungsfeld besser zu verstehen, beispielsweise wie die Rekrutierung von Leukozyten unter Flussbedingungen abläuft und wie sich Endothelzellen unter Flussbedingungen verhalten.

Obwohl diese Methode Einblicke in die Rekrutierung von Neutrophilen während einer Entzündung ermöglichen kann, ist sie ebenfalls auf seltene Leukozytenpopulationen wie natürliche Killerzellen und Eosinophile anwendbar. Gemeinsam mit Ritu Sharma demonstriert Hong Jang, eine Technikerin in meinem Labor, dieses Verfahren. Mindestens eine Stunde vor dem Eingriff präko und inkubieren Sie einen T-75-Flasche mit Gelatine bei 37 Grad Celsius.

Beginnen Sie dann das Verfahren zur Isolierung von Endothelzellen in der laminaren Flusswerkbank, indem Sie mit einer Schere eine Nabelschnur von einer Plazenta abschneiden. Nachdem Sie sterile Handschuhe angezogen haben, untersuchen Sie die Schnur sorgfältig und entsorgen Sie alle Abschnitte, die Blutgerinnsel enthalten oder durch das Abklemmen der Schnur während der Entbindung beschädigt sind. Identifizieren Sie anschließend die beiden Arterien und die einzige Vene, die in der Schnur vorhanden sind.

Als Nächstes wird vorsichtig eine Kanüle mit einem daran befestigten Zwei-Wege-Hahn in ein Ende der Vene eingeführt und anschließend eine Klemme um die Kanüle gelegt, um sie fest zu fixieren. Einer der schwierigsten Teile des Verfahrens ist die Perfusion der Nabelschnur. Um eine erfolgreiche Durchführung sicherzustellen, wird die Nabelschnur mit überschüssigem Puffer durchspült und der Durchfluss beobachtet, bis das Ablaufmedium klar ist.

Spülen Sie die Vene mit Nabelschnurpuffer, bis die Durchflüssung klar ist, und klemmen Sie dann das Ende der Nabelschnur ab. Gelegentlich während der Perfusion wird ein kleines Loch sichtbar, da Ärzte Nabelschnurblut aus der Nabelschnur entnommen haben. In diesen Fällen können Hämostaten verwendet werden, um das Loch zu verschließen, und die Perfusion kann fortgesetzt werden, während Endothelzellen isoliert werden.

Es ist äußerst wichtig, die Kollagenase-Behandlung genau zeitlich zu steuern. Bei zu kurzer Dauer werden nicht genügend endotheliale Zellen gewonnen; bei zu langer Dauer können kontaminierende glatte Muskelzellen auftreten oder Schäden an den endothelialen Zellen entstehen. Anschließend spülen Sie die Vene mit frisch zubereiteter warmer Kollagenaselösung aus.

Schließen Sie den Hahn und inkubieren Sie die Nabelschnur in einem Becher mit warmer Nabelschnur-Pufferlösung. Nach 10 Minuten nehmen Sie die Nabelschnur heraus und massieren sie vorsichtig, um die endothelialen Zellen aus dem Lumen der Vene zu lösen. Leiten Sie die Lösung in ein Reagenzglas, das fünf Milliliter Endothelzell-Medium oder ECM enthält, und spülen Sie die Nabelschnur zweimal mit Nabelschnur-Puffer, um verbleibende Zellen zu entfernen.

Zentrifugieren Sie die Zellen nun 10 Minuten bei 350 × g. Entfernen Sie bei Raumtemperatur den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 10 Milliliter Endothelzell-Medium. Überführen Sie die Zellen in einen mit Gelatine beschichteten T75-Flasche und kultivieren Sie die Endothelzellen über Nacht bei 37 °C und 5 % CO2. Am nächsten Tag schütteln Sie die Flasche vorsichtig, um verbliebene rote Blutkörperchen zu lösen.

Entfernen Sie dann den Überstand und waschen Sie die Endothelzellkultur mit warmer HBSS. Nach dem Entfernen der HBSS versetzen Sie die Zellen mit 10 Milliliter warmer ECM. Untersuchen Sie anschließend die Zellen unter dem Mikroskop, um sicherzustellen, dass die roten Blutkörperchen entfernt wurden, und bewerten Sie den Grad der Konfluenz sowie die Morphologie der Endothelzellen.

Wechseln Sie das Medium weiterhin alle drei Tage, bis die Zellen Konfluenz erreichen. Teilen Sie die Zellen zu diesem Zeitpunkt mithilfe einer Trypsin-EDTA-Lösung und gewinnen Sie die abgelösten Zellen, die in ECM resuspendiert werden.

