Isolierung von humanen Nabelschnur-Endothelzellen und ihre Verwendung in der Studie von neutrophilen Transmigration unter Strömungsbedingungen

Dieser Artikel beschreibt zunächst ein Verfahren zur Isolierung von humanen Endothelzellen aus Nabelschnur-Venen und zeigt dann, wie man diese Zellen verwenden, um Transmigration neutrophiler unter Strömungsbedingungen zu untersuchen. Durch die Verwendung eines geringen Mengen Strömungskammer aus einem Polymer mit den optischen Eigenschaften des Glases hergestellt ist, ist in lebenden Zellen Fluoreszenz-Bildgebung von seltenen Zellpopulationen möglich.

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, qualitativ hochwertige humane Endothelzellen zu isolieren und mit ihnen die Mechanismen zu untersuchen, die die Transmigration von Neutrophilen und Unterlaufbedingungen regulieren. Dies wird erreicht, indem zunächst menschliche Endothelzellen der Nabelschnurvene isoliert und plattiert werden. Der zweite Schritt besteht darin, die Zellen in IBD-Kammern aufzuteilen.

Als nächstes werden frisch isolierte humane Neutrophile über aktivierte Endothelzellen reichlich verabreicht, was zu einer festen Adhäsion und Transmigration der Neutrophilen führt. Der letzte Schritt besteht darin, die Transmigration mit Hilfe der Videomikroskopie zu quantifizieren. Letztendlich kann die Fluoreszenz- und Hellfeldmikroskopie verwendet werden, um die Transmigration von Neutrophilen durch aktivierte Endothelzellen zu bewerten.

Die Isolierung von Endothelzellen ist leicht zu beschreiben, aber zum Teil schwer zu erlernen, weil wichtige Schritte die Visualisierung der Nabelschnur erfordern. Aus diesem Grund ist eine visuelle Demonstration dieser Methode von entscheidender Bedeutung. Diese Methode wird uns helfen, Schlüsselfragen im Bereich der Entzündung zu verstehen, wie z.B. wie die Rekrutierung von Leukozyten unter Flussbedingungen erfolgt und wie sich Endothelzellen unter Flussbedingungen besser verhalten. Verstanden.

Diese Methode kann jedoch einen Einblick in die Rekrutierung von Neutrophilen während einer Entzündung geben. Es kann auch auf seltene Leukozytenpopulationen wie natürliche Killerzellen und Eosinophile angewendet werden. Hong Jang, ein Techniker in meinem Labor, demonstriert dieses Verfahren zusammen mit Ritu Sharma Mindestens eine Stunde vor dem Eingriff und inkubiert dann einen T 75-Kolben mit Gelatine bei 37 Grad Celsius.

Beginnen Sie dann mit der Isolierung von Endothelzellen in der Laminar-Flow-Haube, indem Sie mit einer Schere eine Nabelschnur aus einer Plazenta durchtrennen. Untersuchen Sie nach dem Anziehen steriler Handschuhe die Nabelschnur genau und entsorgen Sie alle Teile, die Blutgerinnsel enthalten oder durch die Nabelschnurklemmung während der Entbindung beschädigt wurden. Identifizieren Sie dann die beiden Arterien und die einzelne Vene, die im Rückenmark vorhanden ist.

Führen Sie als Nächstes vorsichtig eine Kanüle mit einem daran befestigten Zwei-Wege-Anschlaghahn in ein Ende der Vene ein und legen Sie dann eine Klemme um die Kanüle, um sie fest in Position zu halten. Einer der kniffligsten Teile des Eingriffs ist die Perfusion der Nabelschnur. Um sicherzustellen, dass dies erfolgreich geschieht, durchbluten Sie das Kabel mit überschüssigem Puffer und beobachten Sie den Durchfluss, bis er frei ist.

Perfundieren Sie die Vene mit einem Nabelschnurpuffer, bis der Durchfluss frei ist, und klemmen Sie dann das Ende der Nabelschnur ein. Gelegentlich kommt während der Durchblutung ein kleines Loch zum Vorschein, weil Ärzte Nabelschnurblut aus der Nabelschnur entnommen haben. In diesen Situationen können Hämostatika verwendet werden, um das Loch zu blockieren, und die Perfusion kann fortgesetzt werden, während Endothelzellen isoliert werden.

Es ist von entscheidender Bedeutung, die Kollagenase-Behandlung genau zu planen. Zu wenig Zeit und zu wenig Endothelzellen werden zu lange entnommen und es kann zu einer Kontamination der glatten Muskelzellen oder einer Schädigung der Endothelzellen kommen. Anschließend durchbluten Sie die Vene mit frisch zubereiteter warmer Kollagenase.

Schließen Sie den Absperrhahn und brüten Sie das Kabel in einem Becherglas mit warmem Nabelschnurpuffer aus. Entfernen Sie nach 10 Minuten die Nabelschnur und massieren Sie sie sanft, um die Endothelzellen aus dem Lumen der Vene zu lösen. Lassen Sie die Lösung in ein Röhrchen mit fünf Millilitern Endothelzellmedium oder EZM ab und spülen Sie das Nabelschnur zweimal mit Nabelschnurpuffer, um alle verbleibenden Zellen zu entfernen.

Schleudern Sie nun die Zellen 10 Minuten lang bei drei 50-fach G.At Raumtemperatur herunter, entfernen Sie den Überstand und suspendieren Sie dann das Pellet wieder. In 10 Millilitern Endothelzellmedium werden die Zellen in den gelatinebeschichteten T 75-Kolben überführt und die Endothelzellen über Nacht bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2 kultiviert. Schütteln Sie den Kolben am nächsten Tag vorsichtig, um alle roten Blutkörperchen zu entfernen.

Entfernen Sie dann den Überstand und waschen Sie die Endothelzellkultur mit warmem HBSS. Nach der Entnahme des HBSS füttern Sie die Zellen mit 10 Millilitern warmer EZM. Untersuchen Sie dann die Zellen unter dem Mikroskop, um sicherzustellen, dass die roten Blutkörperchen entfernt wurden, und um den Grad der Konfluenz und die Morphologie der Endothelzellen zu beurteilen.

Wechseln Sie das Medium weiterhin alle drei Tage, bis die Zellen die Kofluenz erreichen. Zu diesem Zeitpunkt teilen Sie die Zellen mit einer Trypsin- und EDTA-Lösung. Ernten Sie dann die abgelösten Zellen und resuspendieren Sie sie in der EZM.

Zum Schluss bestreichen Sie jede Vertiefung einer IBD-Kammer mit Gelatine. Entfernen Sie die überschüssige Gelatine und fügen Sie dann 1,5 mal 10 zu den sechs pro Milliliter der Endothelzellsuspension in jede Vertiefung der Kammer hinzu. Beginnen Sie mit der Induktion der Hochregulierung der Adhäsions- und Aktivierungsmolekül-Oberflächenexpression, indem Sie die Endothelzellen mit einem geeigneten Stimulans inkubieren, während die Endothelzellen aktiviert werden.

Isolieren Sie Neutrophile aus dem peripheren Blut gesunder menschlicher Probanden durch Dichtezentrifugation, wie zuvor veröffentlicht, und suspendieren Sie die Zellen dann in einer Konzentration von eins mal 10 bis sechs pro Milliliter in HBSS plus humanem Albumin. Befestigen Sie nach dem Aufstellen des Mikroskops die IBD-Kammer mit den stimulierten Endothelzellen an den Schlauch des Mikroskops. Wählen Sie das Objektiv mit 10 x Phasenkontrast und stellen Sie dann die Spritzenpumpe so ein, dass sie sich zurückzieht und den HBSS-Fluss bei der gewünschten Scherspannung beginnt.

Stoppen Sie den Durchfluss kurz, indem Sie den Dreiwege-Absperrhahn auf der Auslassseite in die Aus-Position drehen und die Einlassleitung von HBSS auf isolierte Neutrophile umschalten. Starten Sie den Durchfluss erneut, indem Sie den Absperrhahn wieder in die Ein-Position drehen. Starten Sie dann die Aufnahme mit einer CCD-Kamera, die an einen DVD-Recorder angeschlossen ist.

Starten Sie den Timer. Wenn Neutrophile nach vier Minuten in die Kammer eintreten, schalten Sie wieder auf HBSS um, um das Anheften neuer Neutrophilen zu verhindern. Wenn Daten für das Rollen der Gesamtwechselwirkungen und die feste Haftung gewünscht werden, verwenden Sie einen 10-fachen Phasenkontrast.

Ziel: Sechs zufällige Felder für jeweils 10 Sekunden zwischen der vierten und fünften Minute abbilden. Wechseln Sie schließlich zu einem 40-fach-Objektiv und zeichnen Sie ein einzelnes Sichtfeld zum Zeitpunkt des Interesses auf. Nach der Neutrophilenperfusion nach 10 Minuten werden zwischen fünf und 10 zufällige Sichtfelder gesammelt.

Unstimulierte Endothelzellen unterstützen die Rekrutierung von Neutrophilen nicht. Daher zeigen die folgenden Abbildungen, dass Neutrophile mit TNF alpha-stimulierten Endothelzellen interagieren. Man beachte die adhärenten Neutrophilen, die durch die gelbe Pfeilspitze gekennzeichnet sind, und die transmigrierenden Neutrophilen, die durch die weiße Pfeilspitze gekennzeichnet sind.

Die Transmigration von Neutrophilen kann an Zellverbindungen oder durch die Endothelzellen selbst erfolgen. Um zwischen diesen beiden Erkrankungen zu unterscheiden, wurden Endothelzellen mit einem anti-VE-kohärenten Antikörper markiert. Wie hier in Rot zu sehen, wird die Transmigration als parazellulär oder transzellulär auftretend bewertet.

In diesem Modell ist praktisch jede Transmigration parazellulär, wie diese Abbildung zeigt, die die Überlagerung der beiden vorherigen Abbildungen zeigt. In dieser ersten von drei Grafiken wurden die Wechselwirkungen von Neutrophilen untersucht und mit der Software image J gemessen. Es ist zu beachten, dass signifikant mehr neutrophile Endothelzellinteraktionen zwischen Neutrophilen und TNF-alpha-aktivierten Endothelzellen auftraten als bei den kontrollunstimulierten Endothelzellen.

Die gesamt interagierenden Zellen wurden weiterhin als rollend oder fest adhärent oder transmigrierend charakterisiert. Signifikant mehr Neutrophilentransmigration fand in den Vertiefungen mit aktivierten Endothelzellen nach Isolierung der Endothelzellen statt. Die anderen Methoden wie Western Blotting, Real Time PCR und Endothelresistenz können durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zur Endothelzellbiologie nach der Entwicklung zu beantworten.

Diese Methode wird den Forschern auf dem Gebiet der Entzündungs- und Gefäßbiologie helfen zu verstehen, wie die Leukozytenrekrutierung unter Strömungsbedingungen in einem menschlichen Modellsystem abläuft. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man menschliche Endothelzellen der Nabelschnurvene isoliert und sie verwendet, um die Transmigration von Neutrophilen unter Strömungsbedingungen unter Flussbedingungen unter Verwendung einer Itätskammer zu untersuchen.