Schließlich beschichten Sie jede Vertiefung einer IBD-Kammer mit Gelatine. Entfernen Sie die überschüssige Gelatine und geben Sie anschließend 1,5 × 10⁶ pro Milliliter der endothelialen Zellsuspension in jede Vertiefung der Kammer. Beginnen Sie mit der Induktion der Hochregulation der Oberflächenexpression von Adhäsions- und Aktivierungsmolekülen, indem Sie die endothelialen Zellen während ihrer Aktivierung mit einem geeigneten Stimulans inkubieren.

Isolieren Sie Neutrophile aus dem peripheren Blut gesunder menschlicher Probanden durch Dichtezentrifugation gemäß zuvor veröffentlichter Methoden und suspendieren Sie die Zellen anschließend in HBSS mit menschlichem Albumin bei einer Konzentration von 1 × 10⁶ pro Milliliter. Richten Sie nach dem Aufbau des Mikroskops die IBD-Kammer mit den stimulierten endothelialen Zellen an der Tubing des Mikroskops ein. Wählen Sie das 10×-Phasenkontrastobjektiv aus und stellen Sie die Spritzenpumpe so ein, dass sie HBSS unter der gewünschten Scherbelastung ansaugt und den Fluss startet.

Stoppen Sie den Fluss kurz, indem Sie den Dreiweg-Hahn auf der Auslassseite in die Aus-Position drehen und die Zuleitung von HBSS auf isolierte Neutrophile umschalten. Starten Sie den Fluss erneut, indem Sie den Hahn wieder in die Ein-Position drehen. Beginnen Sie dann die Aufzeichnung mit einer an einen DVD-Recorder angeschlossenen CCD-Kamera.

Starten Sie die Stoppuhr. Wenn nach vier Minuten neutrophile Zellen in die Kammer eintreten, wechseln Sie zurück zu HBSS, um die Anheftung neuer neutrophiler Zellen zu verhindern. Falls Daten zu den gesamten Wechselwirkungen, dem Rollen und der festen Adhäsion gewünscht sind, verwenden Sie einen 10x-Phasenkontrast.

Ziel ist es, sechs zufällige Felder zwischen der vierten und fünften Minute jeweils 10 Sekunden lang aufzunehmen. Schließlich wechseln Sie zu einem 40×-Objektiv und nehmen ein einzelnes Blickfeld zum gewünschten Zeitpunkt auf. Nach der Neutrophilen-Perfusion nach 10 Minuten sammeln Sie zwischen fünf und zehn zufälligen Blickfeldern.

Unstimulierte Endothelzellen unterstützen keine Rekrutierung von Neutrophilen. Daher zeigen die folgenden Abbildungen Neutrophile, die mit durch TNF-alpha stimulierten Endothelzellen interagieren. Beachten Sie das adhärierte Neutrophile, wie durch den gelben Pfeil gekennzeichnet, und das transmigrierende Neutrophile, wie durch den weißen Pfeil gekennzeichnet.

Die Neutrophilen-Transmigration kann an Zelljunctionen oder durch die Endothelzellen selbst hindurch erfolgen. Um zwischen diesen beiden Bedingungen zu unterscheiden, wurden die Endothelzellen mit einem anti-VE-Kohärenz-Antikörper markiert. Wie hier in Rot zu sehen ist, wird die Transmigration als parazellulär oder transzellulär eingestuft.

In diesem Modell erfolgt praktisch sämtliche Transmigration parazellulär, wie durch diese Abbildung gezeigt wird, die eine Überlagerung der beiden vorherigen Abbildungen darstellt. In diesem ersten von drei Diagrammen wurden Neutrophilen-Interaktionen mit der Image-J-Software untersucht und gemessen. Beachten Sie, dass signifikant mehr Interaktionen zwischen Neutrophilen und TNF-alpha-aktivierten Endothelzellen stattfanden als zwischen Neutrophilen und kontrollierten, nicht stimulierten Endothelzellen.

Die gesamten interagierenden Zellen wurden wie zuvor als rollende oder festhaftende bzw. transmigrierende Zellen charakterisiert. In den Vertiefungen mit aktivierten Endothelzellen trat nach deren Isolierung signifikant stärkere Neutrophilen-Transmigration auf. Weitere Methoden wie Western Blotting, Echtzeit-PCR und die Messung des endothelialen Widerstands können nach der Entwicklung durchgeführt werden, um zusätzliche Fragestellungen zur Endothelzellbiologie zu beantworten.

Diese Methode wird Forschern auf den Gebieten der Entzündungsforschung und vaskulären Biologie helfen zu verstehen, wie die Rekrutierung von Leukozyten unter Flussbedingungen in einem humanen Modellsystem abläuft. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie humane Nabelvenenendothelzellen isoliert und zur Untersuchung der Neutrophilen-Transmigration unter Flussbedingungen unter Verwendung einer ity-Kammer genutzt werden können.